自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3B在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

高 松,吳躍銳,梁明超,吳建萍

(暨南大學(xué)附屬順德醫(yī)院普外一科,廣東 佛山 528305)

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)的高發(fā)性惡性腫瘤,每年造成近700 000人死亡[1]。隨著三階梯診療程序的普及和完善,結(jié)腸癌的治療不再局限于放療和化療,還追求精準(zhǔn)療法以延長患者生命、改善預(yù)后。因此,逐漸成熟的靶向治療為其提供了思路,但新的治療急需治療結(jié)腸癌的靶點。自噬是腫瘤關(guān)系非常密切的腫瘤特征之一,其為尋找合適的治療靶點提供了方向[2]。自噬途徑是細(xì)胞通過回收受損的細(xì)胞蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和其他細(xì)胞成分來保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并應(yīng)對壓力的過程[3-5]。在癌癥的背景下,自噬是一種雙刃劍,取決于致癌背景和腫瘤發(fā)生的階段。由于細(xì)胞損傷和對能量的高需求,與正常細(xì)胞相比,癌細(xì)胞對自噬的依賴性更高。致癌酪氨酸激酶(OncTKs) 和受體酪氨酸激酶(RTKs) 激活通過激活 PI3K/AKT/mTORC1 和 RAS/MAPK 信號通路導(dǎo)致自噬調(diào)節(jié)。酪氨酸激酶(TKs) 和 RTKs 的靶向抑制最近被認(rèn)為是癌癥治療,但耐藥性和癌癥復(fù)發(fā)仍然是酪氨酸激酶抑制劑(TKI) 的主要限制[6-7]。因此,調(diào)節(jié)自噬通路可能是治療癌癥的一種有前途的策略。微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3B(MAP1LC3B)是調(diào)節(jié)自噬活性和鑒定自噬水平的關(guān)鍵基因,是自噬體模型的標(biāo)志,其水平的高低反映了細(xì)胞自噬活性的強(qiáng)弱[8],但MAP1LC3B在結(jié)腸癌中的作用尚不清楚。因此,本研究將探討MAP1LC3B活性與結(jié)腸癌臨床病理的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料:采用回顧性研究方法,選取2018年1月～2020年6月暨南大學(xué)附屬順德醫(yī)院確診和在本院手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織40例,并取癌旁組織20例為對照組,通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)收集和分析新鮮配對組織。所有病例均經(jīng)本院病理科確診。男21例,女19例,Ⅰ期1例,Ⅱ期4例,Ⅲ期3例,Ⅴ期32例,患者年齡40～90歲,平均(61.22±8.11)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2生物信息學(xué)分析:THE HUMAN PROTEINATLAS在線工具(https://www.proteinatlas.org/) 評估結(jié)腸癌腫瘤中MAP1LC3B 的 mRNA 和蛋白水平。此外,通過GEPIA(Gene Expression Profiling) 提供的在線工具交互分析(http://gepia.cancerpku.cn/) 和 UACLAN(http://ualcan.path.uab.edu/) 獲得在線工具用于確定MAP1LC3B 表達(dá)和TCGA 隊列中患者的臨床病理要素以及MAP1LC3B表達(dá)的生存曲線。

1.3免疫組化方法:組織標(biāo)本利用10% 中性福爾馬林固定,石蠟包埋。切片脫蠟和水化后,通過3% 過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗三次后,將組織與兔抗人MAP1LC3B(1∶100;Santa Cruz,CA) 在 4℃下孵育過夜,經(jīng)PBS緩沖液沖洗3次,5 min/次,再與抗兔 IgG 辣根過氧化物酶(1∶100;Dako,Glostrup,Denmark) 在室溫下孵育1 h,使用 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺顯示。蘇木精復(fù)染后,觀察切片。結(jié)果判斷:MAP1LC3B定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核,隨機(jī)選取10個高倍鏡視野,每個視野觀察100個細(xì)胞,采用半定量評分方法。

1.4Western印跡:使用組織勻漿器將腫瘤組織搗碎在一起,加入裂解緩沖液提取總蛋白(Solarbio,R0010)。14 000 r/min離心 15 min,取上清液,利用BCA蛋白進(jìn)行蛋白定量。定量好的上清與上樣緩沖液混合并100 ℃加熱變性10 min。采用標(biāo)準(zhǔn)的Western分析蛋白質(zhì)表達(dá)[9]。抗 MAP1LC3B 抗體(1∶500稀釋,A-AO1709a,艾美捷,武漢,中國)被使用。等效的蛋白質(zhì)負(fù)荷是使用小鼠抗體抗β-肌動蛋白(β-actin,1∶50 000稀釋,ZSGB-BIO,TA-09,北京,中國)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS21.0軟件進(jìn)行χ2檢驗,t檢驗和單因素方差分析。對 Kaplan-Meier 分析進(jìn)行對數(shù)秩檢驗以估計患者的生存時間。單變量和多變量 Cox應(yīng)用回歸分析來衡量 MAP1LC3B 表達(dá)和其他臨床參數(shù)在預(yù)后方面的值,P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1結(jié)腸癌組織中MAP1LC3B的表達(dá):TCGA和THE HUMAN PROTEINATLAS數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示,MAP1LC3B在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中表達(dá)無顯著差異(P>0.05),但本院樣本免疫組化結(jié)果表明,MAP1LC3B在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽性率為72.50%(29/40),明顯高于癌旁組織組[40.00%(8/20)],差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.332,P=0.001),見圖1。

圖1 結(jié)腸癌組織中MAP1LC3B的表達(dá)

