富含蘿卜硫素的西蘭花提取物對小鼠外周血CD8+T淋巴細胞活化及腸道菌群的影響

王 政,申春一,黃建敏,劉金燕,李潔瑤,張 毅1,

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052

蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)是廣泛存在于西蘭花、卷心菜和花椰菜等植物性食物中的一種抗氧化劑。體內外研究[1]發現,SFN可以調節免疫系統,調動體內的CD8+T淋巴細胞等效應細胞,增強抗腫瘤的免疫反應。此外,SFN還具有抗氧化、保護胃腸道、預防高血壓和動脈粥樣硬化等作用,在疾病預防及治療領域具有重要潛力[2-3]。腸道作為食物消化吸收的主要場所,其中含有眾多微生物。腸道微生物是連接宿主及外界環境的橋梁,除了維持腸道正常消化功能以外,還通過各類代謝物參與宿主生理病理過程[4]。腸道微生物與宿主相互依存,共同進化,形成抵抗外來病原體的屏障,并且可以調節免疫應答以及增強代謝健康[5-7]。CD8+T淋巴細胞是機體主要的免疫效應細胞,腸道中有益菌比例的增加可以刺激體內CD8+T淋巴細胞分泌效應因子,提高腫瘤免疫的治療效果[8]。本研究使用一種富含SFN的西蘭花提取物作為膳食補充劑,探究長期攝入該提取物對健康小鼠腸道菌群及外周血CD8+T淋巴細胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器蒸餾水、不含SFN的西蘭花提取物、含0.3 g/L SFN的西蘭花提取物,由普洱祺云生物科技有限公司提供。FITC標記的CD45單抗、BV510標記的CD3單抗、AF700標記的CD8單抗、PE-Cy7標記的CD69單抗、BV421標記的IL-2單抗、BV785標記的TNF-α單抗和Zombie NIR Fixable Viability試劑盒購自北京Biolegend公司。DxFLEX 流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產品。

1.2 實驗動物和分組雌性4周齡C57BL/6N小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司,合格證編號:20210714Abzz0619000778。將15只小鼠隨機分為空白對照組(control group,CON)、陰性對照組(negative control,NC)、SFN組,每組5只。SFN組給予含0.3 g/L SFN的西蘭花提取物125 μL灌胃。NC組和CON組分別給予不含SFN的西蘭花提取物及蒸餾水125 μL灌胃。每天灌胃1次,連續4周。所有動物實驗均經鄭州大學倫理委員會批準。

1.3 體重測量實驗開始后每2 d測量1次小鼠體重,均在灌胃前進行。

1.4 外周血采集與指標檢測實驗最后1天,將小鼠尾尖部剪去約 0.5 mm,從尾根向尾尖擠壓按摩取血。

1.4.1CD8+T淋巴細胞活化情況 向小鼠尾靜脈血中加入紅細胞裂解液,室溫孵育10 min,離心后棄上清,得到外周血單個核細胞,加入FITC標記的CD45單抗、BV510標記的CD3單抗、AF700標記的CD8單抗和PE-Cy7標記的CD69單抗并混勻,室溫孵育15 min后上流式細胞儀檢測,以CD45+CD3+CD8+CD69+T淋巴細胞為活化的CD8+T淋巴細胞細胞,計算活化的CD8+T淋巴細胞百分比。

1.4.2CD8+T淋巴細胞中IL-2和TNF-α含量 取適量外周血單個核細胞經表面抗原染色篩選出CD8+T淋巴細胞后,加入細胞固定液,避光放置20 min;洗滌2次,用100 μL的細胞破膜劑重懸、孵育30 min,加入BV421標記的IL-2單抗、BV785標記的TNF-α單抗,避光孵育30 min;洗滌后上流式細胞儀檢測。使用平均熒光強度表示CD8+T淋巴細胞中IL-2及TNF-α的含量。

1.5 腸道菌群分析實驗結束前采集3只小鼠的新鮮糞便,于-80 ℃冰箱保存。 基因擴增及后續生物信息學分析均由上海百趣生物醫學科技有限公司提供。通過OmicShare Tools進行主成分分析(principal component analysis,PCA)、主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)以及非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析。PCoA中使用Bray-Curtis距離矩陣反映兩個群落之間的差異性。

1.6 統計學處理采用GraphPad Prism 9.1.1分析數據。各組小鼠不同時間點體重的比較采用重復測量數據的方差分析,活化的CD8+T淋巴細胞百分比、IL-2和TNF-α含量及腸道菌群相對豐度的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。采用Pearson相關分析衡量IL-2和TNF-α含量與腸道菌群相對豐度的相關性。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組小鼠體重變化3組小鼠體重均逐漸增加,各時間點組間差異無統計學意義(圖1)。

