4種葡萄SOD家族基因鑒定與表達分析

摘要：" 超氧化物歧化酶（SOD）在植物體氧化與抗氧化平衡中起至關重要的作用。本研究對4種葡萄SOD家族基因進行了全基因組鑒定和表達分析。鑒定結果顯示，4種葡萄共有45個SOD基因，其中黑比諾葡萄12個、山葡萄8個、河岸葡萄15個、圓葉葡萄10個，SOD基因隨機分布在染色體上;葡萄SOD基因啟動子中有多個激素、生長發育、逆境脅迫等響應順式作用元件;種內共線性分析結果顯示，黑比諾葡萄、山葡萄和河岸葡萄SOD基因中僅含有1對共線性關系，而圓葉葡萄SOD基因中含有6對共線性關系;qRT-PCR結果表明VaSOD基因對氯化鈉（NaCl）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）、低溫（4 ℃）等不同非生物脅迫的響應明顯。4種葡萄SOD基因之間堿基序列相對保守，親緣關系較近。本研究結果為進一步解析葡萄SOD 家族基因在其生長發育和非生物脅迫應答中的作用機理奠定了基礎。

關鍵詞：" 葡萄;SOD基因;基因家族;生物信息學;表達分析

中圖分類號：" S663.1""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2334-15

收稿日期：2024-01-12

基金項目：國家自然科學基金項目（32060671）;2021甘肅省青年人才托舉工程項目（GXH20210611-01）;甘肅農業大學大學生創新創業訓練計劃項目（S202110733035）

作者簡介：梁" 靖（2000-），女，甘肅武威人，碩士研究生，主要從事果樹生理與生物技術方面的研究。（E-mail）1436387524@qq.com

通訊作者：褚明宇，（E-mail）chu.my@foxmail.com

梁" 靖，王調葉，劉雅詩，等. 4種葡萄SOD家族基因鑒定與表達分析［J］. 江蘇農業學報，2024，40（12）：2334-2348.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.017

Identification and expression analysis of SOD family genes in four kinds of grapes

LIANG Jing，" WANG Tiaoye，" LIU Yashi，" SUN Yingying，" CHEN Baihong，" CHU Mingyu

（College of Horticulture， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Abstract：" Superoxide dismutase （SOD） plays an important role in the balance between oxidation and antioxidation in plants. In this study， the whole genome identification and expression analysis of SOD family genes in four kinds of grapes were carried out. The identification results showed that there were 45 SOD genes in the four kinds of grapes， including 12 genes in Pinot Noir， eight genes in Vitis amurensis， 15 genes in Vitis riparia and 10 genes in Vitis rotundifolia. The SOD genes were randomly distributed on chromosomes. There were many cis-acting elements in the promoter of grape SOD gene， such as hormones， growth and development， stress response and so on. The results of intraspecific collinearity analysis showed that there was only one pair of collinearity in the SOD genes of Pinot Noir， Vitis amurensis and Vitis riparia， while there were six pairs of collinearity in the SOD genes of Vitis rotundifolia. The results of qRT-PCR showed that the VaSOD gene responded significantly to different abiotic stresses such as sodium chloride （NaCl）， salicylic acid （SA）， abscisic acid （ABA） and low temperature （4 ℃）. The base sequence of SOD genes in four kinds of grapes was relatively conservative and the genetic relationship was relatively close. The results of this study can lay a foundation for further analysis of the mechanism of grape SOD family genes in their growth and development and abiotic stress response.

Key words：" grape;SOD gene;gene family;bioinformatics;expression analysis

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內的一種抗氧化金屬酶。按照SOD中金屬輔基的不同，可將SOD分為4大類，分別為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD ，其活性可以影響植物生長發育、細胞膜結構功能的穩定性以及植物的抗逆性。SOD能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在植物體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用。研究發現，干旱、低溫、鹽堿等非生物脅迫會導致植物細胞中產生活性氧，而過量的活性氧會導致植物細胞受到損傷，甚至導致不可修復的代謝功能障礙和細胞死亡。因此，在植物生長發育和進化過程中會形成酶和非酶抗氧化保護系統以清除活性氧。SOD是清除植物體內氧自由基的關鍵酶。

