杉木不同器官中內生細菌的多樣性分析

摘要：" 為探明杉木不同器官中內生細菌的群落組成和特點，挖掘杉木豐富的微生物資源，并為篩選杉木中特色微生物資源提供理論依據，本研究采用Illumina Miseq平臺的高通量測序技術，對多年生杉木根、莖、葉中的內生細菌16S rDNA V3～V4高變區序列進行檢測，分析杉木不同器官中內生細菌的多樣性及其群落組成差異。擴增子序列變體（ASV）分析結果表明，杉木根、莖、葉中的ASV數量分別為7 108個、2 017個和1 911個。對杉木根、莖、葉中內生細菌進行分析，發現變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）為主要優勢菌門，相對豐度分別為67.930%、13.800%和6.250%；α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和放線菌綱（Actinobacteria）為主要優勢菌綱，相對豐度分別為41.180%、19.710%和11.180%；1174-901-12、P3OB-42和甲基桿菌屬（Methylobacterium）為主要優勢菌屬，相對豐度分別為14.430%、5.890%和5.300%。物種組成熱圖與主坐標分析（PCoA）結果表明，杉木根中的內生細菌菌群組成與莖、葉中的內生細菌菌群組成存在明顯差異，莖與葉中的內生細菌菌群組成相似。功能預測結果表明，多年生杉木根、莖、葉中內生細菌的代謝途徑主要為生物合成。多年生杉木根、莖、葉中存在豐富的內生細菌，根中的內生細菌多樣性、豐富度高于莖和葉。本研究揭示了杉木內生細菌的群落組成，可以為今后篩選、利用杉木內生細菌資源提供理論依據。

關鍵詞：" 杉木；內生細菌；高通量測序；多樣性；相對豐度

中圖分類號：" S791.27;Q938""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2367-10

收稿日期：2023-12-26

基金項目：福建省林業局重點項目（KLb21009B）；福建農林大學橫向科研項目（KH200200A、KH220045A）

作者簡介：孟" 磊（1997-），男，陜西榆林人，碩士研究生，研究方向為森林培育技術。（E-mail）m1941262819@163.com

通訊作者：林" 晗，（E-mail）fjlinhan@163.com

孟" 磊，林" 晗，丁新蘭，等. 杉木不同器官中內生細菌的多樣性分析［J］. 江蘇農業學報，2024，40（12）：2367-2376.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.020

Diversity analysis of endophytic bacteria in different organs of Cunninghamia lanceolata （Lamb.） Hook.

MENG Lei1，2，" LIN Han1，2，" DING Xinlan3，" XIE Anqiang1，4，" JIAN Lingjing1，2，" WANG Yingzi5，" CHEN Can1，4

（1.Forestry College， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China;2.Key Lab for Forest Ecosystem Processes and Management in Fujian Province， Fuzhou 350002， China;3.Fujian Shanghang Baisha Forestry Farm， Longyan 364200， China;4.College of JunCao Science and Ecology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China;5.Fuzhou Nature Reserve Planning and Development Center， Fuzhou 350002， China）

Abstract：" To explore the community composition and characteristics of endophytic bacteria in different organs of Cunninghamia lanceolata （Lamb.） Hook.， explore the rich microbial resources of C. lanceolata， and provide a theoretical basis for screening the characteristic microbial resources in C. lanceolata， the sequences of endophytic bacterial 16S rDNA V3-V4 high-variable regions in roots， stems and leaves of the perennial C. lanceolata were detected using high-throughput sequencing technology based on the Illumina Miseq platform. Moreover， the diversity and community structure of endophytic bacteria in different organs of C. lanceolata were analyzed. The results of amplicon sequence variant （ASV） analysis showed that the number of ASV in C. lanceolata roots， stems and leaves was 7 108， 2 017 and 1 911， respectively. Proteobacteria， Actinobacteria and Acidobacteria were the dominant bacteria in different organs of C. lanceolata， the relative abundances were 67.930%， 13.800% and 6.250%. Alphaproteobacteria， Gammaproteobacteria and Actinobacteria were the main dominant classes， with relative abundances of 41.180%， 19.710% and 11.180%， respectively. 1174-901-12， P3OB-42 and Methylobacterium were the main dominant genera， with relative abundances of 14.430%， 5.890% and 5.300%， respectively. The results of species composition heat map and principal coordinate analysis （PCoA） indicated that the composition of endophytic bacteria in the roots of C. lanceolata was significantly different from that in the stems and leaves， and the composition of endophytic bacteria in the stems and leaves was similar. The functional prediction results showed that the metabolic pathway of endophytic bacteria in roots， stems and leaves of perennial C. lanceolata was mainly biosynthesis. Rich endophytic bacteria were present in roots， stems and leaves of perennial C. lanceolata， and the diversity and abundance of endophytic bacteria in roots were higher than those in stems and leaves. This study reveals the community composition of endophytic bacteria in C. lanceolata， which can provide a theoretical basis for the screening and utilization of endophytic bacteria resources in C. lanceolata in the future.

