高通量測(cè)序在新生兒遺傳代謝病篩查中的應(yīng)用研究

尹歡 雷菊芳 陳小林 程紅斌

黃石市婦幼保健院新生兒科，黃石 435000

隨著遺傳代謝病在新生兒中的發(fā)病率不斷增加，對(duì)該領(lǐng)域的研究和篩查手段的改進(jìn)變得越來(lái)越重要［1］。傳統(tǒng)的新生兒遺傳代謝病篩查方法基于血液中特定代謝產(chǎn)物或酶活性的測(cè)定，雖然可以識(shí)別一些常見(jiàn)的代謝病，但仍存在一些技術(shù)限制和盲區(qū)［2］。近年來(lái)，高通量測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)的出現(xiàn)為新生兒遺傳代謝病篩查提供了新的機(jī)會(huì)［3］。NGS 技術(shù)具有高通量、高準(zhǔn)確性和多樣性檢測(cè)能力的特點(diǎn)，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行測(cè)序和分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)遺傳代謝病相關(guān)基因的全面檢測(cè)和篩查［4］。NGS 在新生兒遺傳代謝病篩查中可以通過(guò)建立基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)，對(duì)與遺傳代謝病相關(guān)的基因進(jìn)行系統(tǒng)和全面的收集和整理［5-6］。這樣可以為篩查提供更準(zhǔn)確、全面的遺傳信息，并為后續(xù)的臨床診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。因此，本研究通過(guò)選取2021 年1 月至2023 年6 月黃石市婦幼保健院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房（neontal intensive care unit，NICU）住院的不明原因的酸中毒、腦病等185 例危重新生兒病例為研究對(duì)象，旨在分析NGS 在新生兒遺傳代謝病篩查中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

1.一般資料

采用前瞻性研究方式，選取2021 年1 月至2023 年6 月黃石市婦幼保健院NICU 住院的不明原因的酸中毒、腦病等185 例危重新生兒病例為研究對(duì)象，其中男95 例、女90 例。⑴納入標(biāo)準(zhǔn)：入住我院NICU 病房，存在不明原因的酸中毒、腦病表現(xiàn)；出生時(shí)間在72 h 以上，接受充分哺乳；根據(jù)病情考慮某種遺傳代謝病；樣本采集完整，檢測(cè)結(jié)果完整；監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)，充分了解研究相關(guān)內(nèi)容。⑵排除標(biāo)準(zhǔn)：受試者入組前存在輸注異體血制品情況；存在遺傳病家族史，臨床已確診遺傳性疾病；監(jiān)護(hù)者接受宣教后表示拒絕參與研究。

本研究已獲黃石市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（XSEK-2022-003）。

2.方法

2.1.時(shí)間免疫熒光法 采用時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)干血片促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）、17α-羥孕酮（17-hydroxyprogesterone，17α-OHP）及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）水平。陽(yáng)性判讀及處理：當(dāng)TSH≥6.8 mU/L，17α-OHP≥1 nmol/L，G6PD≤26 U/dl為初篩陽(yáng)性，對(duì)新生兒進(jìn)行召回復(fù)查，若結(jié)果仍高于截?cái)嘀嫡咭暈榭梢刹±D(zhuǎn)診至專(zhuān)科門(mén)診進(jìn)行確診、治療、隨訪(fǎng)管理等。

2.2.串聯(lián)質(zhì)譜法 采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)干血片中11 種氨基酸和31 種酰基肉堿的水平，制備內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和日常工作溶液，采用非衍生化法進(jìn)行檢測(cè)，即每個(gè)含有濾紙血片的板孔內(nèi)添加100 μl 的日常工作溶液。封蓋后，置于振蕩器內(nèi)，在45℃（±5℃）下震蕩45 min。然后從每個(gè)板塊中轉(zhuǎn)移75 μl溶液至V 型底、耐熱微孔板內(nèi)，使用鋁箔封套覆蓋。微孔板置入自動(dòng)進(jìn)樣器中，利用串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。陽(yáng)性判讀：最初按2 000例正常新生兒檢測(cè)值的99%的可信區(qū)間設(shè)置各指標(biāo)的參考范圍，所有截?cái)嘀惦S樣本的增加而不斷修正，當(dāng)分析物指標(biāo)超過(guò)截?cái)嘀禃r(shí)，電話(huà)召回重新采血復(fù)查，若檢查結(jié)果仍是同一指標(biāo)高于截?cái)嘀担瑒t判斷為陽(yáng)性，視為可疑病例。轉(zhuǎn)診至專(zhuān)科門(mén)診進(jìn)行確診、治療、隨訪(fǎng)管理等。

2.3.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) ⑴基因捕獲探針的制備：設(shè)計(jì)包括與遺傳代謝病病種相關(guān)的已知致病基因202 個(gè)，使用GenCap（北京邁基諾公司）基因捕獲探針技術(shù)合成DNA 探針，命名為NeoEXOMEM，探針覆蓋外顯子區(qū)及已知致病的非編碼區(qū)。⑵血漿DNA 的提取：使用QIAamp DNA Mini Kit（德國(guó)：QIAGEN）提取干血斑樣本的基因組DNA。⑶測(cè)序：使用新生兒基因捕獲試劑盒NeoEXOMEM（北京：QIAamp DNA Blood Mini Kit）對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行液相雜交捕獲。富集文庫(kù)使用HiSeqX10系統(tǒng)（llumina）進(jìn)行150-bp雙端測(cè)序。

