氨對褶紋冠蚌鉤介幼蟲及稚蚌的急性毒性

喬瑞婷 李 艷 劉 苗 趙永晶 舒鳳月 崔永德

(1.中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2.中國科學院大學, 北京 100049;3.曲阜師范大學, 曲阜 273165)

氨氮是水生態系統中普遍存在的污染物, 其濃度過高時可對水生生物產生毒害作用[1]。人類活動產生的外源氮是水中氮污染的主要來源[2], 如過度使用的農田氮肥隨地表徑流進入水體。近年來我國氮肥消耗量一直維持在較高水平, 且呈快速增長趨勢[3]。隨著經濟快速發展, 氮污染已經成為世界各地水體污染的重要問題之一。確定氨氮對生物的毒性效應及閾值是管理水體氨氮濃度的重要依據。

底棲動物是水生態系統中的一大類群, 其活動能力弱, 逃逸能力差, 對環境污染和水質的干擾極為敏感[15,16], 能較好地反映出水體中受污染情況。蚌類屬軟體動物門(Mollusca), 雙殼綱(Bivalvia), 蚌目(Unionoida), 蚌科(Unionidae), 作為典型的大型底棲動物, 其生活史復雜且壽命較長[17—19], 且相較于魚類、兩棲類而言對氨更敏感[20]。自然界中絕大多數蚌類的生活史存在一個寄生的過程, 在繁殖季節鉤介幼蟲從成熟母蚌的外鰓排出, 寄生在魚體鰓絲、魚鰭上, 完成變態發育成為稚蚌后從魚體脫落,沉入水底, 營底棲生活[21—23]。蚌類各生活史階段有較為明顯的區分, 同時鉤介幼蟲和稚蚌相較于幼蚌未發育完全, 可能對毒物更為敏感。因此, 蚌類是毒性物質測試和水質狀況評價的理想對象, 然而以往對于蚌類的研究主要集中于幼蚌, 對更早期生活史階段如鉤介幼蟲、稚蚌的研究則較少[24]。

本文以長江中下游常見經濟蚌種褶紋冠蚌(Cristaria plicata)為研究對象, 分別以其鉤介幼蟲和稚蚌為實驗對象開展氨氮急性毒性實驗, 探究氨氮對褶紋冠蚌早期生活史階段的毒性, 以期為蚌類保護及水體中氮管理提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

實驗選擇長江中下游常見的經濟蚌種褶紋冠蚌為研究對象。孕有鉤介幼蟲的母蚌、稚蚌及幼蚌均取自安徽水韻軟體動物繁育科技有限公司。母蚌從養殖池塘中取出后, 用軟毛刷將母蚌表面附著的著生藻清理干凈, 將其放于盛有水的容器中,水深保持可以露出殼頂的高度。將母蚌置于陰涼的環境中待其自然釋放出鉤介幼蟲, 在顯微鏡下觀察鉤介幼蟲的活性, 挑選活力良好的鉤介幼蟲為實驗對象。實驗在鉤介幼蟲釋放后2h內進行。

稚蚌是指鉤介幼蟲寄生在魚鰓上發育基本成熟后脫落的個體, 實驗選擇5日齡的稚蚌為急性毒性實驗材料。在解剖鏡下挑選活力良好的稚蚌(伸出斧足活動)為實驗對象。

1.2 實驗設置

鉤介幼蟲急性毒性實驗參照美國試驗材料學會(American Society for Testing Material, ASTM) 發表的實驗標準, 采用24h靜水水生生物急性毒性實驗法, 實驗在250 mL燒杯中進行, 為便于觀察先將鉤介幼蟲置于90 mm培養皿中再置于盛有實驗水的燒杯中進行實驗。光照周期為12L∶12D。實驗用水為經充分曝氣的重組水[25]。用分析純NH4Cl配制實驗所需的氨溶液母液, 通過預實驗確定24h未見死亡的最大氨氮濃度和全部死亡的最小氨氮濃度。再根據預實驗結果以等間距設置正式實驗的6組氨氮濃度, 總氨氮濃度(TAN, 以N計)分別為: 0(對照組)、12、24、36、48和60 mg/L。每組氨氮濃度設置3個重復。實驗在恒溫水浴缸中進行, 以維持水溫在(20.0±0.2)℃, 用NaOH稀溶液和HCl稀溶液來調節水體pH在7.5±0.1。每個燒杯中放置10只鉤介幼蟲。實驗結束后統計幼蟲的死亡率, 用鑷子將盛有幼蟲的培養皿取出, 用飽和NaCl溶液測試其存活狀況。在解剖鏡下先統計鉤介幼蟲閉殼數記為N0, 滴加飽和NaCl溶液后再次統計閉殼數N1, 總死亡數N=10-(N1-N0)[26]。