Cu/Zn-SOD最早從魚發光桿菌中分離得到，廣泛存在于細菌、真菌、植物體和動物體內，與抗寒、抗旱、耐鹽堿等多種抗逆性密切相關。研究結果表明，在擬南芥和西葫蘆中過表達SOD基因可提高抗寒能力;馬鈴薯植株在低溫脅迫下，超氧化物歧化酶（SOD）活性是正常溫度下的1.38倍;轉SOD基因木薯在低溫下可通過提高SOD活性來清除活性氧并激活機體抗氧化防御機制，從而提高機體對寒冷的耐受性;鉛、鋅、銅、汞等重金屬污染在超過耐受濃度時會對植物體內SOD活性產生顯著影響;MSD1是一種獨特的高爾基體/質體類型的錳超氧化物歧化酶，水稻的MSD1基因會導致水稻植株對熱脅迫非常敏感，在干旱條件下，不耐旱品種苜蓿根莖中SOD活性低于耐旱品種，說明植物的抗旱性可能與SOD活性有關。低溫脅迫時，玉米中SOD活性呈現先緩慢增長后下降再增長的趨勢，這表明，在一定范圍內玉米可以通過調節自身的酶系統來抵御低溫脅迫造成的傷害。近年來，葡萄的生長發育不斷受到低溫、干旱、鹽堿等非生物因素的影響，造成了一定的經濟損失。黑比諾葡萄（Vitis vinifera）是全球現存最古老的葡萄品種之一，2007年法國和意大利聯合科學家團隊采用全基因組鳥槍法首次對黑比諾葡萄全基因組進行測序組裝，并經過多次更新。山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是世界上被廣泛應用的抗寒葡萄資源，能作為抗寒育種的良好親本。河岸葡萄（Vitis riparia）在北美廣泛分布，抗葡萄根瘤蚜和根結線蟲等。圓葉葡萄（Muscadinia rotundifolia）是世界公認的抗病性葡萄品種，也是目前唯一檢測到含鞣花酸的葡萄品種，鞣花酸具有抗癌功效。中國北方地區光照充足、晝夜溫差大，是優質葡萄栽培區，但冬季氣候寒冷干燥，凍害是限制該地區葡萄種植及產業高質量發展的主要因素之一。研究葡萄抗寒機制對于提高葡萄抗寒性及葡萄產業提質增效具有重要意義，而SOD活性是研究植物逆境脅迫的重要指標之一。山葡萄在冬季-45～-40 ℃能安全越冬，抗寒能力遠高于其他葡萄品種，還可作為砧木提高嫁接品種的抗寒性。因此本研究利用黑比諾葡萄、山葡萄、河岸葡萄、圓葉葡萄的基因組數據進行SOD家族基因的生物信息學分析，并進一步分析了山葡萄SOD基因在非生物脅迫和激素處理下的響應表達模式，為葡萄SOD基因家族成員功能研究和應用提供依據。

1" 材料與方法

1.1" 材料處理

本試驗所用材料為山葡萄試管苗，由甘肅農業大學園藝學院組培室提供。山葡萄試管苗培養于GS固體培養基中，附加30 g/L蔗糖，置于培養箱（溫度25 ℃/光照16 h，溫度22 ℃/黑暗8 h）中。挑選生長健壯且長勢一致的組培苗，分別繼代培養在含有100 μmol/L脫落酸（ABA）、100 μmol/L水楊酸（SA）、100 μmol/L氯化鈉（NaCl）和加了清水的GS液體培養基中，低溫脅迫處理在植物培養箱中進行，溫度為4 ℃，處理時間分別為0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，每個處理重復3次。處理結束后，取樣品并放入-80 ℃冰箱中備用。

1.2" 葡萄SOD基因家族的鑒定

下載黑比諾葡萄、山葡萄、河岸葡萄和圓葉葡萄基因組和注釋信息文件。利用TBtools軟件提取葡萄的所有蛋白質氨基酸序列并與AtSOD家族蛋白質氨基酸序列進行比對，初步獲取葡萄SOD基因家族成員。通過NCBI數據庫中蛋白質聚類信息進行BLAST比較篩選得到SOD蛋白質氨基酸序列，用PFAM和SMART兩個軟件去除不含保守結構域的氨基酸序列，共鑒定出45個葡萄SOD家族基因。

1.3" 葡萄SOD蛋白理化性質、亞細胞定位預測及二級結構分析

葡萄SOD蛋白理化性質和亞細胞定位分別使用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）、PSORT（http：//psort.hgc.jp/）進行分析和預測。葡萄SOD家族蛋白質二級結構占比通過SOPMA進行預測。

1.4" 葡萄SOD家族基因系統發育樹、基因結構和motif分析

利用Clustal X對4種葡萄、擬南芥、番茄、水稻SOD家族蛋白質氨基酸序列進行分析，并通過MEGA-X構建系統發育樹，設置1 000重復值，并使用在線工具iTOL v6（https：// itol. embl.de/）進行美化。基因結構通過TBtools 1.6進行可視化，SOD家族氨基酸序列利用工具MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對保守基序進行分析（設置10個motif）。

1.5" 葡萄SOD家族基因順式作用元件分析

使用TBtools 1.6提取所有葡萄SOD家族基因的順式作用元件區域，將所得結果利用在線軟件Plant CARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和TBtools 1.6分別進行預測分析和可視化。

