反向DNA-pulldown方法的建立

[摘 " 要] " 目的：建立反向DNA-pull down方法，驗證目的蛋白與靶DNA的結合，為探究疾病發生發展的分子機制提供新的手段。方法：以小鼠骨髓來源巨噬細胞總cDNA為模板，通過PCR擴增獲得轉錄因子PU.1 -ETS結構域編碼序列，通過酶切連接的方式連入表達質粒pET28a，轉化至大腸桿菌BL21（DE3）誘導蛋白異源表達。以小鼠基因組DNA為模板，通過PCR獲得Ly96啟動子序列。將異源表達的PU.1 ETS結合至Ni-NTA磁珠后，與靶DNA—Ly96啟動子體外孵育，最終經蛋白酶K酶解、DNA抽提及瓊脂糖凝膠電泳檢測PU.1 ETS體外結合Ly96啟動子情況，評估反向DNA-pull down技術的可行性。結果：通過大腸桿菌異源表達和親和純化獲得Ni-NTA磁珠-PU.1 ETS復合物，通過PCR獲得Ly96啟動子序列，經反向DNA-pull down驗證PU.1 ETS與Ly96啟動子的相互結合作用。結論：以PU.1-ETS-Ly96啟動子相互作用為例，證實反向DNA pull-down技術的可行性，為探究已知蛋白與靶DNA結合和疾病發生發展分子機制提供了一種操作簡單、實驗條件要求不高、成本較低的可選方案。

[關鍵詞] " 蛋白-DNA結合；反向DNA-pull down方法；異源表達；PU.1轉錄因子

[中圖分類號] " Q503 [文獻標志碼] " A [DOI] " 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.06.003

Establishment of reverse DNA-pull down method

CHU Jiaqi1， WANG Xueming1， KOU Yanbo2， YAN Xiaoqing3

（1First Clinical College; 2Jiangsu Key Laboratory of Immunity and Metabolism; 3Laboratory of Emergency Medicine，

Xuzhou Medical University， Jiangsu 221004）

[Abstract] " Objective： To establish a reverse DNA-pull down method for verifying the binding of the target protein to the target DNA， providing a new approach for exploring the molecular mechanisms of disease development. Methods： The total cDNA of mouse bone marrow-derived macrophages was used as a template to amplify the coding sequence of the ETS domain of the transcription factor PU.1 by PCR. The ETS domain coding sequence was then ligated to the expression vector pET28a by enzymatic digestion， and then transformed into Escherichia coli BL21（DE3） for heterologous expression of the protein. The Ly96 promoter sequence was amplified with mouse genomic DNA as a template. The heterogeneously expressed PU.1 ETS complex was bound to the Ni-NTA beads， after which the beads-PU.1 ETS complex was incubated with the target DNA-Ly96 promoter in vitro. The PU.1 ETS-Ly96 promoter interaction was evaluated by agarose gel electrophoresis after proteinase K digestion and DNA extraction to verify the feasibility of reverse DNA-pull down. Results： The Ni-NTA beads-PU.1 ETS complex was obtained through heterologous expression and affinity purification. The Ly96 promoter sequence was amplified by PCR， and the interaction between PU.1 ETS and the Ly96 promoter was verified by reverse DNA-pull down. Conclusion： Taking the interaction of PU.1-ETS-Ly96 promoter as an example， the feasibility of reverse DNA-pull down technology is confirmed， which provides an alternative scheme with simple operation， low experimental conditions and low cost for exploring the molecular mechanism of binding of known protein to target DNA and disease development.

