基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)建立大口黑鱸彈狀病毒檢測方法

張敏琳 黃楓淇 左小玲 梁建韜 梁凱珊 單金紅 李宗烊 喻 婕羅麗媛 禤梓杰 趙會宏, 王 慶,

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院, 廣州 510642; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)粵港海洋生物資源保護(hù)與開發(fā)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642)

大口黑鱸(Micropterus salmoides)是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一, 因其肉質(zhì)鮮美、無肌間刺,加之其適應(yīng)性強(qiáng)、養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn), 深受消費(fèi)者和養(yǎng)殖者的喜歡, 近年來大口黑鱸的養(yǎng)殖出現(xiàn)了快速增長[1]。目前, 我國大口黑鱸年養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)70萬噸, 養(yǎng)殖場主要集中分布在廣東、江蘇、浙江、江西、四川和福建6省份, 占全國生產(chǎn)總量的90%以上[2]。然而, 在大口黑鱸的養(yǎng)殖過程中, 其病害日趨嚴(yán)重, 細(xì)菌病和病毒病成為危害其養(yǎng)殖的主要疾病[3], 其中大口黑鱸彈狀病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV)危害巨大。該病毒能引起幼魚嗜睡、漫游、腹部腫脹和體形扭曲, 以及誘導(dǎo)壞死性潰瘍和多器官出血, 一旦感染死亡率超過90%[4]。MSRV是一種包膜狀、短棒狀或子彈狀的單股負(fù)鏈RNA病毒, 能夠嚴(yán)重危害大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 該病毒具有傳播速度快、死亡率高、防控難度大的特點(diǎn)[5]。MSRV包含11300—11600個核苷酸, 包括3′非翻譯區(qū)和5種結(jié)構(gòu)蛋白[核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA聚合酶]。其中MSRV的3′前導(dǎo)區(qū)與其他魚類彈狀病毒相比在遺傳水平上具有低同源性[6]。彈狀病毒共有9個屬, 除了一些未被分類的病毒之外, 感染魚類的彈狀病毒主要為水泡性口炎病毒屬、諾拉彈狀病毒屬和佩彈狀病毒屬這3個屬[7]。其中, MSRV屬彈狀病毒科(Rhabdoviridae), 水泡性口炎病毒屬(Vesiculovirus)[8,9]。每年因MSRV導(dǎo)致的大口黑鱸魚苗損失超過30%, 給大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來巨大損失。但是目前關(guān)于該病毒的治療和檢測方法還不成熟, 尤其是現(xiàn)有檢測技術(shù)較難做到在無復(fù)雜檢測設(shè)備的情況下開展現(xiàn)場檢測。

目前關(guān)于檢測MSRV的方法主要分為組織病理學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等。組織病理學(xué)檢測主要是采取魚的患病組織器官制作石蠟病理切片, 后在顯微鏡下觀察組織病理變化[10];免疫學(xué)檢測主要是采用ELISA檢測大口黑鱸血清中的G蛋白抗體水平, 用以分析MSRV誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)[11]; 分子生物學(xué)上經(jīng)常使用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[12]、熒光實(shí)時定量PCR[13]等。上述檢測方法還存在一些不足之處, 如檢測方法不夠高效方便、檢測設(shè)備需要專業(yè)的溫控功能、檢測所需時間較長、實(shí)驗(yàn)人員需要一定的實(shí)驗(yàn)技能等。除此之外, 目前關(guān)于MSRV還沒有有效的治療方法, 故很有必要在感染之前及時發(fā)現(xiàn)病毒并做好有效的防范措施, 能夠在一定程度上減少養(yǎng)殖過程中的損失。因此, 開發(fā)一種靈敏度高、特異性強(qiáng)并且適合現(xiàn)場診斷的MSRV檢測方法迫在眉睫。