1.6" 葡萄SOD家族基因染色體定位、密碼子偏好性及共線性分析

利用TBtools 1.6提取染色體信息，繪制目標基因的染色體圖譜。利用編碼序列（CDS）計算密碼子使用偏好，主要參數為多物種密碼子偏好性（RSCU）、密碼子適應性指數（CAI）、密碼子偏好性指數（CBI）、最優密碼子使用頻率（Fop）、有效密碼子數（Nc）、同義密碼子第3位堿基中G+C含量（GC3s）、鳥嘌呤-胞嘧啶含量（GC）;用TBtools 1.6對共線性基因進行分析和定位。

1.7" 非生物脅迫及外源激素處理下山葡萄SOD基因的表達分析

在生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成8個山葡萄基因的qPCR引物（表1）。在4 ℃條件下，以SA、ABA、乙烯和NaCl處理下的山葡萄試管苗為材料提取RNA，通過試劑盒（Prime Script RT reagent Kit，Perfect Real Time，TaKaRa）轉化為cDNA。以cDNA 2 μL、上游＋下游引物2 μL、SYBR酶 10 μL、ddH2O去離子水6 μL作為反應體系，通過PCR儀（Light Cycler 96 Real-Time PCR System，Roche）分析，使用TBtools 1.6進行可視化。

2" 結果與分析

2.1" 葡萄SOD家族基因鑒定及其編碼的蛋白質性質

通過同源篩選，４種葡萄共鑒定出45個SOD基因（表2），其中黑比諾葡萄SOD基因（VvSOD） 12個、山葡萄SOD基因（VaSOD）8個、河岸葡萄SOD基因（VrSOD）15個、圓葉葡萄SOD基因（VmSOD）10個，根據其染色體位置信息命名為VvSOD1～VvSOD12、VaSOD1～VaSOD8、VrSOD1～VrSOD15以及VmSOD1～VmSOD10。理化特性分析結果表明，VmSOD蛋白氨基酸序列長度介于152 aa至322 aa之間，其中VmSOD1最長;等電點介于5.48至9.05之間；其中VmSOD2、VmSOD5蛋白為堿性蛋白質，其余為酸性蛋白質；VmSOD1、VmSOD3、VmSOD4蛋白為疏水蛋白質，其余為親水蛋白質。VrSOD蛋白氨基酸序列長度介于122 aa至322 aa之間，其中VrSOD1最長;等電點介于5.33至8.79之間，其中VrSOD3、VrSOD4、VrSOD6和VrSOD7蛋白為堿性蛋白質，其余為酸性蛋白質;VrSOD蛋白大部分為親水蛋白質，只有VrSOD1和VrSOD2蛋白為疏水蛋白質。VvSOD蛋白氨基酸序列長度為79～352 aa，其中VvSOD5最長;等電點為4.89～9.07，其中VvSOD2、VvSOD4和VvSOD5蛋白為堿性蛋白質，其余為酸性蛋白質;VvSOD蛋白大多數為親水蛋白質，只有VvSOD1、VvSOD3和VvSOD8蛋白為疏水蛋白質。VaSOD蛋白長度介于146 aa至511 aa之間;等電點介于5.42至9.45之間，其中VaSOD1、VaSOD6、VaSOD7、VaSOD8蛋白為酸性蛋白質，VaSOD2、VaSOD3、VaSOD4和VaSOD5蛋白為堿性蛋白質;VaSOD蛋白大部分為親水性蛋白質，只有VaSOD1蛋白為疏水蛋白質。亞細胞定位預測結果顯示，４種葡萄SOD家族基因編碼的蛋白質主要位于線粒體、細胞質和葉綠體中。

二級結構預測結果（表3）表明，所有基因編碼的蛋白質均無β-折疊，主要為α-螺旋、無規則卷曲、拓展鏈結構和β-轉角。圓葉葡萄α-螺旋介于3.95%至46.07%之間，無規則卷曲介于32.89%至55.77%之間，拓展鏈結構介于11.80%至33.55%之間，β-轉角介于3.79%至9.05%之間;河岸葡萄α-螺旋介于3.29%至51.75%之間，無規則卷曲介于29.39%至59.02%之間，拓展鏈結構介于12.42%至34.87%之間，β-轉角介于3.21%至9.02%之間;黑比諾α-螺旋介于2.63%至52.19%之間，無規則卷曲介于29.82%至60.00%之間，拓展鏈結構介于11.44%至34.21%之間，β-轉角介于4.82%至10.53%之間;山葡萄α-螺旋介于3.95%至46.08%之間，無規則卷曲介于33.27%至55.26%之間，拓展鏈結構介于12.09%至36.30%之間，β-轉角介于2.94%至8.41%之間。總之，葡萄SOD家族基因編碼的蛋白質二級結構無規則卷曲和α-螺旋占比較大，β-轉角占比最小，推測這可能是葡萄SOD家族基因編碼的蛋白質二級結構的特點。