[Key words] " protein-DNA binding; reverse DNA-pull down assay; heterologous expression; PU.1 transcription factor

蛋白表達開始于編碼基因的轉錄，轉錄起始的核心是蛋白（轉錄因子/輔轉錄因子或轉錄復合物）與目的DNA（啟動子）的結合，該過程在細胞內受嚴格的調控。研究基因轉錄調控，特別是以轉錄因子為代表的蛋白與DNA結合機制是闡明蛋白表達調控方式的重要手段，也是明確疾病發生發展分子機制的有力依據。目前研究蛋白與DNA結合的經典方法較多，包括染色質免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）、凝膠遷移實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、雙熒光素酶實驗、酵母單雜交實驗等。然而，這些方法往往操作較為復雜，而且或多或少存在著某些不足之處[1-7]。如ChIP實驗不能排除轉錄因子通過結合其它輔/轉錄因子而與啟動子結合，EMSA需要對目的DNA進行標記而增大實驗成本，雙熒光素酶實驗穩定性和重復性欠佳，酵母單雜交實驗需要特殊的宿主酵母和質粒系統等。因此，尋找研究蛋白與DNA結合的新方法具有重要意義。

本研究基于DNA-pull down實驗基本原理[8]，以轉錄因子PU.1-ETS結構域-Lymphocyte antigen 96（Ly96）啟動子為代表[9]，建立反向DNA-pull down方法，為探究蛋白與DNA直接結合提供新的策略。

1 " 材料與方法

1.1 " 材料 " 6周齡野生型C57BL/6小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司），大腸桿菌感受態DH5α和BL21（DE3）、高保真DNA聚合酶（北京全式金生物技術股份有限公司），逆轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司），Ni-NTA瓊脂糖磁珠（Qiagen），Trizol、核酸內切酶NcoⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、XhoⅠ及DNA連接酶（Thermo Fisher Scientific），基因組提取試劑盒、切膠回收試劑盒和核酸純化試劑盒（廣州飛揚生物工程有限公司），異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）（生工生物工程股份有限公司）。

1.2 " 方法

1.2.1 " 轉錄因子PU.1 ETS結構域編碼基因克隆：無菌操作取野生型C57BL/6小鼠股骨和脛骨骨髓，分離并誘導骨髓來源的巨噬細胞。收集細胞后提取總RNA，逆轉錄后獲得總cDNA。以總cDNA為模板，PU.1 ETS-F（5′-CATGCCATGGGCCCTGGGCCAGG-

TCTTCTGCACGGG-3′）和PU.1 ETS-R（5-′CCCAA

GCTTCCCACGGCCCAGCACCTCGCC-3′）為引物進行PCR擴增。將PCR產物經切膠回收獲得純化的PU.1 ETS結構域編碼序列。

1.2.2 " PU.1 ETS結構域表達質粒的構建：將pET28a空質粒和1.2.1中純化的PU.1 ETS結構域編碼序列用NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后，通過凝膠回收獲得線性化的pET28a和酶切的PU.1 ETS編碼序列。將線性化的pET28a和酶切的PU.1 ETS編碼序列按照摩爾比1 ∶ 7的比例混合，并用DNA連接酶連接，連接產物以熱激法轉化至大腸桿菌DH5α中。過夜培養后挑取轉化子，經菌液PCR和酶切驗證正確的重組質粒進行測序，測序無誤的重組質粒用于后續蛋白表達。

1.2.3 " PU.1 ETS結構域異源表達：將1.2.2中測序無誤的重組質粒和pET28a空質粒（對照）分別通過熱激法轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取陽性轉化子驗證無誤后，接種至LB培養基，置于旋轉搖床，37 ℃，220 r/min，直至生長至對數期中后期。取該菌液按照1 ∶ 50比例轉接至新鮮LB培養基中，繼續培養2～3 h后，向培養基中添加終濃度1 mmol/L IPTG，將培養條件改為20 ℃，100 r/min，過夜培養后收取菌體。將菌體用PBS洗滌3次后進行超聲破碎，收集上清，采用SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍染色觀察蛋白表達情況。

1.2.4 " PU.1 ETS結構域蛋白純化：將1.2.3所得的上清與平衡好的Ni-NTA瓊脂糖磁珠按照說明書推薦的比例混勻，置于旋轉搖床，4 ℃，80 r/min，孵育4 h。然后4 ℃下3 000 r/min離心5 min，收集磁珠，5 mmol/L咪唑洗滌1次，PBS洗滌3次，得到對照磁珠和純化的結合有PU.1 ETS結構域的Ni-NTA瓊脂糖磁珠。