CRISPR系統(tǒng)最初是在細(xì)菌和古細(xì)菌中得到確認(rèn)[14], CRISPR-Cas系統(tǒng)是結(jié)合和切割外來核酸的原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[15]。CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為兩類: 使用多蛋白復(fù)合物破壞外來核酸的一類系統(tǒng), 包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型, 以及使用單一蛋白質(zhì)的二類系統(tǒng), 包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型[16]。Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)擁有如下特征: Cas核酸內(nèi)切酶處理前crRNA, 每個crRNA被組裝成多Cas蛋白復(fù)合物, 從而可以識別和切割與crRNA互補(bǔ)的核酸片段。而Ⅱ型系統(tǒng)處理前crRNA的機(jī)制不同, 其中與前crRNA中重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA(tracrRNA)在Cas9蛋白存在的情況下會觸發(fā)雙鏈RNA特異性核糖核酸酶RNaseⅢ的處理[17]。近年來, CRISPR-Cas13a引發(fā)了很多的研究。CRISPR-Cas13a(以前稱為C2c2)是一種新表征的單效應(yīng)子Ⅱ類, Ⅵ型, RNA引導(dǎo)的RNA編輯系統(tǒng)[18]。Cas13a的序列分析顯示存在兩個更高的真核和原核核苷酸結(jié)合內(nèi)核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域, 且不存在DNase催化位點(diǎn)[19]。CRISPR-Cas13a具有RNA引導(dǎo)的RNA靶向內(nèi)切酶和非特異性RNA內(nèi)切酶活性兩種活性, 故逐漸被開發(fā)為核酸檢測的工具[18]。當(dāng)Cas13a與crRNA結(jié)合后, 會形成具有核酸酶活性的核糖核蛋白復(fù)合體, 當(dāng)識別到具有互補(bǔ)序列的單鏈靶標(biāo)RNA時, 會激活Cas13a切割單鏈靶標(biāo)RNA[20]。其切割活動可通過連接的熒光體-淬滅體的ssRNA來檢測, 被激活的Cas13a會切割ss-RNA導(dǎo)致其裂解后發(fā)熒光[18,21]。基于這一特性,CRISPR/Cas13a的檢測已成功應(yīng)用于檢測赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒[22]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒[23]和甲型H7N9禽流感病毒[24], Cas13a與對應(yīng)的crRNA結(jié)合形成復(fù)合物并且與靶向RNA結(jié)合時, Cas13a的切割活性被激活以降解非靶向RNA。

MIRA (Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA)技術(shù)是一種基于重組酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù), 通過MIRA反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)核酸序列的擴(kuò)增, 無須復(fù)雜的熱循環(huán)儀, 而是可以通過簡單的水浴或加熱塊在20—37℃的恒定溫度下完成。整個反應(yīng)過程需要3種酶: 重組酶, 負(fù)責(zé)將特異性引物與模板DNA配對; 單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB),在不加熱的情況下形成單鏈DNA; 鏈置換DNA聚合酶, 負(fù)責(zé)擴(kuò)增和延伸。反應(yīng)一旦開始, DNA擴(kuò)增會迅速進(jìn)行, 并在20min時間內(nèi)達(dá)到可檢測的水平[25]。與RPA (T4 UvsX)或RAA (大腸桿菌UvsX)中使用的重組酶不同[26], MIRA使用螺旋酶(gp41)和重組酶(SC-recA)的組合來形成單鏈DNA并啟動反應(yīng)。多酶系統(tǒng)加速了反應(yīng)速度, 促進(jìn)了對潛在抑制劑的耐受性。在MIRA中, 核酸模板的擴(kuò)增過程可以在37—42℃下10—30min內(nèi)完成。這項(xiàng)技術(shù)已被用于檢測豬瘟病毒[25]。與其他等溫擴(kuò)增類似, 反轉(zhuǎn)錄-MIRA (RT-MIRA)產(chǎn)物也可以通過側(cè)流條檢測或?qū)崟r定量PCR進(jìn)行可視化檢測。

本研究開發(fā)了一種結(jié)合MIRA技術(shù)和CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的MSRV核酸檢測方法, 該方法特異性強(qiáng), 靈敏度高并且操作簡便, 為MSRV的現(xiàn)場檢測提供幫助, 也為盡早發(fā)現(xiàn)MSRV采取防控措施提供幫助。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

