基于KASP標記的厚皮甜瓜種質資源遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建

摘要：" 本研究通過競爭性等位基因特異性PCR（KASP）標記對厚皮甜瓜核心種質資源進行多態性分析，以期篩選厚皮甜瓜種質資源的單核苷酸多態性（SNP）標記，應用于厚皮甜瓜種質資源及品種的純度鑒定和指紋圖譜構建。從公布的297份甜瓜重測序數據中挑選95份厚皮甜瓜重測序數據進行SNP標記開發，對課題組的20份核心厚皮甜瓜種質資源進行多態性分析。結果顯示，共計開發50個SNP標記，分布在甜瓜12條染色體中。50個SNP標記中，有23個SNP標記能夠將本研究中的19份核心厚皮甜瓜種質資源進行分型，其中Marker33、Marker38、Marker23、Marker36、Marker47、Marker42 6個標記能夠完全區分19份甜瓜種質資源，本研究結果可以為后期厚皮甜瓜種質資源和品種純度鑒定提供有利的支撐。

關鍵詞：" 厚皮甜瓜；單核苷酸多態性；競爭性等位基因特異性PCR；遺傳多樣性；指紋圖譜

中圖分類號：" S652.9""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2349-07

收稿日期：2024-03-05

基金項目：江蘇省種業振興揭榜掛帥項目；江蘇現代農業（西甜瓜）產業技術體系甜瓜育種栽培創新團隊項目

作者簡介：孫國勝（1987-），男，山東萊州人，碩士，助理研究員，研究方向為蔬菜作物遺傳育種。（E-mail）sgs8725@163.com

通訊作者：馬志虎，（E-mail）mazhihu830@163.com

孫國勝，張昌偉，山" 溪，等. 基于KASP標記的厚皮甜瓜種質資源遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建［J］. 江蘇農業學報，2024，40（12）：2349-2355.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.018

Analysis of genetic diversity and construction of fingerprints for core germplasms of muskmelon based on KASP markers

SUN Guosheng1，2，" ZHANG Changwei2，" SHAN Xi1，" XU Dingfan1，" DAI Zhongliang1，" ZHANG Zhenchao1，MA Zhihu1

（1.Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Area of Jiangsu Province， Zhenjiang 212400， China;2.Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract：" In this study， we analyzed the polymorphism of core resources of muskmelon by competitive allele-specific PCR （KASP） markers， with a view to screening single nucleotide polymorphism （SNP） markers of muskmelon resources， which could be applied to the purity identification and fingerprint construction of the parents and hybrids of muskmelon. From the published 297 melon resequencing data， 95 muskmelon resequencing data were selected for SNP marker development， and polymorphism analysis was performed on 20 core muskmelon germplasm resources of the subject group. The results showed that a total of 50 SNP markers were developed， and distributed on 12 chromosomes of muskmelon. Among the 50 SNP markers， 23 SNP markers could be used to genotype 19 core muskmelon resources. Six markers including Marker33， Marker38， Marker23， Marker36， Marker47 and Marker42 could completely distinguish 19 muskmelon germplasm resources. The results of this study provide favorable support for the identification of muskmelon resources and variety purity in the later stage.

Key words：" muskmelon;single nucleotide polymorphism （SNP）;competitive allele-specific PCR （KASP）;genetic diversity;fingerprint

甜瓜（Cucumis melo L.）是中國優勢園藝經濟作物，其栽培歷史悠久，大約于北魏時期與西瓜一同傳入中國，至明朝開始被廣泛種植。西北大陸性氣候地區，如新疆、甘肅等地是厚皮甜瓜的傳統優勢產區，如新疆哈密地區生產的“哈密瓜”已然成為網紋甜瓜的一個統稱。聯合國糧食及農業組織（FAO）的統計數據顯示，中國2022年甜瓜栽培面積約3.92×105 hm2，產量約1.425×107 t，在國民經濟中占重要地位。自“十三五”以來，中國甜瓜育種事業迎來了較好的發展，尤其是隨著測序技術的發展，傳統甜瓜育種技術結合生物育種技術，選育出一批適宜中國生態環境的具有自主知識產權的甜瓜品種，助力鄉村振興。