1.2.5 " Ly96啟動子序列克隆：收集1.2.1中骨髓來源的巨噬細胞，提取總DNA，以該總DNA為模板，PLy96-F（5′-TAATTGTCTCCCTGAAAATGTGC-3′）和PLy96-R（R：5′-TAAACTCGCCAGGAAGACCAT-3′）為引物進行PCR擴增，獲取Ly96啟動子區，切膠回收后獲得純化的Ly96啟動子。

1.2.6 " 反向DNA-pull down實驗：將等量的1.2.4所得的Ni-NTA瓊脂糖磁珠分別與1 μg Ly96啟動子混勻，置于旋轉搖床4 ℃，80 r/min孵育2 h，離心收集珠子，PBS洗滌5遍后用150 μL PBS重懸磁珠，加入終濃度40 μg/mL蛋白酶K，45 ℃，酶解2 h。利用DNA純化試劑盒回收酶解釋放的Ly96啟動子，最終通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PU.1 ETS結合Ly96啟動子情況。利用Image J軟件對電泳條帶進行灰度分析。

1.3 " 統計學處理 " 采用Graph Pad Prism 9.0軟件進行數據分析。計量資料以■±s表示，兩組間比較采用t檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 " 結 " " "果

2.1 " PU.1-ETS結構域表達質粒的構建 " 以骨髓來源的巨噬細胞總cDNA為模板，PCR擴增PU.1-ETS編碼區（圖1A）。目的產物經切膠回收純化后，由NcoⅠ和HindⅢ進行雙酶切，連入表達質粒pET28a，得到重組質粒pET28a-PU.1-ETS。pET28a-PU.1-ETS分別經NcoⅠ/HindⅢ和KpnⅠ/XhoⅠ酶切驗證產生條帶約為5 300 bp/320 bp和5 400 bp/190 bp（圖1B）。測序無誤后用于后續實驗。

2.2 " PU.1-EST結構域的異源表達和純化 " 將上述測序無誤的pET28a-PU.1-ETS和對照空載體pET28通過熱激法分別轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取轉化子經菌液PCR驗證正確后，取1號（對照菌株，攜帶pET28a）和4號（重組蛋白表達菌株，攜帶pET28a-PU.1-ETS）轉化子用于后續誘導重組蛋白表達（圖2A）。轉化子經IPTG誘導后，收集菌體進行超聲破碎，將超聲破碎后的全菌體、沉淀和上清樣本進行SDS-PAGE電泳，發現pET28a-PU.1-ETS轉化子沉淀和上清中均存在大量疑似目的蛋白（圖2B）。為進一步確定該蛋白是否是PU.1-ETS-His重組蛋白，我們利用His-Tag抗體進行Western bolt檢測，重組蛋白理論分子量為13.92 kD，Western blot結果顯示在接近15 kD處檢測到His Tag信號，表明該蛋白確實為PU.1-ETS-His重組蛋白（圖2C）。

2.3 " PU.1-ETS與Ly96啟動子反向DNA-pull down技術 " 已有文獻報道PU.1能識別并結合淋巴細胞抗原96（lymphocyte antigen 96，Ly96）編碼基因啟動子，調控Ly96轉錄。因此，本研究以PU.1-ETS-Ly96啟動子為例驗證反向DNA-pull down技術的可行性。將2.2中菌體破碎上清中重組蛋白、Ni-NTA瓊脂糖珠、純化的Ly96啟動子按圖 3A所示流程進行操作，最終通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PU.1-ETS體外結合Ly96啟動子情況。結果顯示，雖然空珠子有一定的DNA結合背景，但與空珠子相比，結合PU.1 ETS的珠子明顯能吸附更多的Ly96啟動子區DNA，表明Ni-NTA-PU.1-ETS在體外能有效結合Ly96啟動子（圖3B-E），證明反向DNA-pull down技術可用于體外蛋白與核酸結合的檢測。