2.2" 不同物種SOD家族基因系統進化樹

經過鑒定的12個黑比諾葡萄、8個山葡萄、10個圓葉葡萄、15個河岸葡萄SOD基因和從NCBI中獲取的8個番茄、19個擬南芥、9個水稻SOD基因，將這81個SOD基因利用軟件MEGA X構建系統進化樹（圖1），根據其親緣關系的遠近將81個SOD基因分為5個亞族，其中第Ⅰ亞族中含有27個成員，第Ⅱ亞族中含有13個成員，第Ⅲ亞族中僅含有1個成員，第Ⅳ亞族中含有5個成員，第Ⅴ亞族中含有35個成員。VaSOD4、VaSOD7、VaSOD8、VvSOD5、VvSOD12、VrSOD5、VrSOD6、VrSOD14、VrSOD15、VmSOD10位于第Ⅰ亞家族;VaSOD2、VaSOD5、VrSOD3、VrSOD7、VvSOD2、VvSOD6、VmSOD2、VmSOD6位于第Ⅱ亞家族;VvSOD1、VrSOD1、VmSOD1位于第Ⅳ亞家族;VrSOD的9個成員和VvSOD的7個成員、VmSOD的6個成員以及VaSOD的3個成員位于第Ⅴ亞家族。4種葡萄的SOD基因與水稻、番茄的SOD基因親緣關系較近，推測這3個物種的SOD基因在功能方面可能具有一定相似性。

2.3" 葡萄SOD家族基因的染色體定位和共線性分析

利用TBtools進行染色體定位分析（圖2）。河岸葡萄VrSOD基因定位在7條染色體上，其中2號、8號和13號染色體上各有1個基因，6號、10號和16號染色體上均有2個基因，14號染色體上基因分布最多，有6個基因，占河岸葡萄SOD總基因數的40%。圓葉葡萄VmSOD基因定位在6條染色體上，其中2號、8號、13號和16號染色體上各分布1個基因，6號和14號染色體上均有3個基因。山葡萄VaSOD家族基因不均勻地分布在6條染色體上，6號和16號染色體上各有2個基因，8號、10號、13號和14號染色體上各有1個基因。黑比諾葡萄VvSOD基因定位在7條染色體上，2號、8號、10號、13號和16號染色體上各有1個基因，6號染色體上有2個基因，14號染色體上基因分布最多，有5個基因，占黑比諾葡萄SOD總基因數的41.67%。河岸葡萄、圓葉葡萄和黑比諾葡萄SOD基因均在14號染色體上基因分布最多。為了進一步了解基因家族的進化關系，本研究使用TBtools的MCScanX工具進行了種內共線性分析（圖3）。圓葉葡萄VmSOD家族基因有6對共線性關系，位于2號染色體、6號染色體、13號染色體、14號染色體和16號染色體上，分別是VmSOD1/VmSOD3、VmSOD2/VmSOD6、VmSOD3/VmSOD9、VmSOD7/VmSOD8、VmSOD7/VmSOD9和VmSOD6/VmSOD10，其中VmSOD3、VmSOD6、VmSOD7和VmSOD9有2個串聯重復序列，這些結果表明部分VmSOD基因可能是通過基因重復產生的，它們可能具有相似的功能;黑比諾葡萄VvSOD家族基因有1對共線性關系，位于染色體14上，為VvSOD7/VvSOD11;山葡萄VaSOD家族基因有1對共線性關系，位于6號染色體和13號染色體上，為VaSOD2/VaSOD5;河岸葡萄VrSOD家族基因有1對共線性關系，位于6號染色體和13號染色體上，為VrSOD3/VrSOD7。