Key words：" Cunninghamia lanceolata （Lamb.） Hook.;endophytic bacteria;high-throughput sequencing;diversity;relative abundance

杉木作為亞熱帶森林中最具優勢的經濟樹種，栽植面積廣，具有生長快、品質好、產量高等特點。植物內生細菌定殖于植物體內，參與植物生長發育的整個過程，與宿主植物構建長期的共生互利關系，是一種重要的微生物資源。植物內生細菌可以促進植物的生長，增強宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗力，對病原菌有一定的抑制作用，還具有解磷和固氮等作用，在醫藥、農業和林業等領域也具備十分廣泛的應用前景。因此，分析杉木不同器官中內生細菌的群落組成差異以及多樣性，對篩選和利用促生菌具有重要意義。

植物內生細菌對植物無害，通常寄生在健康植物細胞間隙，但也有一些可以進入細胞。已經發現有大量的內生細菌可以與植物組織形成一系列的互利共生關系。內生細菌的分布與植物的基因型、器官、生長階段等因素均有關，內生細菌的數量和類型因這些因素而異。目前研究植物微生物的方法主要有兩類，一類是依靠培養基或者在合適的培養條件下對植物微生物進行培養開發，另一類是不依賴培養的方法，直接對微生物進行DNA測序。傳統培養微生物的方法有很多限制，如不可培養、需要選擇性隔離以及培養的微生物數量較少等。有研究結果表明，大約99%的微生物是不可以進行培養的。Chen等使用傳統培養基方法從杉木根、莖、葉中只提取出14種溶磷內生細菌。通過高通量測序的方法分析從植物內生細菌中提取出來的DNA，這種方法可以快速確定復雜微生物群落的組成和多樣性，克服了大多數內生細菌不可培養的問題。陳美琪等基于高通量測序發現虎耳草內生細菌有很高的豐富度，根部內生細菌多樣性明顯高于莖部和葉部。呂佩等基于高通量測序技術發現刺山柑不同部位的內生細菌多樣性不同。近年來，利用高通量測序技術進行細菌分類學和系統發育研究已成為研究微生物群落多樣性的主要方法之一。

杉木作為中國南方重要的經濟樹種，關于杉木內生細菌群落結構及多樣性的研究較少，對于杉木不同器官中內生細菌群落組成及豐富度也所知甚少，大多數研究使用純培養的方式對微生物進行分析，對杉木內生細菌的多樣性和完整群落組成研究的幫助較少，而且無法準確挑選出具有較好促生作用的內生細菌。本研究擬以采自福建省龍巖市白砂國有林場的多年生大徑材杉木根、莖、葉為研究對象，采用擴增子測序技術對杉木根、莖、葉中的內生細菌群落的多樣性和結構進行分析，解析多年生杉木不同器官中內生細菌的多樣性及潛在功能，以期獲得更加全面的杉木內生細菌多樣性信息，為今后的杉木內生細菌開發奠定理論基礎。

1" 材料與方法

1.1" 研究區域概況

福建省龍巖市白砂國有林場位于東經116°36′47.13″，北緯25°8′58.67″，此地氣候為亞熱帶海洋性季風氣候，平均氣溫18.5～20.5 ℃，年平均降雨量為1 029～1 372 mm，年平均日照時數為1 809～2 064 h。全年氣候溫和，雨量豐富，全年無霜期300 d以上，冬無嚴寒，夏無酷暑。

1.2" 樣品采集

于2022年7月選取福建省龍巖市白砂國有林場多年生大徑材杉木根、莖和葉作為試驗樣品，研究杉木不同器官中內生細菌的多樣性。選取10株杉木，使用三點取樣法對每株杉木的根、莖和葉進行取樣，共30個樣品。將采集的樣品收集在無菌采樣袋中，放入裝有冰袋的泡沫箱中。杉木的根、莖和葉分別用GA、JB和YC表示。