3.數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

結(jié)果

1.新生兒一般信息分析

185例新生兒中，男性占51.35%，女性占48.65%。早產(chǎn)兒占7.57%，輔助生殖占8.11%，新生兒及母親一般資料，見(jiàn)表1。

表1 185例新生兒一般信息分析

2.生化篩查結(jié)果分析

185 例受試新生兒中，生化篩查初篩陽(yáng)性者15 例（8.10%），召回復(fù)測(cè)后陽(yáng)性者5 例（2.70%）。其中，5 例復(fù)查陽(yáng)性者分別為存在G6PD降低1例、17α-OHP升高1例、TSH升高1例、苯丙氨酸（Phe）升高2例。

3.NGS篩查結(jié)果分析

185 例受試新生兒中，NGS 篩查陽(yáng)性6 例（3.24%），分別為DOUX2、MATIA、G6PD、CYP21A2 復(fù)合雜合突變各1 例，PAH 基因復(fù)合雜合突變2 例。此外，除陽(yáng)性者外，存在隱性遺傳病變異攜帶的新生兒有45 例（24.32%），陰性新生兒140例（72.43%）。

4.兩種篩查結(jié)果比較

共6 例受試者篩查結(jié)果陽(yáng)性，將生化篩查結(jié)果與NGS篩查結(jié)果比較，兩種篩查結(jié)果一致有5 例，不一致有1 例，6 例患者中3 例得到確診，分別為高苯丙氨酸血癥1 例、21-羥化酶缺乏性先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥1 例、先天性甲腺功能減退癥1 例，見(jiàn)表2。以臨床診斷為參考，將待確診病歷納入真陽(yáng)性中，生化篩查靈敏度為83.3%、特異度為100.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%，NGS 篩查靈敏度為100.0%、特異度為100.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%，見(jiàn)表3。對(duì)受試新生兒進(jìn)行干預(yù)與隨訪(fǎng)，截至受試者3 月齡時(shí)，3 例確診患兒及3例待確診新生兒均發(fā)育正常。

表2 6例受試者篩查結(jié)果陽(yáng)性新生兒臨床信息及檢測(cè)結(jié)果

表3 生化、NGS新生兒遺傳代謝病篩查效能分析（例）

討論

新生兒遺傳代謝病是指由于基因突變導(dǎo)致新生兒體內(nèi)某種特定的代謝酶缺乏或功能異常，進(jìn)而引發(fā)一系列的代謝紊亂［7］。這些疾病通常在嬰兒出生后不久就會(huì)表現(xiàn)出癥狀。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球范圍內(nèi)新生兒遺傳代謝病的發(fā)病率為1/3 000～1/4 000［8］。這意味著在每1 000 個(gè)新生兒中，有1～2 個(gè)患有遺傳代謝病。這些疾病的好發(fā)年齡段多集中在新生兒期，因?yàn)樾律鷥旱拇x系統(tǒng)尚未完全成熟，對(duì)某些代謝物的處理和轉(zhuǎn)化能力相對(duì)較弱［9］。一些特定的遺傳代謝病也可能在嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中逐漸顯現(xiàn)。許多新生兒遺傳代謝病若不及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療，可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如神經(jīng)系統(tǒng)損害、智力發(fā)育遲緩、器官功能障礙等［10-12］。篩查對(duì)于新生兒遺傳代謝病非常重要，因?yàn)檫@些疾病在出生后很短的時(shí)間內(nèi)就會(huì)表現(xiàn)出癥狀。通過(guò)及早的篩查，醫(yī)生可以盡早發(fā)現(xiàn)潛在的遺傳代謝病，采取相應(yīng)的治療措施，以減輕癥狀和避免嚴(yán)重的并發(fā)癥。生化篩查是一種通過(guò)檢測(cè)新生兒體內(nèi)特定代謝產(chǎn)物或酶活性水平來(lái)發(fā)現(xiàn)遺傳代謝病的篩查方法［13］。在新生兒遺傳代謝病中，常用的生化篩查技術(shù)包括串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和時(shí)間分辨免疫熒光法［14］。生化篩查技術(shù)在新生兒遺傳代謝病的應(yīng)用現(xiàn)狀較為廣泛，可以快速、準(zhǔn)確地診斷很多常見(jiàn)的遺傳代謝病。它可以幫助醫(yī)生及早發(fā)現(xiàn)潛在的遺傳代謝病，從而盡早采取治療措施，減輕癥狀和避免嚴(yán)重的并發(fā)癥［15］。但是生化篩查技術(shù)也存在一些不足之處：有時(shí)結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的情況，需要經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的確認(rèn)和檢測(cè)，以確定是否確實(shí)存在遺傳代謝病。生化篩查技術(shù)通常只能檢測(cè)已知的特定代謝病，對(duì)于新穎或未知的代謝病可能無(wú)法進(jìn)行有效的篩查［16］。生化篩查通常是定性或半定量的結(jié)果，無(wú)法提供詳細(xì)的遺傳突變信息，對(duì)于某些復(fù)雜的遺傳代謝病，可能需要進(jìn)一步的基因檢測(cè)來(lái)確定診斷。NGS 篩查是一種利用先進(jìn)的DNA 測(cè)序技術(shù)對(duì)新生兒進(jìn)行遺傳代謝病篩查的方法。它通過(guò)對(duì)患兒的基因組或特定基因區(qū)域進(jìn)行深度測(cè)序，可以全面、高效地檢測(cè)大量的基因突變和變異。