2.4" 葡萄SOD家族基因結構和保守基序motif分析

葡萄SOD基因共分為3個亞族，各亞族間的motif差異較大（圖4）。第Ⅰ亞族有24個基因，大部分基因N端是motif9，C端是motif2，除了VvSOD1、VrSOD1、VmSOD1不含motif 1和motif 2，其他均含有motif 1和motif 2，且第Ⅰ亞族中13個基因含有motif 1、motif 2、motif 3和motif 9，占該組所有成員的54.17%;5個基因含有motif 1、motif 2、motif3和motif 4。第Ⅱ亞族僅有3個基因，且僅含有motif 1、motif 3。第Ⅲ亞族motif的數量和種類較多，共含有7種基序，分別是motif 2、motif 4、motif 5、motif 6、motif 7、motif 8、motif 10，其中VmSOD10、VaSOD7、VrSOD14、VrSOD15、VvSOD12和VaSOD8的motif結構相似。在同一亞族中基因motif的種類和數量相似，但同一亞族不同分支間motif的種類和數量有差異。總之，4種葡萄SOD基因中堿基序列相對保守，基序種類、數量和分布差異較小。根據基因結構分析，第Ⅰ亞族中12基因不含非翻譯區，內含子數量為4～7個;VvSOD1、VrSOD1和VmSOD1含有4個內含子，且VvSOD1和VmSOD1具有相似的內含子分布和長度，大多數基因含有7個內含子，VvSOD10編碼序列長度最長。第Ⅱ亞族中的3個基因都不含非翻譯區，內含子數量2～4個，其中VrSOD9含有4個內含子，且堿基序列在該亞族中長度最長。第Ⅲ亞族中僅有5個基因含有非翻譯區，除VmSOD2不含內含子，其他均含有5個以上內含子，其中VaSOD8含有11個內含子。結果表明，同一亞家族不同基因之間的基因結構相似，但并不完全相同，這可能是由于 SOD基因功能的多樣性以及在進化過程中發生了變異。

2.5" 葡萄SOD基因順式作用元件

為了進一步明確葡萄SOD家族基因的潛在功能，本研究分析了上游2 kb區域的順式作用元件（圖5）。結果表明，VmSOD、VrSOD、VvSOD和VaSOD均含有4種順式作用元件，包括光響應元件、激素響應元件、防御和應激響應元件以及生長發育相關元件。多數基因含有ABA響應元件，其中VvSOD6、VvSOD10、VaSOD7、VmSOD6和VaSOD5居多，VvSOD6和VvSOD10含有5個，VmSOD6和VaSOD5含有6個，VaSOD7含有7個。在山葡萄中，VaSOD含有較多的ABA和赤霉素（GA）響應元件，在河岸葡萄、黑比諾和圓葉葡萄中生長素、赤霉素和水楊酸響應元件相對較少。防御和脅迫響應元件包括低溫、干旱、厭氧誘導等，除VaSOD6、VvSOD8、VmSOD10和VrSOD3不含厭氧誘導響應元件外，其他均含有厭氧誘導響應元件，其中VrSOD8最多，數量為4個，推測SOD在厭氧誘導中起著重要的調控作用。綜上，4種葡萄SOD家族基因不僅可以進行正常的轉錄活動，還可以參與光響應、激素響應、應激響應和生長發育。

2.6" 葡萄SOD家族基因的密碼子偏好性

為了解SOD基因在植物中的進化情況，本研究系統分析了SOD家族基因在4種葡萄中相對同義密碼子的使用頻率（圖6）。結果發現，在4種葡萄的SOD家族基因中，UUC、CUU、AUG、AUU、GUU、UCU、UCC、CCU、ACU、GCU、UGA、CAU、CAG、AAU、GAU、AGA、AGG、GGU和GGA等19個密碼子的同義密碼子相對使用度（RSCU）≥1，其中11個密碼子以U結尾，3個密碼子以A結尾，3個密碼子以G結尾，2個密碼子以C結尾，這表明葡萄SOD基因中密碼子第3個堿基更傾向于U。此外，CUU和AGA在4種葡萄SOD基因中均表現出強烈的偏好性，GAU在河岸葡萄SOD基因中的偏好性最強（圖6a）。根據分析發現，葡萄SOD家族基因密碼子適應指數（CAI）、密碼子偏好性指數（CBI）和最優密碼子使用頻率（Fop）的平均值分別為0.212 5、-0.012 5和0.412 5。4種葡萄SOD基因的G+C含量和同義密碼子第3位堿基中G+C含量（GC3s）均小于0.5，說明葡萄SOD基因不偏好于使用G、C堿基;葡萄SOD家族基因的有效密碼子數目（Nc）值在50.06～52.45，平均值為51.405 0，說明在該家族基因中每個密碼子都被平均使用（圖6b）。

實時熒光定量PCR（qRT- PCR）結果表明，VaSOD家族基因在NaCl、ABA、SA和低溫誘導下，不同基因對不同非生物脅迫響應表達模式有差異（圖7）。NaCl處理下，除VaSOD3的相對表達量隨處理時間（3～48 h處理期間）的增加逐漸下降外，其他基因表達量隨處理時間的增加波動較大，VaSOD2在48 h時達到高峰，其表達量是對照（對照為1）的7.94倍。在ABA處理下，VaSOD6的相對表達量隨處理時間的增加而增加，VaSOD4在48 h時達到高峰，表達量是對照的9.57倍，VaSOD6在48 h時達到高峰，表達量是對照的7.24倍。SA處理下，VaSOD2的相對表達量在0～24 h隨處理時間的增加呈上調表達，且在24 h時達到高峰，VaSOD6在48 h時表達量達最高值，是對照的4.51倍。在4 ℃低溫處理下，VaSOD4和VaSOD6的相對表達量在48 h時達到峰值，其表達量分別是對照的6.87倍和8.12倍。qRT-PCR結果表明，鹽脅迫、2種激素和低溫脅迫均能誘導葡萄SOD基因不同程度表達，且VaSOD2、VaSOD4、VaSOD6多在處理48 h時達到峰值。

