甘薯鎂螯合酶IbCHLH基因克隆及表達分析

摘要： CHLH是多功能蛋白，在葉綠素合成途徑和脫落酸（ABA）信號傳導中起重要作用.本文在徐薯29號中克隆了IbCHLH基因，進行了生物信息學分析，并利用熒光定量PCR（q-PCR）技術檢測非生物脅迫和外源激素作用下的表達水平.結果顯示，IbCHLH基因CDS序列全長4 146 bp，編碼1 381個氨基酸，分子質量153.53 kDa;IbCHLH為親水性蛋白，無跨膜結構，絲氨酸（Ser）磷酸化位點最多，推測其活性可能受到磷酸化的調控.系統進化樹分析顯示，甘薯IbCHLH蛋白和I. trifida親緣關系最近，I. triloba次之.干旱脅迫24 h時，IbCHLH表達量最高;外源激素ABA處理24 h內，4 h時IbCHLH表達量達最高.綜上，甘薯IbCHLH基因可能參與了對干旱的抗性調節和ABA的調控.

關鍵詞： 甘薯;鎂螯合酶;IbCHLH;葉綠素;脫落酸（ABA）

中圖分類號： S531文獻標志碼： A doi： 10.3969/j.issn.2095-4298.2024.04..003

〖=HT〗Gene cloning and expression analysis of IbCHLH in sweetpotato

Wang Yao Zhao Lukuan Gao Bingqian Zhou Zhilin Cao Qinghe

（1.Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in" Xuhuai District of Jiangsu，Xuzhou 221131，Jiangsu，China;

2.School of Life Sciences，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，Jiangsu，China）

Abstract： CHLH is a multifunctional protein crucial for chlorophyll synthesis and abscisic acid （ABA） signaling. In this article， the IbCHLH gene was cloned from Xushu 29， a bioinformatics analysis was conducted， and the expression of the gene under abiotic stress conditions and exogenous hormone treatments were detected by employing" q-PCR. The cloned CDS sequence of IbCHLH had a length of" 4 146 bp， which could encode" 1 381 amino acids， and a" molecular mass of 153.53 kDa. IbCHLH protein was a hydrophilic protein without transmembrane structure. Since the protein has the largest number of" Ser phosphorylation sites， it is speculated that its activity was under" phosphorylation mediated regulation. Phylogenetic" analysis revealed that the IbCHLH of sweetpotato ｗａs most closely related to the CHLH protein from I. trifida， followed by I. triloba. IbCHLH expression peaked at 24 h under drought stress and at 4 h" following ABA treatment within a 24 h" period. In conclusion， the IbCHLH gene may engage in drought resistance" regulation and ABA regulation.

Key words： sweetpotato; magnesium chelatase; IbCHLH; chlorophyll; ABA

光合作用對于植物生物量、地下部生長發育起著至關重要的作用［1］.葉綠素（chlorophyll）是一類與植物光合作用有關的最重要的色素［2］.鎂離子螯合酶（Mg-chelatase，EC6.6.1.1）是參與四吡咯化合物生物合成的關鍵酶之一，催化Mg2+插入到原卟啉Ⅸ （Proto Ⅸ）中形成鎂原卟啉Ⅸ （Mg-Proto Ⅸ）［3］.鎂螯合酶中包含3個亞基H、I和D，CHLH作為鎂螯合酶最大的亞基，也是催化亞基，能結合底物原卟啉Ⅸ，調控葉綠素合成［4-5］.前人模擬冠層光合作用模型發現，降低葉片葉綠素含量可以提升光合作用效率和氮利用效率［1］.此外，作物的淡綠色表型可以降低冠層溫度，提高水分利用率，有助于應對不利環境［6］.NtCHLH基因沉默表達的煙草，其葉片表現出黃化或失綠，葉綠素含量降低［7］.葉色變異的茶樹CsCHLH表達量顯著下降［8-9］.油菜BnCHLH突變體表現出黃色幼葉和綠色老葉，葉綠素積累減少［10］.擬南芥CHLH突變體表現出葉片失綠，異位表達大豆GmCHLH1基因可以恢復其失綠表型［11］.沉默CHLH基因可以獲得連翹葉片黃化植株，瞬時過表達CHLH使得黃葉連翹葉綠素含量增加，類囊體結構恢復［12］.擬南芥中分離的gun5-1突變體在CHLH的保守區域攜帶單點突變，表現出葉綠體和細胞核之間信號通路的缺陷，同時存在白化表型，表明葉綠素生物合成存在缺陷［13］.番茄黃色柱頭突變體中CHLH基因在N端區域發生突變，導致柱頭葉綠素含量降低［14］.