伴隨第三代測序技術的應用與發展，單核苷酸多態性（SNP）標記成為被廣泛應用的分子標記之一。SNP是基因組水平上出現的單堿基因素引起的DNA多態性，在自然條件下，發生單堿基突變的頻率約為1×10-8，且SNP在基因組中存在豐富的變異，遺傳穩定性高，又具有雙等位、高密度和共顯性等特點，使得SNP的使用越來越廣泛。使用競爭性等位基因特異性PCR（KASP）技術進行SNP檢測，其典型特點是成本低、兼容性較高、靈敏度高、對檢測樣本數量要求不高，KASP技術可以應用到作物分子標記輔助育種研究中。SNP目前已經廣泛地應用于作物的遺傳分析及純度鑒定。2012年，Gao等篩選了18對簡單重復序列（SSR）引物，構建了471份甜瓜資源的DNA指紋圖譜，但是標記數量少，難以成為全基因組篩選工具。2020年Liu等對297份甜瓜資源進行重測序，揭示了甜瓜基因組改良歷史以及與果實性狀相關的基因位點，共獲得2 045 412個高質量的 SNP標記，對于了解甜瓜的遺傳多樣性、品種改良和果實性狀的遺傳有很大幫助。

為了加速SNP標記在甜瓜育種，尤其是厚皮甜瓜育種中的應用，我們選取Liu等公布的297份甜瓜種質資源重測序數據中的95份厚皮甜瓜數據，通過對測序數據的重新分析開發出能夠用于厚皮甜瓜純度鑒定的SNP標記， 對項目組的20份厚皮甜瓜核心資源進行分型，并完成厚皮甜瓜核心種質資源的遺傳進化分析，了解厚皮甜瓜資源的親緣關系，為甜瓜雜交種純度鑒定提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 甜瓜資源

試驗采用的甜瓜資源是江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所蔬菜花卉研究室自有的厚皮甜瓜核心種質資源，具體性狀見表1。

甜瓜種子播種于72孔穴盤，放置于光照培養箱培養，培養條件為25 ℃、14 h（光）;20 ℃、10 h（暗）。兩葉一心時，取2片真葉提取DNA，備用。

1.2" 甜瓜葉片DNA的提取

20份甜瓜資源播種在江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所行香創新基地試驗室，植株長至2片真葉時，將第2片真葉去除葉脈后取0.1 g，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取總DNA。

1.3" KASP分子標記開發設計和基因型分型

1.3.1" SNP標記開發" 將甜瓜基因組和Liu等報道的95份厚皮甜瓜種質資源基因重測序數據（LDR_M和IMP_M類型）進行比對，利用Vcftools軟件（版本：0.1.16）對數據進行過濾，過濾參數設置為平均深度≥5×，標記質量值＞30，最小完整度＞0.9，最小等位基因頻率=0.05，雙等位標記，多態信息含量≥0.2，期望雜合度＞0.2。采用RepeatMasker軟件（版本：4.1.0）剔除重復序列中的SNP標記；截取SNP標記上游、下游各100 bp序列，然后使用BLAST軟件（版本：2.10.1+）將序列與參考基因組進行比對，去除比對上2個（包括原有位置）及2個以上位置的標記；使用Primer3軟件（版本：2.4.0）固定上游引物位置設計引物。每隔2 Mb選取1個標記，保證標記在染色體上均勻分布。

1.3.2" KASP引物合成和基因型分型" 根據開發的SNP位點前后序列信息，將SNP位點轉化為KASP標記。分別以引物F1和F2末端堿基為參考基因組的堿基和SNP位點，在引物F1的5′端添加熒光羧基熒光素（FAM）標簽序列GAAGGTGACCAAGTTCAT；在引物F2的5′端添加羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（VIC）熒光標簽序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。

將所提取的DNA稀釋至20 ng/μL，PCR反應體系為5.00 μL：KASP酶混合物2.50 μL、DNA 1.00 μL、引物F1 0.10 μL、引物F2 0.10 μL、引物R 0.30 μL、雙蒸餾水（ddH2O） 1.00 μL。在BioRad實時定量儀上進行PCR擴增，使用儀器自帶軟件進行基因分型及數據分析。

1.4" 數據統計及分析

利用MEGA 7.0 軟件對統計的基因型進行聚類分析并構建進化樹（采用鄰接法，Bootstrap值為1 000）。

2" 結果與分析

2.1" SNP標記多態性驗證

將甜瓜基因組數據與95份厚皮甜瓜種質資源重測序數據進行比對，使用Vcftools（版本：0.1.16）進行過濾，得到59 632個SNP標記（圖1）；去除比對上的多個位置的標記后，得到52 831個SNP標記；保留多態信息含量（PIC）大于0.2的標記，過濾得到12 589個SNP標記。

2.2" KASP位點引物設計

使用引物設計軟件Primer3（版本：2.4.0）對每個SNP標記進行KASP引物設計，轉化為KASP標記，對引物設計成功的9 148個標記的分布進行統計（圖2）。主要分布在外顯子和內含子，分別占27.5%和34.1%，基因間區域占16.5%。