1.3" 樣品的表面消毒

采集新鮮的樣品，用無菌水清洗，將其表面泥土等沖洗干凈并晾干，置于75.0%的乙醇溶液中30 s，并用蒸餾水沖洗3～5次；然后置于5.2%的次氯酸鈉溶液中分別浸泡1 min、2 min、3 min、4 min、5 min，使用無菌水沖洗3～5次。將最后一次沖洗的無菌水取100 μL涂布在營養瓊脂（NA）平板上作為對照組（37 ℃、72 h），觀察培養皿是否有菌落生長，若無，說明樣品表面消毒已經徹底，若有，則說明消毒不完全。使用此方法檢測滅菌是否完全，以選擇最佳的滅菌時間組合。

1.4" 樣品DNA提取與PCR擴增

使用細菌DNA試劑盒（Omega公司產品）提取樣品細菌的總DNA，并擴增細菌16S rDNA基因的V3～V4高變區。根據Dong等描述的方法進行PCR擴增，引物為：338F（5′-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），其中barcode是用來區分同一文庫中的不同樣品。PCR反應體系包括：0.25 μL Q5高保真度DNA聚合酶（2 U/μL）、5.00 μL反應緩沖液（×5）、5.00 μL GC緩沖液（×5）、2.00 μL 脫氧核糖核苷三磷酸（10 mmol/L）、2.00 μL DNA模板、8.75 μL 雙蒸水（ddH2O）以及正向和反向引物各1.00 μL（10 μmol/L）。PCR熱循環程序是在98 ℃下初始變性5 min，然后是28個循環，包括在98 ℃下變性30 s，在55 ℃下退火30 s，在72 ℃下延伸30 s，最后在72 ℃下延伸5 min。PCR產物經凝膠電泳分離，使用試劑盒對目標片段進行回收，送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行序列測定和分析。

1.5" 數據處理與分析

用Demux對原始序列數據進行解復用，然后使用Cutadapt插件切割引物，用DADA 2對序列進行質量過濾、降噪、合并和嵌合體去除。使用QIIME 2和R包（v4.2.1）進行序列數據分析。利用QIIME 2中的擴增子序列變體（ASV）表計算α多樣性估計值（Chao 1指數、Shannon指數、Simpson指數、Observed species指數和Goods coverage指數），并以箱形圖顯示。測序分析中生成的ASV文件導入PICRUST 2中，以預測與杉木內生細菌群落相關的生物學功能。基于MetaCyc（https：//metacyc.org/）數據庫鑒定16S rRNA功能基因。

2" 結果與分析

2.1" ASV數量分析

圖1顯示，多年生杉木根中特有的細菌ASV數量為7 108個，莖中特有的細菌ASV數量為2 017個，葉中特有的細菌ASV數量為1 911個，其中根和莖共有的細菌ASV數量為503個，根和葉共有的細菌ASV數量為804個，葉和莖共有的細菌ASV數量為1 175個，根、莖、葉共有的細菌ASV的數量為305個。根中含有的細菌ASV數量最多，葉和莖中較少。

2.2" 杉木不同器官中內生細菌的α多樣性分析

計算杉木不同器官中內生細菌的α多樣性，分析多年生杉木內生細菌的豐富度和多樣性，采用Kruskal-Wallis檢驗和Dunn事后檢驗對杉木根、莖、葉中內生細菌的多樣性進行統計分析，結果（圖2）表明，杉木不同器官中的內生細菌多樣性指數存在一定的差異。Goods coverage指數的最小值為0.997 8，表明幾乎所有的內生細菌都能在杉木不同器官中被檢測到。通過觀察Chao1指數、Observed species指數、Shannon指數和Simpson指數，可以發現在杉木根、莖、葉中存在豐富的內生細菌，豐富度和多樣性總體表現為根＞莖＞葉，但莖和葉中內生細菌的相對豐度相差不大。

2.3" 物種豐度及群落結構組成

門水平的分類結果（圖3）表明，杉木根、莖、葉中的內生細菌主要由變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、軟壁菌門（Tenericutes）、衣原體門（Chlamydiae）、藍菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）內生細菌組成，平均相對豐度分別為67.930%、13.800%、6.250%、4.670%、4.370%、0.840%、0.630%、0.450%、0.450%和0.270%。在杉木葉中發現大量厚壁菌門內生細菌，相對豐度為11.050%，但根和莖中厚壁菌門內生細菌較少，相對豐度分別為0.460%和2.500%；在杉木根中軟壁菌門內生細菌的相對豐度為13.090%，在莖和葉中軟壁菌門內生細菌的相對豐度分別為0.005%和0.007%。