3 " 討 " " "論

機體的健康穩態實際上是各個組織器官處于適應當前環境的狀態表現，隨著環境的改變，機體需要相應改變以適應新環境，保持健康的穩態。然而，有些情況下機體并不能對環境作出很好的應答，往往導致疾病產生。機體擁有適應不同環境并保持健康穩態的潛力，是在不同環境下基因選擇性調控表達的結果。因此，探究機體應對環境保持健康穩態的機制，本質上是要研究在對應環境下功能基因轉錄調控和功能蛋白活性調節的機制。對比健康和疾病狀態下蛋白表達調控機制的改變，并基于此開發相應的藥物以糾正錯誤的蛋白表達模式或將是預防和治療相關疾病的有效策略。本研究基于DNA-pull down的基本原理，提供一種反向DNA-pull down技術，用于體外探究蛋白（轉錄因子/輔轉錄因子）與DNA（啟動子）結合情況，為解析疾病發生發展的分子機制提供新的可選手段。

傳統DNA-pull down技術利用生物素標記啟動子，將標記的啟動子與靶轉錄因子/輔轉錄因子或核蛋白提取物孵育，然后通過鏈霉親和素偶聯的珠子捕獲啟動子-轉錄因子/輔轉錄因子復合物，最終通過Western blot檢測靶轉錄因子/輔轉錄因子是否存在于沉淀物中，以此來證明啟動子與轉錄因子/輔轉錄因子的結合[10]。該技術以已知啟動子來釣取靶蛋白，很多時候研究者可能想要探究已知轉錄因子/輔轉錄因子的靶DNA，這種情況下DNA-pull down技術則顯得捉襟見肘。為解決這一問題，本研究基于DNA-pull down技術基本原理，嘗試利用已知蛋白來反向釣取靶DNA。將目的蛋白進行異源表達后結合于偶聯對應結合物的磁珠上，隨后以磁珠-目的蛋白復合物與靶DNA進行孵育，收集復合物并用蛋白酶將蛋白裂解釋放釣取到的DNA，最終通過簡單的瓊脂糖凝膠電泳即可明確目的蛋白與靶DNA的結合情況。根據該方法的原理，若結合DNA文庫和測序技術，還可進一步拓寬其應用，以探究目的蛋白能結合的未知DNA。

反向DNA-pull down技術不需要ChIP那樣繁雜的操作步驟和特定抗體，不需要如EMSA技術標記探針，也沒有酵母單雜交技術所必備的特殊酵母菌種、載體和培養體系。相對而言，反向DNA-pull down技術操作更為簡單，對實驗條件要求更低。當然，反向DNA-pull down技術也有缺點，如只能做到體外實驗驗證，而不能實時胞內驗證；需要對目的蛋白進行異源表達，某些特殊蛋白未必能順利完成異源表達；盡管諸多轉錄因子在體外可直接與啟動子結合[11-12]，然而某些轉錄因子與啟動子的結合依賴轉錄因子的翻譯后修飾，如最常見的磷酸化等，本技術中轉錄因子來源于大腸桿菌異源表達，所得到的重組轉錄因子未必能夠在大腸桿菌胞內獲得有效的磷酸化修飾，因此反向DNA-pull down技術對這類依賴翻譯后修飾而結合啟動子的轉錄因子適用性有限。

此外，本研究發現空磁珠似乎有一定的DNA非特異性吸附現象（圖3C，Ctrl組），若目的蛋白與靶DNA結合較弱，這種非特異性吸附所帶來的背景信號很可能會干擾最終結果的判斷。為解決這一問題，我們推測在磁珠-目的蛋白復合物與靶DNA孵育之前增加一步“封閉”步驟是一種可行的方案，即在磁珠-目的蛋白復合物與靶DNA孵育前加入無關DNA占據非特異性吸附位點，以最大程度降低后續靶DNA與磁珠-目的蛋白復合物的非特異性結合。但高效封閉非特異性結合位點的DNA長度和序列還在試驗探索階段。

綜上所述，本研究以PU.1 ETS結構域-Ly96啟動子為代表，建立反向DNA-pull down技術，為探究已知蛋白與靶DNA結合，探究疾病發生發展分子機制提供了一種操作簡單、實驗條件要求不高、成本較低的可選方案。

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[收稿日期] 2024-09-20

（本文編輯 " 王曉蘊）