稚蚌急性毒性實驗參照美國試驗材料學會發表的實驗標準, 采用48h靜水水生生物急性毒性實驗法,通過預實驗確定48h未見死亡的最大氨氮濃度和全部死亡的最小氨氮濃度。再根據預實驗結果以等間距設置正式實驗的6組氨氮濃度, TAN分別為: 0(對照組)、24、36、48、60和72 mg/L。其他設置同鉤介幼蟲急性毒性實驗。實驗開始后24h檢查稚蚌的存活情況, 用鑷子將盛有稚蚌的培養皿取出, 在解剖鏡下觀察稚蚌的存活情況, 雙殼打開輕觸不閉殼或雙殼緊閉輕觸有白色絮狀物視為死亡, 記錄總死亡數N。實驗期間, 每天更換1/2的實驗水。

1.3 樣品采集與分析

實驗開始后在每天換水前監測1次水溫、pH、溶氧等, 使用多參數水質分析儀PRO Plus (Yellow Spring Instruments, 美國)于水體中部測定。并取25 mL水樣用于檢測水體氨氮含量, 檢測方法使用納氏試劑光度法測定[27]。

1.4 數據處理與分析

數據處理與計算使用Excel 2016完成, 圖形繪制使用Origin 2021完成。

死亡率計算公式: 死亡率(%)=死亡數/10×100

為便于比較, 將所有實驗的TAN濃度結果標準化為在水溫20℃、pH 7條件下(TAN7.0,20℃)的值(AVpH7), 計算公式如下:

分子氨的計算公式:

式中, pKa=0.09018+2729.92/T

式中,T為絕對溫度,T=273.15+t(℃), 其中NH3為分子氨,為離子氨。

TAN與死亡率的效應-濃度曲線選擇各組不同時間采集計算的AVpH7平均值作為TAN值, NH3-N與死亡率的效應-濃度曲線選用如上計算的NH3-N的平均值。半致死濃度LC50通過將死亡率=50%代入濃度效應曲線公式獲得。

2 結果

2.1 氨對褶紋冠蚌鉤介幼蟲的急性毒性

實驗系統實際水溫為(20.1±0.8)℃ (平均值±標準差, mean±SD), 實際pH為7.67±0.2。在24h內各處理組平均TAN7.0,20℃濃度依次為(1±0)、(34±1)、(63±2)、(83±1)、(94±2)和(118±8) mg/L。各處理組平均NH3-N濃度依次為(0.01±0.01)、(0.30±0.17)、(0.53±0.24)、(0.65±0.19)、(0.75±0.13)和(0.92±0.13) mg/L (圖1)。

圖1 褶紋冠蚌鉤介幼蟲急性毒性實驗水體理化指標Fig.1 Physical and chemical indexes of water in acute toxicity test of glochidia

如圖2顯示, 隨著NH3-N濃度的升高, 褶紋冠蚌鉤介幼蟲的死亡率是明顯升高的。在各處理組中,24h鉤介幼蟲死亡率依次為0、3%、35%、47%、67%和100%。氨氮對褶紋冠蚌鉤介幼蟲的24h LC50為0.63 mg NH3-N/L和78 mg TAN7.0,20℃/L。

圖2 TAN及NH3-N對褶紋冠蚌鉤介幼蟲的濃度-效應曲線Fig.2 Scatter plot of liner regression between total ammonia nitrogen (A) and unionzed ammonia nitrogen (B) to mortality of glochidia