綱水平的分類結果（圖4）表明，杉木不同器官中內生細菌主要由α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteria）、柔膜菌綱（Mollicutes）和芽孢桿菌綱（Bacilli）內生細菌組成，平均相對豐度分別為41.180%、19.710%、11.180%、7.000%、6.220%、4.370%和4.240%。放線菌綱內生細菌在杉木根和莖中占比較高，相對豐度分別為16.150%和11.470%，但在葉中相對豐度僅為5.920%；柔膜菌綱內生細菌在杉木根部的相對豐度為13.090%，但在莖和葉中的相對豐度極低，都僅為0.010%；芽孢桿菌綱內生細菌在杉木葉中的相對豐度為9.960%，在根部和莖部的相對豐度僅為0.410%和2.350%。

屬水平的分類結果（圖5）表明，1174-901-12、P3OB-42、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、植原體暫定屬（Candidatus_Phytoplasma）、甲基細胞菌屬（Methylocella）、熱酸菌屬（Acidothermus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）內生細菌在杉木根、莖、葉中的平均相對豐度分別為14.430%、5.890%、5.300%、4.370%、4.220%、4.140%和3.060%。1174-901-12為杉木內生細菌的核心菌屬，平均相對豐度最高。1174-901-12、P3OB-42、甲基桿菌屬、甲基細胞菌屬內生細菌在杉木葉和莖中的相對豐度較高，但在根中的相對豐度較低；此外，杉木根中植原體暫定屬和熱酸菌屬內生細菌的相對豐度較高，但在葉和莖中相對豐度較低。

為了更好地解析多年生杉木不同器官中微生物之間的相互作用，采用線性判別分析（LEfSe）對杉木不同器官的生物標志物進行定量分析。圖6顯示，杉木不同器官中內生細菌的生物標志物相對豐度存在顯著差異。在根中，軟壁菌門和熱酸菌屬內生細菌的相對豐度較高；在莖中，變形菌門、鞘脂單胞菌屬和甲基桿菌屬內生細菌的相對豐度較高；在葉中，藍菌門和1174-901-12內生細菌的相對豐度較高。根據LEfSe分析的分類學分支圖（線性判別分析閾值=3.74），可以看出這些細菌在不同器官中的分布差異。

2.4" 組間相似性分析

通過物種組成熱圖比較樣本間的物種組成差異。圖7顯示，多年生杉木根中的內生細菌屬級分布與莖、葉存在明顯差異，其中植原體暫定屬、熱酸菌屬、醋酸桿菌屬（Acidibacter）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）內生細菌在多年生杉木根中的相

對豐度較高；莖和葉中的細菌屬級分布差異不明顯，但相對豐度有差別，其中鞘脂單胞菌屬（Sphingomonnas）、Jatrophihabitans、胺桿菌屬（Amnibacterium）和嗜酸菌屬（Acidiphilium）內生細菌在多年生杉木莖中的相對豐度較高，1174-901-12、布魯菌屬（Bryocella）、P3OB-42、假單胞菌屬（Pseudomonas）和巨大球菌屬（Macrococcus）內生細菌則在多年生杉木葉中的相對豐度較高。由圖中的顏色變化可知，多年生杉木根中的內生細菌相對豐度高于莖和葉中的內生細菌相對豐度，表明多年生杉木根中內生細菌的多樣性和豐富度都很高。

圖8顯示，通過對杉木不同器官中內生細菌的群落組成結構進行主坐標分析（PCoA）可知，主坐標1貢獻率為23.1%，主坐標2貢獻率為18.1%，總貢獻率為41.2%，能夠在一定程度上解釋群落組成差異。根中內生細菌的遺傳距離相對于莖和葉中內生細菌較遠，葉和莖中的內生細菌群落結構相似，這與物種組成熱圖的分析結果一致。

2.5" 杉木內生細菌的功能預測分析

將16S rRNA的功能預測結果與MetaCyc數據庫進行對比，圖9顯示，多年生杉木根、莖、葉中內生細菌的代謝途徑主要為生物合成，主要涉及氨基酸生物合成，豐度為33 711.14；輔因子、輔基、電子載體和維生素生物合成，豐度為31 681.06；核苷和核苷酸生物合成，豐度為28 701.72；脂肪酸和脂質的生物合成，豐度為22 262.46；碳水化合物生物合成，豐度為11 895.81。降解/利用/同化以及前體代謝物和能量的產生途徑中內生細菌豐度也相對較高。