從鱸魚養(yǎng)殖場采集患有大口黑鱸彈狀病毒全長約2 cm的魚苗樣品, 均存放于-80℃冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

主要試劑: 純化的LwaCas13a (East Mad東抗生物公司); Tris飽和酚(pH7.8); RNAiso plus和RTPCR試劑盒(TaKaRa公司); 反轉(zhuǎn)錄試劑(TOYOBO東洋紡公司); T7高產(chǎn)RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Without ROX)試劑盒(Vazyme諾唯贊生物技術(shù)有限公司); CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)的緩沖液使用Macklin麥克林試劑公司定制(40 mmol/L Tris-HCl pH 7.3, 60 mmol/L NaCl,6 mmol/L MgCl2); MIRA-RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(基礎(chǔ)型)(濰坊安普未來生物科技有限公司)。

主要儀器: Tannon2500 凝膠成像系統(tǒng)、實(shí)時熒光定量 PCR儀(美國Bio-Rad 公司); 高速離心機(jī)(美國Beckman 公司); 電泳儀(北京白晶生物技術(shù)有限公司); 紫外透射器(美國MaestroGen公司)。

1.3 crRNA的制備以及MIRA引物設(shè)計

在GenBank中下載MSRV序列, 針對其衣殼蛋白(CP)基因序列(NCBI: MK397811.2)設(shè)計長度為20 nt的靶點(diǎn), 并根據(jù)靶點(diǎn)所在位置設(shè)計出兩個crRNA(分別為crRNA1和crRNA2), 如表1所示, 并通過NCBI-BLAST來確認(rèn)其特異性。設(shè)計使用兩對不同MIRA引物分別對含有靶序列的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增, 并命名分別為MIRA-F1/R1和MIRA-F2/R2,如表2所示。

表1 針對MSRV設(shè)計的crRNA序列Tab.1 crRNA sequences designed for MSRV

表2 MIRA擴(kuò)增引物序列Tab.2 Primer sequences for MIRA amplification

1.4 MIRA擴(kuò)增以及體外轉(zhuǎn)錄

使用MIRA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒,在42℃恒溫條件下, 用MIRA引物將提取出來的樣品RNA進(jìn)行擴(kuò)增, 并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收, 得到的DNA使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄為RNA, 從而獲得病毒RNA序列。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

基于實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的cDNA庫, 用MSRV引物對cDNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證是否為MSRV。經(jīng)測序確定后的模板cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄, 測定濃度并稀釋得到RNA標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 ssRNA報告探針合成

ssRNA報告探針序列為: 5′-UUUUUU-3′, 5′端和3′端分別標(biāo)記了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。我們使用RNA酶來測試ssRNA報告探針作為檢測信號的可行性, 同時, 利用Cas13a蛋白的特性, ssRNA報告探針可被激活的Cas13a蛋白裂解, 從而發(fā)出熒光, 可通過簡單的紫外燈或熒光定量儀檢測。

1.7 Cas13a檢測體系

CRISPR/Cas13a檢測反應(yīng)體系如表3所示, 將反應(yīng)物充分混勻離心后置于熒光定量儀上, 選擇觀察 FAM 熒光強(qiáng)度, 在37℃恒溫條件下反應(yīng)1h, 并且每隔1min收集一次熒光值, 反應(yīng)結(jié)束后用紫外燈照射觀察熒光值。

表3 CRISPR /Cas13a檢測體系Tab.3 CRISPR /Cas13a detection system

1.8 檢測體系優(yōu)化

為了確定用CRISPR/Cas13a檢測MSRV的最佳反應(yīng)體系, 我們對檢測體系的四個部分進(jìn)行了優(yōu)化: crRNA種類、反應(yīng)溫度、ssRNA報告探針含量以及Cas13a與crRNA的反應(yīng)濃度比, 同時我們在實(shí)驗(yàn)中使用ddH2O作為空白對照。