植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）在調控植物生長發育及非生物脅迫中起著重要作用［15］.CHLH是多功能蛋白，除了在葉綠素合成途徑中起作用，還可以參與ABA信號傳導.草莓果實中脫落酸受體基因FaABAR／CHLH表達水平的變化表明，ABA在調控草莓果實成熟中的重要作用［16］.研究發現，擬南芥CHLH能特異性結合ABA，參與ABA信號的正向調控［17］.但大麥中CHLH的同源基因XanF突變沒有表現出ABA相關的表型，因此，研究者對CHLH是ABA受體這一說法提出了質疑［18］.Wu等［19］發現，ABAR／CHLH亞基通過其C端部分特異性地結合ABA，在ABA響應中起重要作用，過表達C端能引起植物對主要的ABA響應（包括種子萌發、萌發后生長和氣孔運動）表現出超敏感性;N端部分也參與調節，但作用相對有限，這為CHLH是ABA受體提供了新證據.此外，前人對多個CHLH／GUN5突變體研究發現，鎂螯合酶功能和質體信號傳導通常是相關的，而ABA調節的氣孔控制則與這兩者不同［20］.Wu等［19］推測，大麥XanF突變沒有表現出ABA相關的表型，可能是由于ABAR／CHLH所介導的ABA信號傳導機制與質體信號傳導及葉綠素生物合成途徑存在差異，或者在大麥體內存在功能上的冗余現象.

甘薯是世界上重要的糧食、飼料、能源以及工業原料作物［21］.中國是世界甘薯的最大生產國，在保障我國糧食安全上起著重要作用［22］.隨著全球氣候變化加劇，環境脅迫對植物生長發育產生的不利影響愈發明顯［23］.因此，挖掘和鑒定參與甘薯抗逆相關的基因尤為重要.CHLH作為葉綠素生物合成過程的重要基因，在ABA信號和葉綠體生物合成之間的協調作用有助于在植物生長和適應之間建立平衡，使植物適應不利環境，而CHLH的功能和調節機制在甘薯中尚未報道.

本研究對甘薯IbCHLH展開了系列分析.以徐薯29號為材料，克隆了鎂螯合酶的一個亞基基因IbCHLH，對其進行生物信息學分析，并研究在非生物脅迫和外源激素作用下，IbCHLH基因表達量的變化，為下一步利用轉基因或基因編輯技術創制特異優良新品種奠定基礎.

1材料與方法

1.1實驗材料

實驗材料為徐薯29號，來自國家甘薯種質資源試管苗庫（徐州）.

1.2基因克隆

在NCBI上獲得擬南芥AtCHLH（gene ID：831207）基因CDS序列，將該序列在參考基因組徐薯18中進行比對，根據比對的序列設計特異性引物（表1）.取徐薯29號新鮮葉片組織放至液氮中速凍，用研缽將其研磨至粉末狀.分別使用RNA prep Pure試劑盒和TaKaRa反轉錄試劑盒提取RNA、反轉錄.

以徐薯29號cDNA為模板，CHLH-F/CHLH-R為特異性擴增引物，PCR擴增反應體系及反應條件見表2.將擴增的目標條帶進行切膠回收，通過平末端克隆連接到pEASY-Blunt載體上，轉化到Trans1-T1大腸桿菌中，挑選單克隆送南京生工生物工程股份有限公司測序.

1.3生物信息學分析

通過Snapgene軟件對IbCHLH序列進行翻譯，獲得氨基酸序列.分別使用ExPASy ProtParam和Protscale在線網站分析IbCHLH氨基酸序列的理化性質和親疏水性.使用Netphos 3.1 Server、TMHMM 2.0 Server在線網站分析蛋白磷酸化位點和跨膜結構域.利用NCBI網站的Conserved domains功能對IbCHLH的保守結構域進行分析，利用Protein Blast功能對IbCHLH氨基酸序列進行比對，選取序列相似性gt;90％的物種，通過DNAMAN軟件進行多重序列比對分析，利用MEGA 11.0軟件構建進化樹.