3" 討論

超氧化物歧化酶（SOD）是植物抗氧化系統的關鍵酶，可有效保護細胞和機體本身，增強植物在逆境脅迫下的耐受能力。本研究對4種葡萄SOD基因的全基因組、系統發育關系、基因結構、保守基序、染色體定位、共線性、密碼子使用偏好、順式作用元件和表達模式進行了綜合分析，從歐洲葡萄黑比諾葡萄中鑒定出12個SOD基因，從山葡萄中鑒定出8個SOD基因，從河岸葡萄中鑒定出15個SOD基因，從圓葉葡萄中鑒定出10個SOD基因。從前人研究結果可知，目前在毛竹中發現7個SOD基因，番茄中9個，谷子中8個，水稻中9個，大豆中13個，辣椒中15個，油菜中32個，由此可見，在不同物種中SOD基因數目存在較大差異。理化性質分析結果表明，4種葡萄SOD基因編碼的蛋白質大部分為酸性蛋白質，只有13個基因編碼的蛋白質為堿性蛋白質，大部分基因編碼的蛋白質為親水性蛋白質，在植物中功能保持相對穩定，這與郭棟等對油菜SOD家族基因生物信息學分析的結果相一致。4種葡萄不同基因的染色體定位及其編碼的蛋白質長度、相對分子量、等電點、親水性等特征均有差異，但蛋白質二級結構均以α螺旋和無規則卷曲為主，無β-折疊;亞細胞定位預測結果表明4種葡萄SOD基因編碼的蛋白質主要定位于葉綠體、線粒體和細胞質中，這與綠豆SOD家族基因編碼的蛋白質主要定位在葉綠體中的結果相似，也為葡萄SOD酶生物學功能的研究提供了基礎信息。

4種葡萄SOD基因保守性較強，在進化中沒有太大的分化，且與水稻和番茄的親緣關系較近。據此推測，這3個物種的SOD家族基因并沒有發生太大的分化，而是相對保守的。在保守基序分析中發現4種葡萄的基序存在一些差異，因此推測該家族基因在進化過程中存在一定的變異。基因復制在生物進化過程中發揮著重要作用，包括串聯復制、局部復制和全基因組復制。本研究中SOD基因染色體定位結果顯示，不同葡萄SOD基因在染色體上的分布大多呈兩端分布，并且一些基因在染色體上形成基因簇，根據位置及序列信息，推測它們是串聯重復基因。種內共線性分析結果顯示，黑比諾葡萄、山葡萄和河岸葡萄分別僅有1對基因為共線性關系，而圓葉葡萄中有6對基因為共線性關系，由此推測串聯重復和片段重復是葡萄SOD基因家族成員數量擴增的主要方式。

當植物遭受干旱、高溫、低溫、鹽堿等外界非生物脅迫時，脅迫信號會通過轉導機制整合到信號因子中，并激活相應的轉錄因子，加上相應的順式作用元件啟動相應的基因表達和對脅迫的反應。例如，ABA響應元件（ABREs）可以響應ABA、干旱和鹽脅迫;LTR參與低溫響應和調控;MYB可以響應各種應激信號和應激調控，調控相應基因。本研究分析了葡萄45個SOD 基因的上游2 kb順式作用元件，結果發現VmSOD、VrSOD、VvSOD和VaSOD均含有光響應元件、激素響應元件、防御和應激響應元件、生長發育相關元件，這表明葡萄SOD家族基因對植物生長發育有顯著調控作用。其中，光響應元件、ABA響應元件和生長素響應元件在SOD基因的作用元件中占很大比例，已有研究結果表明在3種薔薇科植物中SOD酶活性與激素及光響應密切相關，由此推測葡萄中SOD酶活性與ABA、SA及光響應密切相關。

根據系統發育關系可見，位于同一分支上的基因其保守基序和順式作用元件的種類和數量相似，如分布于第Ⅴ亞族同一個分支的4種葡萄SOD基因均含有motif 1，且大都包含厭氧響應元件和ABA響應元件，推測這些基因可能作為正調控因子參與了ABA信號響應;已有研究結果表明位于同一亞族的基因，由于基因結構和保守基序相似，在功能方面也具有相似性，因此推測和VaSOD3在同一分支的VrSOD4、VvSOD4、VmSOD5可能也參與ABA信號響應;分布于第Ⅳ亞族同一分支的3個葡萄SOD成員均含有motif 3、motif 6、motif 10，且都包含4個MeJA響應元件、2個ABA響應元件、1個SA響應元件和3個厭氧響應元件，推測這些基因可能作為正調控因子參與了ABA、MeJA和SA信號響應;在ABA脅迫下，只有VaSOD7表達受到抑制（5個ABA脅迫時間下VaSOD7相對表達量均小于1），推測VaSOD7是ABA信號和非生物脅迫的負調控基因。