首先保持所有的參數(shù)不變, 變量為crRNA的種類(即crRNA1和crRNA2), 最后根據(jù)單位時間內(nèi)反應(yīng)效率及最終收集的熒光值來選擇最佳的crRNA;探究最佳反應(yīng)溫度, 除了反應(yīng)溫度, 其他參數(shù)保持不變, 分別在31℃、34℃、37℃和40℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn);接下來, 除了ssRNA報告探針含量, 其他參數(shù)保持不變, 設(shè)置探針濃度分為100、200、300、400、500、600和700 nmol/L; 最后, 保持其他參數(shù)不變, 改變Cas13a與crRNA的反應(yīng)濃度比。根據(jù)單位時間內(nèi)反應(yīng)效率及最終收集的熒光值來選擇最佳的反應(yīng)溫度、ssRNA報告探針濃度及Cas13a與crRNA的反應(yīng)濃度比。

1.9 靈敏度試驗(yàn)

使用優(yōu)化后的CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)檢測不同濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品, 以104fM到10-1fM的濃度對RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋, 以無目標(biāo)RNA樣品為陰性對照, 從而探尋CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)最低檢測濃度。

1.10 特異性試驗(yàn)

使用優(yōu)化后的CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)檢測不同的水產(chǎn)RNA病毒, 包括RGNNV、BFNNV、TPNNV,用無病毒感染魚的RNA作為陰性對照, 用ddH2O作為空白對照, 測試含有特異性crRNA的CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)是否能檢測出其他的水產(chǎn)RNA病毒。

1.11 重復(fù)性試驗(yàn)以及樣品檢驗(yàn)

采集有明顯患病跡象的病魚樣品, 并對樣品進(jìn)行預(yù)處理和擴(kuò)增RNA。采用本研究優(yōu)化后的CRIS-PR/Cas13a檢測系統(tǒng), 與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的MSRV檢測方法(qPCR)做對比, 以MSRV基因作為陽性對照組, 無MSRV病毒感染魚的RNA樣品作為陰性對照組, ddH2O作為空白對照組。

2 結(jié)果

2.1 MIRA引物對篩選

使用兩對不同MIRA引物對含有靶序列的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳, 如圖1a所示。電泳圖位于100 bp的位置, 3個泳道均出現(xiàn)明亮的條帶, 表明有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道2和3中250 bp處為擴(kuò)增的目的條帶。用Image J軟件分別將電泳圖泳道2中長度為224 bp和泳道3中長度為255 bp的目的條帶進(jìn)行定量分析, 并用“灰度值”表示定量分析的結(jié)果。從分析結(jié)果得出, 灰度值越低表示引物利用率高, 即引物特異性結(jié)合擴(kuò)增效率高,如圖1b所示。結(jié)果表明: 采用MIRA-F2/R2引物對時, 特異性結(jié)合擴(kuò)增效率高。

圖1 MIRA引物對篩選電泳膠圖以及灰度值分析Fig.1 MIRA primer pair screening electrophoretic gel plots as well as gray value analysis

2.2 CRISPR/Cas13a檢測體系

CRISPR/Cas13a檢測體系反應(yīng)結(jié)束后用紫外燈進(jìn)行照射, 觀察熒光值(圖2)。

圖2 CRISPR/Cas13a檢測體系-熒光亮度圖Fig.2 CRISPR/Cas13a detection system-fluorescence brightness map

2.3 CRISPR/Cas13a-MSRV最佳反應(yīng)體系

我們分別用RNA標(biāo)準(zhǔn)品和擴(kuò)增的樣品RNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 如圖3a所示, 靶向目標(biāo)RNA的定位速度,crRNA2要優(yōu)于crRNA1; crRNA1比crRNA2有更強(qiáng)的最終熒光信號; crRNA1+crRNA2等比例混合使用能綜合兩者的優(yōu)點(diǎn), 反應(yīng)效率更好。

圖3 優(yōu)化CRISPR/Cas13a-MSRV檢測反應(yīng)條件檢測效果各數(shù)據(jù)圖Fig.3 Optimization of CRISPR/Cas13a-MSRV assay reaction conditions to detect the effect of each data graph