2.2MAP1LC3B的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系:TCGA和THE HUMAN PROTEINATLAS數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示,MAP1LC3B的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的分期和轉(zhuǎn)移未見顯著差異(P>0.05),見圖2;但在本院40例MAP1LC3B陽性組中,21例(72.41%)合并肝轉(zhuǎn)移(P=0.001),且患者的TNM分期多為Ⅴ期患者,占79.31%(23例),與MAP1LC3B陰性組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001),但MAP1LC3B的表達(dá)與結(jié)腸癌組織的分化程度(P=0.056)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P=0.265)未見統(tǒng)計學(xué)相關(guān),見表1。

表1 MAP1LC3B表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3MAP1LC3B高表達(dá)與結(jié)腸癌患者免疫的關(guān)系:數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,MAP1LC3B機(jī)體免疫細(xì)胞中表達(dá)水平較高,且在NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞中,MAP1LC3B表達(dá)水平與CD8+ T細(xì)胞的功能最為密切(P=0.013),見圖3。

注:A:MAP1LC3B在結(jié)腸癌患者免疫細(xì)胞中的表達(dá)情況;B: MAP1LC3B表達(dá)與結(jié)腸癌患者免疫細(xì)胞功能的關(guān)系

2.4MAP1LC3B的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系:TCGA和THE HUMAN PROTEINATLAS數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示,與MAP1LC3B的低表達(dá)MAP1LC3B患者相比,高表達(dá)患者生存時間明顯縮短(P=0.048),見圖4。

圖4 MAP1LC3B的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

3 討論

自噬泛指溶酶體(酵母中為液泡)介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)降解過程。自噬體與溶酶體融合形成autolysosome,期間自噬體的內(nèi)膜被溶酶體酶降解,二者的內(nèi)容物合為一體,自噬體中的“貨物”也被降解,產(chǎn)物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞漿中,供細(xì)胞重新利用,而殘渣或被排出細(xì)胞外或滯留在胞漿中[10]。研究發(fā)現(xiàn),自噬的生物進(jìn)化過程是高度保守的,無論是在酵母還是人體中,其自噬的相關(guān)基因有高度同源性。盡管自噬在癌癥發(fā)展中還有其他爭議,但是目前已經(jīng)成為令人感興趣的靶向治療目標(biāo)[11]。自噬通路和許多蛋白質(zhì)均存在相關(guān)性,其中MAP1LC3B是最常見的信號蛋白,自噬系統(tǒng)的缺陷會導(dǎo)致腫瘤在不同器官中發(fā)生[12]。研究證實,MAP1LC3B參與了自噬體的形成,在自噬體的形成過程和半融合的過程中均發(fā)揮了重要的作用[13]。MAP1LC3B可以組合自噬體膜的Atg8p,參與腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后的修飾,因此,其與惡性腫瘤中發(fā)生發(fā)展過程有密切的關(guān)系[14]。

本研究結(jié)果表明 MAP1LC3B 與結(jié)腸癌預(yù)后不良有關(guān)。這與以往的認(rèn)知有所偏差,提示需要更多的數(shù)據(jù)來進(jìn)一步分析MAP1LC3B在結(jié)腸癌中的作用。本結(jié)果表明,結(jié)腸癌組織中存在有較強(qiáng)的自噬活性,是結(jié)腸癌疾病進(jìn)展的重要相關(guān)蛋白。本研究進(jìn)一步根據(jù)MAP1LC3B蛋白的表達(dá)進(jìn)行了二次分組,提示自噬活性可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。特別是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移組中,MAP1LC3B蛋白的表達(dá)存在顯著性差異,同樣提示自噬活性啟動了細(xì)胞的部分缺失,有可能助力了的病情的進(jìn)展以及患者出現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[15-16]。

機(jī)體免疫在抵抗腫瘤的過程中發(fā)揮重要作用。自噬調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞激活過程中的能量代謝。有研究發(fā)現(xiàn),在攜帶 CD2Cre 轉(zhuǎn)基因的小鼠中,Gimap6 基因在 T 和 B 細(xì)胞譜系中被刪除,外周CD4+和 CD8+T 細(xì)胞減少了50%～70%,其中MAP1LC3B 水平升高,特別是脂化 LC3-Ⅱ形式和 SQSTM1 的 S405 磷酸化,提示MAP1LC3B 誘導(dǎo)的自噬紊亂抑制了效應(yīng)T細(xì)胞的激活[17]。為進(jìn)一步分析MAP1LC3B加速結(jié)腸癌死亡的機(jī)制,通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),MAP1LC3B機(jī)體免疫細(xì)胞中表達(dá)水平較高,且在NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞中,MAP1LC3B表達(dá)水平與CD8+ T細(xì)胞的功能最為顯著(P=0.013)。這表明MAP1LC3B可能通過調(diào)控自噬抑制了CD8+ T細(xì)胞表達(dá),從而加劇免疫相關(guān)基因的紊亂,導(dǎo)致了免疫細(xì)胞功能的損害,導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸。

綜上,研究已經(jīng)證實 MAP1LC3B 的表達(dá)水平是結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的重要因素。MAP1LC3B 可能是一個結(jié)腸癌患者的新型轉(zhuǎn)移和預(yù)后生物標(biāo)志物。在未來,將在體內(nèi)和體外進(jìn)行MAP1LC3B的實驗進(jìn)一步研究 MAP1LC3B 在結(jié)腸癌中的作用,以通過更積極的治療改善提高患者的生存率。然而,它的P值接近 0.05,這可能歸因于使用的少量組織樣本。由于參與之前工作的患者數(shù)量有限,有必要基于大樣本調(diào)查進(jìn)一步確定 MAP1LC3B 是否可以作結(jié)腸癌患者總生存期的預(yù)測因子。