密碼子使用偏好性分析也有助于理解進化關系。本研究通過對8個山葡萄、12個黑比諾葡萄、15個河岸葡萄和10個圓葉葡萄SOD家族基因的密碼子使用偏好性進行分析，結果表明，CUU和AGA在4種葡萄SOD基因中均表現出強烈的偏好性，而GAU在河岸葡萄SOD基因中的偏好性最強，且4種葡萄在密碼子使用上不同基因間存在差異，不偏好于使用G、C堿基。密碼子偏好性的研究可為葡萄轉基因和密碼子優化提供理論支持。

4" 結論

本研究鑒定到45個葡萄SOD家族基因，并對這些基因的結構和motif、順式作用元件、系統發育樹、染色體定位、密碼子偏好性、共線性及編碼的蛋白質理化性質等進行了詳細分析。其中保守基序分析結果表明，4種葡萄SOD家族基因在進化過程中具有較高的保守性，此外，VaSOD2、VaSOD4、VaSOD6在ABA、SA、NaCl、低溫等逆境脅迫應答過程中具有重要功能。總之，本研究結果豐富和深化了對葡萄SOD家族基因的認識，為進一步研究葡萄SOD基因在非生物脅迫下的抗性機制奠定了基礎。

參考文獻：

郭" 笑，苑廣信，王曼力，等. 番茄超氧化物歧化酶的生物信息學分析. 北方園藝，2016（21）：97-101.

魏" 婧，徐" 暢，李可欣，等. 超氧化物歧化酶的研究進展與植物抗逆性. 植物生理學報，2020，56（12）：2571-2584.

宗" 琪，張生才，范國泰，等. 聚-γ-谷氨酸對柑橘苗木性狀和GABA的影響. 華中農業大學學報，2020，39（5）：108-114.

MAO H J， WEN Y Y， YU Y H. Ignored role of polyphenol in boosting reactive oxygen species generation for polyphenol/chemodynamic combination therapy. Materials Today Bio，2022，16：100436.

ANTHONY D， PAPANICOLAOU A ， WANG H. et al. Excessive reactive oxygen species inhibit IL-17A + γδ T cells and innate cellular responses to bacterial lung infection. Antioxidants amp; Redox Signaling，2019，32（13）：943-956.

周雪婷，梁國平，盧世雄，等. 葡萄醛酮還原酶（AKR）基因家族的鑒定與表達分析. 西北植物學報，2022，42（11）：1851-1861.

DU J， ZHU Z， LI W C. Over-expression of exotic superoxide dismutase gene Mn-SOD and increase in stress resistance in maize. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2006，32（1）：57-63.

夏民旋，王" 維，袁" 瑞，等. 超氧化物歧化酶與植物抗逆性. 分子植物育種，2015，13（11）：2633-2646.

AENGWANICH W， WANDEE J. The effect of increased ambient temperature on Hsp70， superoxide dismutase， nitric oxide， malondialdehyde， and caspase activity in relation to the intrinsic and extrinsic apoptosis pathway of broiler blood cells. Journal of Thermal Biology，2022，105：103211.

張靜文，張力文，嚴云香，等. 草海桐銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆及序列分析. 西南農業學報，2022，35（2）：425-431.

LIN K H，SEI S C，SU Y H， et al. Overexpression of the Arabidopsis and winter squash superoxide dismutase genes enhances chilling tolerance via ABA-sensitive transcriptional regulation in transgenic Arabidopsis. Plant Signaling amp; Behavior，2019，14（12）：1685728.

CHE Y Z， ZHANG N， ZHU X， et al. Enhanced tolerance of the transgenic potato plants overexpressing Cu/Zn superoxide dis-mutase to low temperature. Scientia Horticulturae，2020，261：108949.

XU J， YANG J， DUAN X G，et al. Increased expression of native cytosolic Cu/Zn superoxide dismutase and ascorbate peroxidase improves tolerance to oxidative and chilling stresses in cassava （Manihot esculenta Crantz）. BMC Plant Biology，2014，14（1）：208.

吳嘉煜，米" 楠. 重金屬對植物抗氧化酶影響研究進展. 浙江農業科學，2022，63（6）：1177-1181.

SHIRAYA T， MORI T， MARUYAMA T， et al. Golgi/plastid-type manganese superoxide dismutase involved in heat-stress tolerance during grain filling of rice. Plant Biotechnology Journal，2015，13（9）：1251-1263.