探究反應(yīng)溫度對檢測系統(tǒng)的影響, 設(shè)置了31℃、34℃、37℃和41℃不同反應(yīng)溫度, 如圖3b所示, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測體系最佳反應(yīng)溫度是37℃。

探究ssRNA報告探針濃度對檢測系統(tǒng)的影響,如圖3c所示, 在測試范圍內(nèi), 熒光強(qiáng)度與ssRNA報告探針濃度呈正相關(guān), ssRNA報告探針濃度在 500—700 nmol/L檢測效果差異不大, 考慮到現(xiàn)實(shí)經(jīng)濟(jì)問題, 最佳的ssRNA報告探針濃度為500 nmol/L。

為探究不同Cas13a與crRNA的反應(yīng)濃度比對檢測系統(tǒng)的影響, 如圖3d所示, 當(dāng)以每份100 nmol/L比例的基礎(chǔ)上,Cas13a∶crRNA的比例為4∶1和3∶1時,Cas13a達(dá)到飽和狀態(tài); 當(dāng)Cas13a數(shù)量一定時, 熒光信號的強(qiáng)度并沒有與crRNA數(shù)量的增加呈正相關(guān)。因此, Cas13a與crRNA比例為2∶1時, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)能夠獲得最大的檢測活性。

2.4 靈敏度評估

為探究CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)對MSRV的最低檢測濃度, 故將RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度連續(xù)稀釋, 并用CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。如圖4所示, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)至少能檢測到102fM MSRV的ssRNA。當(dāng)目標(biāo)RNA濃度低于102fM時, 機(jī)器檢測到的熒光信號與空白對照無明顯差異。因此, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)至少能檢測到102fM MSRV的ss-RNA。

圖4 評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)對MSRV的靈敏度Fig.4 Assessing the sensitivity of the CRISPR/Cas13a-MSRV detection system for MSRV

2.5 特異性評估

為評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)的特異性, 使用優(yōu)化后的CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)檢測不同的水產(chǎn)RNA病毒, 包括RGNNV、BFNNV和TPNNV。如圖5所示, 只有MSRV的檢測體系能檢測出熒光信號, 其他病毒的檢測體系檢測出的熒光信號與陰性對照無差別, 為陰性結(jié)果。這表明CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)可特異性靶向MSRV,該檢測方法特異性很好。

圖5 評估CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)對MSRV的特異性Fig.5 Assessing the specificity of the CRISPR/Cas13a-MSRV detection system for MSRV

2.6 樣品檢測

對從鱸魚養(yǎng)殖場采集有明顯患病跡象的病魚樣品, 驗(yàn)證病魚所感染病原體是否為MSRV, 使用MSRV衣殼蛋白序列特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 并將圖6a中電泳圖中相對應(yīng)條帶送測, 比對確認(rèn)為MSRV。

圖6 MSRV序列信息確認(rèn)Fig.6 Confirmation of MSRV serial information

對感染了MSRV的病魚樣品進(jìn)行預(yù)處理和預(yù)擴(kuò)增病毒RNA, 然后與陰性對照組進(jìn)行檢測。同時提取樣品的cDNA做常規(guī)檢測qPCR進(jìn)行比較。如圖7所示, 用CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)檢測出陽性樣品(3、6、7、8、9、12、13、14和15號)與常規(guī)檢測qPCR的結(jié)果一樣, 其中qPCR的CQ值處于18—25; 而陰性樣品(1、2、4、5、9、10和11號)閾值循環(huán)數(shù)則都大于38, 表明樣品無攜帶MSVR病毒。綜上所述, CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)與常規(guī)檢測RT-qPCR的檢測數(shù)據(jù)相符合, 表明CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)的可行性且在一定程度上可以代替原先常規(guī)繁雜的檢測方法。

圖7 樣品qPCR檢測數(shù)據(jù)以及CRISPR檢測數(shù)據(jù)縱向比較圖Fig.7 Longitudinal comparison of sample qPCR assay data and CRISPR assay data