本研究中，通過(guò)選取2021 年1 月至2023 年6 月黃石市婦幼保健院NICU 住院的不明原因的酸中毒、腦病等危重新生兒病例185 例為研究對(duì)象。所有受試者均采集足跟血，實(shí)施生化篩查（串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、時(shí)間分辨免疫熒光法）、NGS篩查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)185 例受試新生兒中，生化篩查初篩陽(yáng)性者15 例（8.10%），召回復(fù)測(cè)后陽(yáng)性者5 例（2.70%），其中，5例復(fù)查陽(yáng)性者分別為存在G6PD 降低1例、17α-OHP升高1例、TSH 升高1 例、Phe 升高2 例。185 例受試新生兒中，NGS 篩查陽(yáng)性6 例，陽(yáng)性篩查率為3.24%，分別為DOUX2、MATIA、G6PD、CYP21A2 復(fù)合雜合突變各1 例，PAH 基因復(fù)合雜合突變2 例。此外，除陽(yáng)性者外，存在隱性遺傳病變異攜帶的新生兒有45 例（24.32%），陰性新生兒140 例（72.43%）。這與國(guó)內(nèi)同類(lèi)型文獻(xiàn)結(jié)果基本一致［17-18］。

兩種篩查結(jié)果一致有5 例，不一致有1 例，6 例患者中3例得到確診，分別為高苯丙氨酸血癥1例、21-羥化酶缺乏性先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥1 例、先天性甲狀腺功能減退癥1 例。以臨床診斷為參考，將待確診病例納入真陽(yáng)性中，生化篩查靈敏度為83.3%、特異度為100.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%，NGS 篩查靈敏度為100.0%、特異度為100.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%。NGS篩查新生兒遺傳代謝病相較于生化篩查具有更高的準(zhǔn)確度和更全面的優(yōu)勢(shì)，NGS 技術(shù)可以對(duì)多個(gè)基因或整個(gè)進(jìn)行深度測(cè)序，能夠檢測(cè)多個(gè)基因的突變和變異。相比之下，生化篩查主要依賴(lài)于單個(gè)或有限數(shù)量的生化指標(biāo)來(lái)檢測(cè)特定代謝物的異常。由于新生兒遺傳代謝病涉及多個(gè)基因的突變，NGS篩查能夠提供更全面、更準(zhǔn)確的結(jié)果，避免了漏診或誤診的情況［19］。NGS 篩查可以覆蓋大量的基因和變異，不僅可以發(fā)現(xiàn)已知的遺傳代謝病，還可以發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)的變異和新的遺傳代謝病。與之相比，生化篩查通常只針對(duì)少數(shù)常見(jiàn)的遺傳代謝病進(jìn)行篩查，無(wú)法覆蓋到所有可能的變異。NGS 篩查具有高敏感性，即使是罕見(jiàn)的基因突變也能被檢測(cè)到。而在生化篩查中，如果某個(gè)代謝物的異常不在篩查范圍內(nèi)或突變頻率很低，可能無(wú)法被及時(shí)發(fā)現(xiàn)［20］。NGS篩查不僅可以檢測(cè)突變、變異，還可以提供關(guān)于患者基因組中其他相關(guān)基因的信息，這些額外的信息有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)制、預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展、指導(dǎo)個(gè)體化的治療方案等。盡管NGS 篩查具有上述優(yōu)勢(shì)，但也需要注意，NGS篩查技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和解釋?zhuān)瑫r(shí)，數(shù)據(jù)分析和解讀的復(fù)雜性以及高成本也是其應(yīng)用的挑戰(zhàn)。而生化篩查則相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，對(duì)于一些常見(jiàn)遺傳代謝病也能夠提供有效的篩查和診斷。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)具體情況和資源限制，可以選擇合適的篩查方法。

綜上所述，NGS 篩查準(zhǔn)確度較高，可較為全面的診斷新生兒遺傳代謝病。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明尹歡：研究設(shè)計(jì)與實(shí)施、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、統(tǒng)計(jì)分析；雷菊芳：研究設(shè)計(jì)與實(shí)施、采集數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱、指導(dǎo)；陳小林：實(shí)施研究、數(shù)據(jù)采集與分析；程紅斌：研究設(shè)計(jì)、對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱、指導(dǎo)