2.2 氨對褶紋冠蚌稚蚌的急性毒性

實驗系統實際水溫為(19.2±0.7)℃, 實際pH為7.62±0.18。48h內各處理組平均TAN7.0,20℃濃度依次為(2±0)、(64±3)、(89±3)、(114±7)、(134±0)和(157±2) mg/L; 各處理組平均NH3-N濃度依次為(0.01±0.01)、(0.39±0.14)、(0.53±0.11)、(0.65±0.07)、(0.75±0.08)和(0.84±0.09) mg/L (圖3)。

圖3 褶紋冠蚌稚蚌急性毒性實驗水體理化指標Fig.3 Physical and chemical indexes of water in acute toxicity test of newly transformed juvenile

如圖4顯示, 隨著NH3-N濃度的升高, 褶紋冠蚌稚蚌的死亡率逐漸升高。在各處理組中, 48h稚蚌的死亡率依次為0、10%、23%、67%、93%和100%。通過計算得到氨氮對褶紋冠蚌稚蚌的48h LC50為0.60 mg NH3-N/L和104 mg TAN7.0,20℃/L; 氨氮對褶紋冠蚌稚蚌的24h LC50介于0.64—0.78 mg NH3-N/L和118—140 mg TAN7.0,20℃/L 。

圖4 TAN及NH3-N對褶紋冠蚌稚蚌的濃度-效應曲線Fig.4 Scatter plot of liner regression between total ammonia nitrogen (A) and unionzed ammonia nitrogen (B) to mortality of newly transformed juvenile

3 討論

3.1 氨對褶紋冠蚌早期生活史階段的毒性

本研究中氨氮對褶紋冠蚌鉤介幼蟲的24h LC50為0.63 mg NH3-N/L和78 mg TAN/L, 對褶紋冠蚌稚蚌的48h LC50為0.60 mg NH3-N/L和104 mg TAN/L。這些閾值高于許多國內外已有研究中氨對其他淡水蚌類毒性的閾值, 如氨對Lampsilis siliquoidea、Actinonaias ligamentina、Lampsilis rafinesqueana、Epioblasma capsaeformis、Villosa iris、Lampsilis fasciola等蚌類鉤介幼蟲的24h LC50為4.8—16 mg TAN/L[26,28], 對Lampsilis siliquoidea、Lampsilis rafinesqueana、Epioblasma capsaeformis、Villosa iris等蚌類稚蚌48h LC50為7.9—16 mg TAN/L[26,28]。上述結果表明相比其他淡水蚌類, 褶紋冠蚌能夠耐受更高濃度的氨氮。近些年來長江中下游水體總氮含量達多年前的十倍之多, 楔形麗蚌(Lamprotula bazini)、三巨瘤麗蚌(Lamprotula triclava)等不少種類消失, 而褶紋冠蚌始終為該研究區域的優勢種之一[29,30], 暗示褶紋冠蚌對環境變化有較強的適應能力。此外, 國內外現有關于蚌類氨氮耐受性的研究大多聚焦于珍稀物種或瀕危物種, 這些蚌類自身對環境的變化較為敏感[31], 對污染物的耐受能力較差, 這可能也是導致本研究結果與已有報道差異的原因之一。

3.2 褶紋冠蚌不同生活史階段氨耐受性的差異及機制

本研究結果顯示褶紋冠蚌早期生活史階段對氨氮更為敏感, 且隨著個體生長發育的持續其對氨的耐受性增加。本研究中稚蚌的24h LC50(以總氨氮計)約為鉤介幼蟲的1.5倍, 表明相比鉤介幼蟲, 稚蚌能夠耐受更高濃度的氨氮。關于褶紋冠蚌幼蚌,國內已有部分學者研究了氨對其毒性, 如陳瑩瑩等[32]發現氨氮對褶紋冠蚌幼蚌的48h LC50為274 mg TAN/L, 其值亦遠高于本研究氨對稚蚌和鉤介幼蟲的LC50, 同樣表明隨著蚌個體發育的完善, 其對氨毒性耐受性增強。Wang 等[26]對北美一種淡水蚌類Lampsilis siliquoidea的研究結果與本研究類似, 氨對Lampsilis siliquoidea稚蚌的48h EC50(＞16 mg TAN/L)高于其對鉤介幼蟲的48h EC50(8.8—13 mg TAN/L)。關于Lampsilis rafinesqueana、Epioblasma capsaeformis、Villosa iris、Lampsilis fasciola等淡水蚌類的研究結果同樣與本研究類似[28,33]。