每隔2 Mb選取1個標記，保證標記在染色體上均勻分布，共開發50個SNP標記，SNP標記位置與等位基因如表2所示。

2.3" KASP分型與指紋圖譜構建

將基因分型結果進行數據統計，結果（圖3）顯示，50個標記中，有23個標記能夠成功分型19份厚皮甜瓜資源（其中Ks-7和Ks-15親緣關系近，開發的50個SNP均不能將2個資源分型，最終結果顯示時將Ks-15剔除，保留Ks-7的數據）。將這23個標記用于遺傳背景分析和指紋圖譜構建，其中Marker33、Marker38、Marker23、Marker36、Marker47、Marker42 6個標記可以區分所有種質資源，可以用來構建最少標記的核心指紋圖譜。

2.4" 遺傳背景分析

使用MEGA 7.0軟件根據基因分型結果對19份厚皮甜瓜材料構建進化樹，結果見圖4。Ks-7、Ks-12、Ks-16和Ks-20被聚類在一個分支上，說明這4個品種的遺傳關系相近，其中Ks-7、Ks-12和Ks-16均為白皮甜瓜，Ks-20為黃皮甜瓜。由圖4可以看出，Ks-1、Ks-3、Ks-5、Ks-8、Ks-9、Ks-11、Ks-13、Ks-17和Ks-19屬于一個分支，除了Ks-8，其他均為脆肉甜瓜。Ks-2、Ks-4、Ks-6、Ks-10、Ks-14和Ks-18被聚類到一個分支，均為軟肉甜瓜。

品種編號信息見表1。

3" 討論

作物育種經歷了原始選育、傳統育種和分子標記輔助育種3個階段，原始選育和傳統育種極度依賴種質資源和育種家經驗的隨機組合，受主觀因素影響較大，效率較低，目前中國在分子標記輔助育種和轉基因育種研究中都有較大的進展。豐富的遺傳變異給育種者提供了大量的資源，在資源利用過程中由于轉基因涉及多種因素，分子標記成為利用基因功能輔助作物育種的主要手段之一。SNP分子標記以其高密度、遺傳穩定、二等位遺傳等優點，成為高通量、自動化的標記而被廣泛應用。用于高通量SNP檢測的KASP技術具有成本低、高通量、準確性高等特點，成為作物遺傳改良的一項基準技術。本研究通過公布的甜瓜基因組和95份厚皮甜瓜種質資源重測序數據，統計覆蓋全基因組的SNP，經過變異檢測和功能注釋后篩選出高質量、代表性強的50個SNP標記，在基因組上分布均勻、特異性強，其中有23個標記能夠對19份核心厚皮甜瓜種質資源進行分型，其中6個標記可以區分所有種質。

中國厚皮甜瓜的優勢產區是西北地區，20世紀90年代東部地區開始利用保護地種植甜瓜，所以甜瓜產區東移，以江蘇省為例，甜瓜年種植面積約2×104 hm2，具有自主知識產權的江蘇省甜瓜品種的栽培比例約占30%。一套成熟的甜瓜KASP分子標記不但能夠構建資源和品種的指紋圖譜，也能成為純度鑒定的有效手段，避免在資源收集和整理過程中出現重復保存和混淆的狀況，通過開發的標記，能夠準確快速地將親本資源進行分類和純度鑒定。本研究中Ks-7和Ks-15在資源整理和應用過程中表型存在一定的差異，但是使用開發的50個KASP標記均不能將其分型。另外，通過對甜瓜資源的進化分析可以明確不同資源之間的遺傳關系，本研究中19份甜瓜種質資源分為3個分支，說明此核心種質資源的遺傳較為豐富，Ks-1和Ks-19均為白皮紅脆肉類型的厚皮甜瓜資源，但是遺傳關系較遠，在組合配置的時候可以作為不同類別甜瓜的核心親本使用。

種子純度關乎種子安全，種子上市之前最為關鍵的步驟就是鑒定種子純度，常規大田鑒定對于時間和空間的要求較高，每年秋季有大量西甜瓜種子生產企業前往云南省元謀縣進行大田鑒定，耗時耗力。多個蔬菜作物的SNP標記已經被應用，如大白菜、西蘭花、豇豆、西瓜、番茄和辣椒等，但是厚皮甜瓜乃至甜瓜中KASP標記鑒定純度的報道較少。

4" 結論

本研究通過對95份已經公布的厚皮甜瓜重測序數據進行分析，篩選出23個SNP標記，能夠將本研究中的19份核心厚皮甜瓜種質資源進行分型，其中Marker33、Marker38、Marker23、Marker36、Marker47、Marker42 6個標記能夠完全區分19份甜瓜種質資源，并分析了育種材料之間的遺傳背景，構建了指紋圖譜。在本研究中，SNP標記的開發可為厚皮甜瓜分子標記輔助育種、甜瓜資源快速鑒定分類、雜種種子純度鑒定和指紋圖譜構建提供技術支撐。

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（責任編輯：陳海霞）