3 討論

大口黑鱸是我國淡水魚養(yǎng)殖的重要品種之一,但是在養(yǎng)殖過程中, 病害頻發(fā), 其中MSRV是影響其苗種成活的主要病原, 幼苗感染該病毒后死亡率可達(dá)90%[10]。故盡早發(fā)現(xiàn)MSRV并采取有效針對性措施進(jìn)行預(yù)防和控制是至關(guān)重要的。準(zhǔn)確的病毒核酸檢測方法能為病毒的檢測提供準(zhǔn)確且高效的技術(shù)支持。在現(xiàn)階段的研究中, 關(guān)于MSRV的快速檢測方法的研究很少, 傳統(tǒng)檢測方法需要復(fù)雜設(shè)備和較長的檢測時間[27]。因此, 建立一種準(zhǔn)確、高效的病毒核酸檢測方法對于后續(xù)疾病的控制作用很大。

本研究利用CRISPR/Cas13a系統(tǒng)結(jié)合等溫擴(kuò)增MIRA技術(shù)檢測MSRV, 根據(jù)MSRV的衣殼蛋白序列設(shè)計了檢測靶標(biāo)位點(diǎn)和設(shè)計合成了MIRA引物,并用它們進(jìn)行等溫擴(kuò)增目標(biāo)序列, 并對CRISPR/Cas13a-MSRV系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化, 探索建立了最優(yōu)的檢測體系為在20 μL的檢測體系中含有200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2、500 nmol/L ssRNA報告探針, 在反應(yīng)溫度為37℃的情況下能夠獲得最佳的CRISPR/Cas13a-MIRA-MSRV檢測效果。此外, 檢測了該方法的靈敏性和特異性, 發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas13a-MSRV檢測系統(tǒng)能檢測到102fM的MSRV, 只有MSRV的檢測體系能檢測出熒光信號, 其他病毒的檢測體系檢測出的熒光信號與陰性對照無差別, 說明該檢測系統(tǒng)靈敏度高、特異性強(qiáng)。結(jié)合等溫擴(kuò)增MIRA技術(shù)的CRISPR/Cas13a-MSRV核酸檢測方法能在一管內(nèi)進(jìn)行反應(yīng),當(dāng)檢測到MSRV時, ssRNA報告探針也相應(yīng)被裂解,能夠通過肉眼直接觀察。從理論方面來看, 檢測體系中除了crRNA的需要根據(jù)樣品而改變, 其他組分不改變, 這在一定程度上能與多種核酸擴(kuò)增技術(shù)相兼容。在本研究中我們還將檢測結(jié)果與常規(guī)核酸檢測方法qPCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行了對比, 以檢驗(yàn)CRISPR/Cas13a技術(shù)應(yīng)用于MSRV檢測的可行性和優(yōu)勢。檢測結(jié)果只有陽性樣本組才能觸發(fā)CRISPR/Cas13a系統(tǒng)熒光信號的顯著產(chǎn)生, 而其他非目標(biāo)序列病毒或陰性對照組則沒有熒光信號, 說明該檢測系統(tǒng)具有良好的特異性。同時, 該檢測系統(tǒng)與qPCR在靈敏度和重復(fù)性方面也表現(xiàn)出一致性和穩(wěn)定性, 陽性樣本檢出符合率高。