SONG X S， WANG Y J， MAO W H， et al. Effects of cucumber mosaic virus infection on electron transport and antioxidant system in chloroplasts and mitochondria of cucumber and tomato leaves. Physiologia" Plantarum，2009，135（3）：246-257.

于海瑞. 低溫脅迫下玉米幼苗的幾種生理生化指標的變化. 吉林農業，2017（12）：66.

張利鵬，劉懷鋒，辛海平. 葡萄抗寒機制研究進展. 果樹學報，2023，40（2）：350-362.

李婉瑩，馬乃膺，左存武，等. 葡萄CR4類受體激酶基因家族的鑒定及表達分析. 果樹學報，2022，39（4）：518-531.

JAILLON O， AURY J M， NOEL B，et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature，2007，449（7161）：463-467.

GIROLLET N， RUBIO B， LOPEZ-ROQUES C， et al. De novo phased assembly of the Vitis riparia grapevine genome. Scientific Data，2019，6（1）：127.

樊秀彩，張" 穎，姜建福，等. SSR分子標記鑒定山葡萄和河岸葡萄種間雜種. 西北植物學報，2012，32（11）：2195-2200.

張" 丹，蔣振華，張海平，等. 桂北地區圓葉葡萄的引種表現及栽培技術. 現代農業科技，2018（10）：81-82.

LARKIN M A， BLACKSHIELDS G， BROWN N P， et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics，2007，23（21）：2947-2948.

KUMAR S， STECHER G， LI M. MEGA X： molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution，2018，35（6）：1547-1549.

CHEN C J， CHEN H， ZHANG Y， et al. TBtools：an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

蔡" 凱. 毛竹SOD基因家族生物信息學與功能分析． 杭州：浙江農林大學，2018.

馮" 坤. 番茄SOD基因家族的全基因組鑒定及鹽脅迫下表達分析. 南京：南京農業大學，2017.

趙" 艷，生云龍，宋亞菲，等. 谷子超氧化物歧化酶基因家族生物信息學分析. 中國農業科技導報，2018，20（8）：1-6.

劉家林，歐陽林娟，曾嘉麗，等. 水稻SOD基因家族的全基因組分析及逆境脅迫下表達研究. 分子植物育種，2018，16（9）：2753-2760.

LU W X， DUANMU H Z， QIAO Y H，et al. Genome-wide identification and characterization of the soybean SOD family during alkaline stress. PeerJ，2020，8（W1）：e8457.

朱冉冉，吉雪花，張中榮，等. 辣椒超氧化物歧化酶基因家族的生物信息學分析. 石河子大學學報（自然科學版），2020，38（6）：712-717.

郭" 棟，張艷陽，杜" 媚，等. 油菜超氧化物歧化酶基因家族生物信息學分析. 分子植物育種，2020，18（2）：367-373.

朱雪天，黃" 勇，盧" 有，等. 綠豆SOD基因的生物信息學分析及鹽脅迫下的表達分析. 分子植物育種，2023，21（15）：4886-4894.

XU G X， GUO C C， SHAN H Y， et al. Divergence of duplicate genes in exon-intron structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（4）：1187-1192.

HADIARTO T， TRAN L S . Progress studies of drought-responsive genes in rice. Plant Cell Reports，2011，30（3）：297-310.

SHINOZAKI K， YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. Gene expression and signal transduction in water-stress response. Plant Physiology，1997，115（2）：327-334.

LI W， CUI X， MENG Z L， et al. Transcriptional regulation of arabidopsis MIR168a and ARGONAUTE1 homeostasis in abscisic acid and abiotic stress responses. Plant Physiology，2012，158（3）：1279-1292.

MAESTRINI P， CAVALLINI A， RIZZO M， et al. Isolation and expression analysis of low temperature-induced genes in white poplar（Populus alba）. Journal of Plant Physiology，2009，166（14）：1544-1556.

HARTMANN U， SAGASSER M， MEHRTENS F， et al. Differential combinatorial interactions of cis-acting elements recognized by R2R3-MYB， BZIP， and BHLH factors control light-responsive and tissue-specific activation of phenylpropanoid biosynthesis genes. Plant Molecular Biology，2005，57（2）：155-171.

LI G H， HU F， ZHANG Y， et al. Comparative genomic analysis of superoxide dismutase （SOD） genes in three Rosaceae species and expression analysis in Pyrus bretschneideri. Physiology and Molecular Biology of Plants，2021，27（1）：39-52.

GUO L L， LU S X， LIU T， et al. Genome-wide identification and abiotic stress response analysis of PP2C gene family in woodland and pineapple strawberries. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（4）：4049.

（責任編輯：黃克玲）