1.4甘薯IbCHLH在不同處理下的表達模式分析

取健康薯苗若干，于霍格蘭營養液中培養.分別進行鹽（NaCl，200 mmol／L）、干旱（PEG6000，20％）、低溫（4 ℃）和外源激素處理，外源激素生長素（IAA）、ABA、茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）分別為100、100、150、150 μmol／L.取樣時間分別為0、2、4、6、12、24 h，RNA提取方法同1.2.設計引物qCHLH-F／qCHLH-R（表1），以IbActin為內參，檢測IbCHLH在不同處理下的表達水平.

2結果與分析

2.1甘薯IbCHLH基因的克隆

以徐薯29為模板，根據IbCHLH CDS序列設計引物，經PCR擴增，在3 000～5 000 bp得到了一條明亮條帶（圖1）.測序結果顯示，IbCHLH基因序列長度為4 146 bp，編碼1 381個氨基酸.將IbCHLH基因CDS序列在參考基因組徐薯18中進行比對，發現甘薯基因組中存在6個拷貝（圖2）.

2.2IbCHLH基因的生物信息學分析

通過在線軟件分析得到IbCHLH分子式為C6 874H10 837N1 841O2 067S37，分子質量為153.53 kDa，等電點為5.84.IbCHLH蛋白質的不穩定指數為39.07，是一種較為穩定的蛋白質.最高疏水值為-3.222，最高親水值為2.878，總平均親水指數為-0.277，由此推測該蛋白為親水性蛋白（圖3）.

磷酸化位點分析顯示，IbCHLH蛋白存在130個磷酸化位點（分數gt;0.5），其中絲氨酸（Ser）最多，為70個;蘇氨酸（Thr）41個;酪氨酸（Tyr）19個;推測其活性可能受到磷酸化的調控（圖4）.使用TMHMM 2.0 Server對甘薯IbCHLH蛋白的跨膜結構域進行預測，未發現其有明顯的跨膜結構域（圖5）.利用Conserved domains分析IbCHLH的保守結構域，結果顯示，IbCHLH蛋白序列中有PLN03069保守結構域（圖6），屬于PLN03069超家族.

2.3IbCHLH蛋白序列比對

具體步驟如下：利用NCBI的Protein Blast功能對甘薯IbCHLH基因編碼的氨基酸進行比對，選取9個常見物種的CHLH氨基酸序列，再利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對分析.由圖7知，CHLH氨基酸序列在物種間高度保守，序列相似性gt;90％的物種有三淺裂野牽牛（I. trifida）99.86％、三裂葉薯（I. triloba）99.78％、芝麻（Sesamum indicum）93.71％、榴蓮（Durio zibethinus）92.11％、歐白英（Solanum dulcamara）91.67％、咖啡（Coffea arabica）93.13％、銀白楊（Populus alba）91.75％、大豆（Glycine max）91.47％、煙草（Nicotiana tabacum）91.39％.

將以上9種相似率gt;90％的物種IbCHLH序列用MEGA軟件基于鄰近法構建進化樹.結果顯示，徐薯29號和I. trifida聚為一類，親緣關系最近，其次是I. triloba（圖8）.

2.4IbCHLH在非生物脅迫下的表達分析

為研究非生物脅迫對IbCHLH基因表達的影響，本研究分別進行了鹽（NaCl）、干旱（PEG）、低溫（4 ℃）處理.采用q-PCR技術檢測IbCHLH基因在不同處理時間3種非生物脅迫下的表達水平，結果如圖9所示.可見，NaCl處理后，相對表達量先顯著下降，處理6 h恢復至正常后又開始顯著下降，處理12 h時，表達量最低.PEG干旱處理2～24 h，IbCHLH表達量呈先下降后上升趨勢，在24 h時表達量最高.4 ℃低溫處理2 h時，IbCHLH表達量開始顯著下降，處理24 h時表達量逐漸回升.