基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的病毒核酸檢測方法, 能夠在短時間內(nèi)建立, 其靈敏度和特異性高, 且反應(yīng)迅速, 可在1h內(nèi)提供檢測結(jié)果。反應(yīng)所需條件簡單, 不需要依賴復(fù)雜的熱循環(huán)儀, 可在室溫條件下進(jìn)行。反應(yīng)可在1個試管里進(jìn)行, 所耗費(fèi)試劑的量小, 反應(yīng)所需的cas13a蛋白及crRNA購買之后可以使用很多次, 故平均每次檢測所需成本很低。在本研究中已經(jīng)建立了CRISPR/Cas13a-MSRV檢測方法, 檢測過程不需要復(fù)雜的變溫條件, 相比使用普通的PCR擴(kuò)增, 這大大減少了檢測所需時間。另外, 我們的檢測方法可以在20min內(nèi)檢測到102fM的MSRV, 這與其他的檢測方法相比, 該方法明顯要更迅速得出檢測結(jié)果。普通的PCR方法至少需要1h, qPCR通常需要30min到2h的時間。此外, 傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測方法, 如RT-PCR, qPCR的檢測依賴于復(fù)雜的熱循環(huán)儀或其他昂貴的儀器或試劑; 免疫學(xué)檢測方法, 如免疫組化容易出現(xiàn)試劑污染、灰塵污染、染色異常、實(shí)驗(yàn)耗時長等問題, 因此難以應(yīng)用于非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的現(xiàn)場診斷。而用CRISPR/Cas13a系統(tǒng)進(jìn)行檢測, 其反應(yīng)過程不需要依賴熱循環(huán)儀, 且結(jié)果能夠通過紫外燈照射而得知。從上述實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas13a系統(tǒng)可以特異性的檢測MSRV, 并且最低檢測濃度達(dá)到102fM。綜上所述, 將CRISPR/Cas13a系統(tǒng)用于MSRV檢測具有現(xiàn)場檢測成本低、可行性高、特異性強(qiáng), 靈敏度高的特點(diǎn)。

在疾病的發(fā)展初期, 及時發(fā)現(xiàn)病原體和控制疾病的走向是非常重要的, 特別是病毒性疾病。在此基礎(chǔ)上, 應(yīng)用CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行病毒的檢測, 表現(xiàn)出該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物的免疫系統(tǒng), 用來抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵, 比如噬菌體病毒和外源質(zhì)粒。CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識別出外源DNA或RNA, 并將其切斷, 這表明CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有精確的靶向功能, 因此應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行病毒檢測具有較高的特異性[28]。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要針對大多數(shù)DNA起作用, 而CRISPR/Cas13a系統(tǒng)針對的是RNA[29]。以往的RNA病毒檢測中會存在靈敏度不高的問題, 容易出現(xiàn)錯檢、漏檢的現(xiàn)象。在現(xiàn)在的研究中, Liu等[30]將CRISPR/Cas13a系統(tǒng)用于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2(SARS-CoV-2)的檢測, 實(shí)現(xiàn)最低檢測濃度達(dá)到0.25拷貝/μL。Huang等[31]也將CRISPR/Cas13a系統(tǒng)用于貓杯狀病毒(FCV)的檢測, 實(shí)現(xiàn)最低檢測濃度達(dá)到13.13拷貝/μL, 達(dá)到了快速高效的檢測效果。基于該特點(diǎn), CRISPR/Cas13a系統(tǒng)有望成為在臨床上快速、方便且準(zhǔn)確診斷RNA病毒的工具。

同時, 該檢測方法在運(yùn)用CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的基礎(chǔ)上結(jié)合了等溫擴(kuò)增MIRA技術(shù), 等溫擴(kuò)增MIRA技術(shù)與重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)類似, 是1種新型的核酸快速等溫擴(kuò)增技術(shù)。能在5—30℃條件下25—42min完成反應(yīng), 可有效避免其他擴(kuò)增技術(shù)的缺點(diǎn), 更加靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)、方便[32]。因此,在反應(yīng)條件和時間方面, 等溫擴(kuò)增MIRA技術(shù)比起普通的PCR, 要更加適合于現(xiàn)場的快速檢測。

綜上所述, 本研究建立的CRISPR/Cas13a-MSRV檢測方法不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器, 可使現(xiàn)場檢測變得快速、準(zhǔn)確且方便。因此, 在實(shí)際養(yǎng)殖過程中如果采用該種檢測方法對MSRV進(jìn)行及時的發(fā)現(xiàn), 并采取針對性的有效措施, 這在很大程度上能夠減少養(yǎng)殖過程中病害帶來的損失, 并且該檢測方法快捷、靈敏度高、特異性高, 具有較大的應(yīng)用和推廣前景。