3" 討論

植物內生細菌在促進植物生長等方面發揮著重要作用，然而關于杉木中內生細菌菌群的研究卻少之又少。人工培養的方法不可能將所有的內生細菌從植物體內提取出來并進行鑒定，高通量測序技術使得在不培養細菌的情況下對細菌進行鑒定成為了可能。本研究通過擴增子測序技術，對多年生杉木不同器官中內生細菌的多樣性及其群落組成差異進行分析，結果表明，杉木根、莖、葉中存在大量的內生細菌。李亮亮等發現花生根中內生細菌的多樣性最高，其次是莖和葉。本研究中的α多樣性分析結果表明，多年生杉木根、莖、葉中的內生細菌具有豐富的多樣性，但杉木根、莖、葉中的內生細菌組成和豐富度都存在差異，其中杉木葉中的內生細菌豐富度最低，根中含有的內生細菌豐富度和多樣性都要高于莖和葉，因為根系是內生細菌進入植物體內的入口，根系中次生根較多，而且機械損傷和病蟲害造成的傷口也較多，因此內生菌聚集較多。根系的內生細菌主要通過生物固氮、產植物激素、促進植物營養吸收和促進菌根真菌生長的方式促進宿主植物生長。同時也發現了多年生杉木不同器官中的一些主要門類和核心屬類以及一些相對豐度極低的種群，這也是高通量測序的優勢之一。對多年生杉木不同器官中內生細菌進行分析發現，變形菌門為優勢菌門，平均相對豐度為67.930%，放線菌門、酸桿菌門、厚壁菌門和軟壁菌門的相對豐度也較高。變形菌門的內生細菌對植物的生長發育、光合作用和抗脅迫能力均有一定影響，放線菌門是農業抗生素菌群的重要來源。在杉木葉中發現大量厚壁菌門內生細菌，相對豐度為11.050%，但根和莖中厚壁菌門內生細菌較少，相對豐度分別為0.460%和2.500%；在杉木根中軟壁菌門內生細菌的相對豐度為13.090%，在莖和葉中軟壁菌門內生細菌的相對豐度分別為0.005%和0.007%。這一結果表明，杉木不同器官中內生細菌存在一定的特異性。對多年生杉木不同器官中內生細菌進行分析，α-變形菌綱為優勢菌綱，平均相對豐度達到了41.180%，γ-變形菌綱、放線菌綱、δ-變形菌綱相對豐度也較高，其中α-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱都屬于變形菌門。多年生杉木不同器官中內生細菌的優勢菌屬為1174-901-12、P3OB-42和甲基桿菌屬，平均相對豐度分別為14.430%、5.890%和5.300%，植原體暫定屬、甲基細胞菌屬和熱酸菌屬的平均相對豐度也較高。甲基桿菌屬和甲基細胞菌屬可以促進植物的氮代謝和硫代謝。1174-901-12、P3OB-42、甲基桿菌屬、甲基細胞菌屬內生細菌在杉木莖和葉中相對豐度很高，但在根中相對豐度較低；植原體暫定屬和熱酸菌屬內生細菌在杉木根中相對豐度較高，但在莖和葉中相對豐度較低。這一結果也表明杉木不同器官中內生細菌存在一定的特異性。物種組成熱圖分析結果表明，多年生杉木根中的細菌群落組成相對于莖、葉中的細菌群落組成存在較大差異，根中內生細菌的豐富度和多樣性都較高，莖、葉中的細菌群落組成差異較小，但相對豐度存在明顯差異，PCoA結果與物種組成熱圖分析結果一致，驗證了這一結果的準確性，這也與Huo等研究瀕危中草藥北沙參內生細菌的結果相似。功能預測結果顯示，多年生杉木根、莖、葉中的內生細菌的代謝通路主要有生物合成、降解/利用/同化及前體代謝物和能量的產生等，但大部分非重復基因序列都聚集在生物合成通路中，由此推斷內生細菌通過調控杉木的生物合成，促進杉木的生長發育，為杉木與內生細菌互作奠定了基礎。在今后的研究中，可以通過對杉木內生細菌中與氨基酸、輔因子、輔基、電子載體、維生素、核苷、核苷酸和碳水化合物的生物合成相關的基因進行分析，并結合傳統的分離培養方法篩選出功能菌，再將篩選出的內生細菌與杉木幼苗互作，從而促進杉木的生長發育。

4" 結論

杉木中蘊含的內生細菌具有很高的豐富度和多樣性，杉木不同器官中內生細菌的群落結構、優勢菌門、優勢菌屬和基因功能都存在差異性，提取目標菌株時可以根據杉木不同器官中內生細菌的菌屬差異，以高通量測序的結果為對照，調配相對應的培養基，選取杉木不同器官，更容易培養出需要的杉木內生細菌。

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（責任編輯：王" 妮）