胎兒末端染色體非平衡易位遺傳方式的CNV-seq聯(lián)合G顯帶核型分析

侯雅勤,時(shí)盼來,代 鵬,陳 鐸,白 瑩,孔祥東

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心 鄭州 450052

末端染色體非平衡易位(terminal non-balanced chromosomal translocation,TNCT)指染色體末端分別存在缺失和重復(fù),可導(dǎo)致產(chǎn)前超聲胎兒結(jié)構(gòu)異常,流產(chǎn)和患兒發(fā)育遲滯、心臟異常、智力低下等[1]。TNCT的原因可能是父母染色體平衡易位,也可能是胎兒新發(fā)變異。染色體平衡易位攜帶者具有隱匿性,攜帶者本人多表型和智力正常,但是與核型正常的配偶婚育,增加了流產(chǎn)和染色體非平衡患兒出生的風(fēng)險(xiǎn)[2]。

目前關(guān)于TNCT多為單個(gè)病例的報(bào)道[3-4],缺乏遺傳方式統(tǒng)計(jì)和溯源分析。本研究采用胎兒拷貝數(shù)變異檢測(cè)(copy number variation sequencing,CNV-seq)和父母G顯帶核型分析技術(shù),探究TNCT的發(fā)生率、遺傳方式,并為臨床遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2018年6月至2021年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行產(chǎn)前診斷或流產(chǎn)的胎兒17 248例,經(jīng)CNV-seq檢測(cè),結(jié)果為兩條末端染色體分別存在缺失和重復(fù)的TNCT胎兒88例,其中59例胎兒父母自愿進(jìn)行G顯帶核型分析或原位熒光雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測(cè)。所有家屬均簽署知情同意書,本研究獲得該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào):2019-KY-418。

1.2 標(biāo)本采集超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹行羊膜腔穿刺術(shù)取絨毛或羊水,用于CNV-seq和短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)位點(diǎn)檢測(cè),留存3 mL羊水離心后凍存?zhèn)浞?。取流產(chǎn)胎兒絨毛或皮膚組織,用生理鹽水清洗后,進(jìn)行CNV-seq和STR位點(diǎn)檢測(cè)。

1.3 CNV-seq和STR位點(diǎn)檢測(cè)使用DNA提取試劑盒提取羊水或絨毛DNA,并測(cè)定DNA濃度。經(jīng)STR檢測(cè)(基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)有限公司),均無母源和外源污染,進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)。使用染色體CNV-seq檢測(cè)試劑盒(北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)定量與混合后,用基因測(cè)序儀(Nextseq CN 500)進(jìn)行高通量測(cè)序。依據(jù)2019年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)評(píng)分指南[5]進(jìn)行CNV分析。

1.4 G顯帶核型分析和FISH檢測(cè)G顯帶核型分析:取父母的肝素鋰抗凝外周血,進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。參照ISCN2020對(duì)平衡易位核型進(jìn)行描述,計(jì)數(shù)25個(gè)核型,分析5個(gè)核型,由具備產(chǎn)前診斷資質(zhì)人員出具診斷報(bào)告。

FISH檢測(cè):父母外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng),制片,用定制FISH探針原位雜交、洗脫及封片后,在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。FISH定制探針和試劑由北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所提供。

2 結(jié)果

17 248例中88例(49例產(chǎn)前診斷和39例流產(chǎn)病例)檢出TNCT,檢出率為0.51%。其中59例(30例產(chǎn)前和29例流產(chǎn)病例)行G顯帶核型分析或FISH檢測(cè),結(jié)果顯示32例(54.24%)為父母染色體平衡易位,27例(45.76%)為胎兒新發(fā)變異,59例的CNV-seq和遺傳方式見表1、2和圖1～3。

圖1 R6胎兒父親(左)和母親(右)G顯帶核型分析結(jié)果

圖2 R6胎兒CNV-seq結(jié)果

圖3 R6胎兒父親FISH檢測(cè)結(jié)果

表1 產(chǎn)前診斷病例CNV-seq檢測(cè)結(jié)果和遺傳方式

表2 流產(chǎn)病例CNV-seq檢測(cè)結(jié)果和遺傳方式

49例產(chǎn)前病例中,28例胎兒超聲異常,其中頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency,NT)增厚11例;無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)(NIPT)高風(fēng)險(xiǎn)12例,僅次于超聲異常。39例流產(chǎn)病例中,35例為孕早期胚胎停育或無胎心,4例為孕中期胎兒超聲嚴(yán)重結(jié)構(gòu)異常,1例為NT增厚。