2.5IbCHLH在不同外源激素處理下的表達分析

圖10為對健康薯苗進行IAA、ABA、SA和JA激素處理后，采用q-PCR技術檢測其IbCHLH的表達水平，可見，ABA、SA激素處理后，IbCHLH表達量呈先上升后下降趨勢;ABA處理4 h時，IbCHLH表達量達最高，約為處理前的2倍;IAA、JA激素處理后，IbCHLH表達量總體呈下降趨勢.

3討論與結論

甘薯栽培過程中，溫度、濕度、光照等氣候環境會影響其生長發育.因此，研究甘薯抗逆基因尤為重要.CHLH是一種多功能蛋白，參與葉綠素生物合成、質體信號傳導和ABA響應等［24］.前人對大豆鎂螯合酶3個亞基的啟動子基序分析發現，其啟動子區域存在多個CAAT盒和順式作用調節基序，如光反應元件（LRE）、晝夜節律調節元件（CRE）、激素反應元件（HRE）以及防御和應激反應元件（DSRE），推測大豆鎂螯合酶基因可能響應光反應、激素反應和抗逆反應等［11］.在轉基因水稻中異源表達AtCHLH，可以緩解水稻缺鐵誘導的脅迫，表明CHLH可能在水稻脅迫反應中發揮作用［25］.擬南芥中的F-box蛋白ZEITLUPE（ZTL）通過泛素化其底物CHLH／ABAR，經26S蛋白酶體途徑調節CHLH的穩定性，從而在ABA抑制的幼苗早期生長和ABA誘導的氣孔關閉過程中負向調節ABA信號［26］.已有研究表明，在擬南芥中過表達CHLH可以促進氣孔關閉，從而提高植物抗旱性［27］.本文探討了甘薯中IbCHLH在不同脅迫條件下的表達情況，結果顯示，IbCHLH對鹽、干旱、低溫等非生物脅迫均有不同程度響應.低溫處理和鹽處理24 h時，IbCHLH表達量下降，而干旱脅迫后表達量上調，推測IbCHLH在干旱脅迫下對甘薯抗逆具有正調控作用.小麥返白系是一種在苗期受到低溫誘導后會呈現“返白—復綠”特性的小麥品種，外源ABA處理可以誘導小麥返白系ABA信號通路中CHLH的表達上調，在一定程度上補償受阻的ABA信號傳遞通路［28］.本文中外源激素作用下，IbCHLH對IAA、ABA、SA和JA等均有響應，其中，ABA處理后，4 h時IbCHLH表達量最高，6 h時顯著下降，暗示IbCHLH基因可能參與了ABA的正向調控.

鎂離子螯合酶的催化過程需要ATP持續供給能量，在黑暗條件下線粒體產生的ATP無法運輸至葉綠體中，因此，植物處于短日照和弱光條件時，鎂離子螯合酶活性大大降低［29］.一個生物鐘關鍵基因TOC1（timing of CAB expression 1）與ABA相關基因（ABAR／CHLH／GUN5）的啟動子結合，并調控其晝夜節律表達［30］.本文中熒光定量實驗的首次取樣時間為9點，第12 h為21點，此時幾乎沒有光照，這可能是本實驗中第12 h時IbCHLH表達量很低的原因.

有研究表明，CHLH／ABAR跨越葉綠體包膜，ABAR的細胞質C末端與一組WRKY轉錄因子（WRKY40、WRKY18和WRKY60）相互作用，這些轉錄因子在種子萌發和萌發后生長中充當ABA信號傳導的負調控因子［31］.本文生物信息學分析顯示，IbCHLH蛋白沒有明顯的跨膜結構，可能是由于其氨基酸序列中親水性氨基酸占比較高、穩定性好等多種因素導致的.生物信息學預測方法存在一定的局限性，這一結果還需要進一步的實驗驗證來確認.

本文在徐薯29號中克隆出IbCHLH基因，保守結構域分析發現甘薯的IbCHLH蛋白含有PLN03069保守結構域，屬于PLN03069超家族.在系統進化樹分析中發現，甘薯的CHLH蛋白和其近緣野生種I. trfida親緣關系最近.以上研究結果為后續該基因在甘薯上的功能研究和分子機理研究奠定了基礎.

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［責任編輯： 史成娣］