蚌類發育后期其外殼較早期明顯變厚, 與鉤介幼蟲相比能更有效地阻隔體內組織與水體氨氮的接觸, 從而利于其耐受更高濃度的氨。已有大量研究表明, 軟體動物在處于危險狀態時, 外部的殼對其有一定的保護作用, 如銅銹環棱螺在面對氨脅迫時會緊閉厴甲來減少與外部水環境的接觸, 從而減弱了氨對其內部結構的損傷[34]。而蚌類的外殼在其早期生活史階段薄且易碎, 對殼內組織的保護不夠充分。稚蚌及幼蚌由于外殼的加厚變硬及發育的完成, 可緊閉雙殼來減少體內組織暴露于有毒環境的時間, 可以對稚蚌、幼蚌起到更有力的保護作用, 因而其比鉤介幼蟲能耐受更高濃度的氨。

在一定范圍內, 蚌類可以對氨氮進行一定程度的解毒, 且其解毒能力也可能會隨著個體發育的完善有所提高。已有較多水生生物對氨解毒機制的研究表明鰓和肝胰臟(或肝臟、腎臟等)是其解毒的重要器官[35]。蚌類可通過鰓上的纖毛組織將部分體內的氨排出體外[36], 而隨著蚌類個體發育, 鰓表面積變大, 其上的氨排泄速率會更高。蚌類不同于鰓對氨的轉運排出作用, 蚌類的肝胰臟主要是將生物體內的氨轉化為無毒或低毒性的物質儲存在體內。在肝胰臟中銨可在催化酶的作用下生成谷氨酰胺(Gln)[37]、丙氨酸和天冬氨酸[38]。隨著個體的生長發育, 蚌類的鰓和肝胰腺等解毒代謝器官的發育漸趨完善, 其解毒能力也逐漸增強, 從而使其能夠耐受更高濃度的氨氮。

本研究仍有諸多不足, 首先研究對象僅為褶紋冠蚌1種, 關于氨氮對蚌類毒性及閾值的評估仍需更多研究, 尤其是針對一些珍稀的亟待保護的種類,如背瘤麗蚌(Lamprotula leaii)、佛耳麗蚌(Lamprotula mansuyi)和三型矛蚌(Lanceolaria triformis)等。此外, 本研究僅開展了室內急性毒性實驗, 可能無法反映自然水體中蚌類對長期氨脅迫響應。本研究團隊前期針對鰱、鳙和鯽等魚類、銅銹環棱螺等底棲動物的研究表明氨對生物的毒性存在尺度依賴性, 其隨研究尺度的增大而減弱。因此,關于后期需結合多尺度研究系統分析氨對蚌類的毒性效應及閾值, 從而為自然水體中氨氮對蚌類的安全閾值的確定及水體氮管理策略等提供科學依據。

4 結論

本研究結果顯示氨氮對褶紋冠蚌鉤介幼蟲和稚蚌的LC50分別為0.63 mg NH3-N/L、78 mg TAN/L(24h)和0.60 mg NH3-N/L、104 mg TAN/L (48h), 這一結果表明褶紋冠蚌對氨氮的耐受性高于國內外許多已有研究中的蚌種。此外, 褶紋冠蚌更早期生活史階段對氨氮更為敏感, 且隨著個體生長發育的持續其對氨的耐受性增加蚌類。以上研究結果可為蚌類保護及水體氮管理策略的制定提供一定的科學依據。

圖版Ⅰ TAN及NH3-N 與褶紋冠蚌稚蚌的濃度-效應關系PlateⅠ The relationship between total ammonia nitrogen (A) and unionzed ammonia nitrogen (B) of newly transformed juvenile

附表 S1 褶紋冠蚌稚蚌累計死亡個數變化Appendix S1 Cumulative death of newly transformed juvenile

致謝:

感謝安徽水韻軟體動物繁育科技有限公司提供實驗動物, 感謝張歡在實驗中提供的幫助, 感謝Kazi Belal Uddin 對本文英文部分修改潤色提供的幫助。