F組間=2.640,P=0.177;F時間=21.070,P<0.001;F交互=1.261,P=0.330。

2.2 3組小鼠CD8+T淋巴細胞活化情況SFN組小鼠外周血活化的CD8+T淋巴細胞百分比,IL-2、TNF-α含量高于CON組及NC組(表1)。

表1 3組活化的CD8+T淋巴細胞百分比和IL-2、TNF-α含量比較

2.3 3組小鼠腸道菌群組成分析3組小鼠腸道菌群組成有明顯區別(圖2)。

圖2 3組小鼠腸道菌群組成的PCA、PCoA、NMDS分析結果

2.4 3組小鼠腸道菌群組成分析

2.4.1基于門水平的腸道菌群組成 見圖3。門水平上,CON組小鼠優勢菌群為擬桿菌門(Bacteroidota)和厚壁菌門(Firmicutes),NC組及SFN組小鼠優勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門(Verrucomicrobiota)及放線菌門(Actinobacteriota)。SFN組疣微菌門相對豐度高于CON組及NC組,見表2。

表2 3組小鼠疣微菌門及阿克曼菌屬相對豐度的比較 %

圖3 3組小鼠基于門水平的腸道菌群組成分析

2.4.2基于屬水平的腸道菌群組成 見圖4。屬水平上,CON組小鼠優勢菌群有未分類的Muribaculaceae屬(Muribaculaceae_unclassified)、乳桿菌屬(Ligilactobacillus)、另枝菌屬(Alistipes)和薩科瑞莫納斯屬(Candidatus_Saccharimonas)等。NC組小鼠優勢菌群有未分類的Muribaculaceae屬、乳桿菌屬、阿克曼菌屬(Akkermansia)和腸桿菌屬(Enterorhabdus)等。SFN組小鼠腸道優勢菌群有未分類的Muribaculaceae屬、乳桿菌屬、阿克曼菌屬、未分類的梭菌屬_UCG-014(Clostridia_UCG-014_unclassified)等。SFN組小鼠腸道中阿克曼菌屬相對豐度大于NC和CON組,見表2。

圖4 3組小鼠基于屬水平的腸道菌群組成

2.5 外周血CD8+T淋巴細胞IL-2及TNF-α的含量與腸道阿克曼菌屬相對豐度的相關性腸道阿克曼菌屬的相對豐度與外周血CD8+T淋巴細胞中IL-2及TNF-α的含量呈正相關(r=0.934和0.664,P<0.05),見圖5。

圖5 外周血CD8+T淋巴細胞中IL-2和TNF-α含量與腸道阿克曼菌屬相對豐度的相關性

3 討論

SFN是來源于植物的一種營養素,對免疫系統有多種作用。它一方面可以減輕腸炎小鼠的腸道炎癥反應[9],抑制輔助性T細胞介導的自身免疫性疾病[10];另一方面可以通過增強效應T細胞的功能,抑制髓源抑制性細胞,進而增強抗腫瘤作用[1]。

腸道菌群作為機體“第二基因組”,參與機體的各種生理活動。研究[11]發現,腸道菌群是調節宿主免疫反應的關鍵因素之一,一些有益菌能夠調節樹突狀細胞、巨噬細胞、淋巴細胞的功能,增強其對病原體的清除能力。結直腸癌、乳腺癌患者腸道內乳桿菌、梭菌等可通過其代謝物促進CD8+T淋巴細胞的抗腫瘤作用[8,12]。

本研究結果顯示,連續攝入富含SFN的西蘭花提取物對小鼠體重增長無影響,說明長期連續攝入富含SFN的西蘭花提取物對小鼠生長無損害;腸道菌群分析結果顯示,連續攝入富含SFN的西蘭花提取物后小鼠腸道中疣微菌門和阿克曼菌屬的相對豐度明顯增加;SFN組CD8+T淋巴細胞中IL-2和TNF-α含量增高,且阿克曼屬菌相對豐度與CD8+T淋巴細胞中IL-2和TNF-α含量呈正相關。

阿克曼菌屬包含許多腸道有益菌,如嗜黏蛋白阿克曼菌。該菌以腸道表面黏蛋白作為氮源、碳源和能量來源,可以保護腸道屏障的完整性[13],缺乏會引起一系列疾病[14]。在腫瘤治療過程中,腸道中的阿克曼菌可以增強腫瘤對免疫檢查點抑制劑的應答[15],它分泌的胞外囊泡也可以提高CD8+T淋巴細胞的比例,抑制前列腺癌的增殖[16]。結合本研究結果推測,通過攝入SFN增加腸道阿克曼菌屬的相對豐度,進一步活化外周血CD8+T淋巴細胞,或許可以輔助抗腫瘤。

綜上所述,長期攝入富含SFN的西蘭花可以調節宿主腸道菌群,通過提高腸道中阿克曼菌屬的相對豐度,促進CD8+T淋巴細胞活化,增強清除病原體的能力。本研究有助于SFN相關益生菌產品的開發,為后續藥物研發提供理論基礎。