3 討論

本研究17 248例中共檢出88例TNCT,檢出率為0.51%;對(duì)其中59例進(jìn)行溯源分析,發(fā)現(xiàn)32例(54.24%)為父母染色體平衡易位導(dǎo)致,27例(45.76%)為胎兒新發(fā)變異。染色體平衡易位攜帶者由于相互易位的染色體在減數(shù)分裂期間形成四射體,產(chǎn)生大量異常配子[6],生育TNCT后代的概率較大。但是對(duì)于父母核型正常而胎兒為TNCT的家系,其發(fā)生原因可能是父母生殖腺嵌合,即外周血核型正常,生殖細(xì)胞為平衡易位核型。目前報(bào)道生殖腺嵌合的多為非整倍體異常和基因突變病例[7-9],未見平衡易位的報(bào)道。父母染色體核型正常,受精卵在后期分裂中發(fā)生易位也可能導(dǎo)致胚胎新發(fā)異常。本研究顯示R16、R21、F27和F29等9例胎兒的TNCT是嵌合型,異常比例為30%～70%,其父母染色體核型均為正常,推測(cè)易位可能發(fā)生于形成受精卵之后。但也有胎兒嵌合TNCT是由于父母染色體平衡易位導(dǎo)致的報(bào)道[10]。目前未見對(duì)易位發(fā)生在受精卵形成之前還是之后的研究,因此胎兒新發(fā)非平衡易位機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

TNCT胎兒在產(chǎn)前多表現(xiàn)為超聲異常[1]。本研究中胎兒超聲異常28例,以NT增厚最為常見。NT增厚提示染色體異常、胎兒心臟和其他結(jié)構(gòu)畸形等風(fēng)險(xiǎn)增加[11]。CNV-seq檢測(cè)不僅揭示了胎兒超聲異常遺傳學(xué)原因,還可以預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局。對(duì)于CNV-seq結(jié)果正常且不伴其他結(jié)構(gòu)異常的單純NT增厚,妊娠結(jié)局大多良好[12]。而對(duì)于CNV-seq結(jié)果為致病性的胎兒,應(yīng)在孕早期終止妊娠,減少異常胎兒給孕婦和家庭帶來的傷害。

染色體平衡易位攜帶者遺傳物質(zhì)總量保持不變,除非斷裂點(diǎn)存在致病基因,多無明顯表型,部分伴有不良孕產(chǎn)史,具有較強(qiáng)的隱匿性[13]。G顯帶核型分析目前是檢測(cè)平衡易位的經(jīng)典技術(shù),但其準(zhǔn)確度依賴于核型制備技術(shù)和分析人員的專業(yè)能力,有一定的局限性。本研究R6胎兒父母的核型均未見明顯異常,根據(jù)胎兒CNV-seq結(jié)果設(shè)計(jì)FISH探針,診斷為父方11號(hào)和17號(hào)染色體平衡易位。由于易位片段大小相近,條帶形態(tài)類似,導(dǎo)致平衡易位的核型與正常核型難以分辨,這類誤判在以往多有報(bào)道[14-15]。因此結(jié)合胎兒CNV-seq結(jié)果,對(duì)父母進(jìn)行核型分析或FISH檢測(cè),可以減少漏檢。

平衡易位家系多有不良孕產(chǎn)史,給孕婦身體和心理帶來極大的創(chuàng)傷,多發(fā)異?；純旱某錾o家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。本研究顯示88例TNCT胎兒中,僅有6個(gè)(6.8%)家系是已知平衡易位攜帶者,59個(gè)(67.05%)家系選擇溯源分析并明確了再次妊娠的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究聯(lián)合CNV-seq和G顯帶核型分析技術(shù),統(tǒng)計(jì)了TNCT的發(fā)生率,有利于增強(qiáng)臨床和產(chǎn)前篩查研究者對(duì)TNCT的認(rèn)識(shí)和重視程度,可為臨床遺傳咨詢提供依據(jù)。通過對(duì)TNCT胎兒父母進(jìn)行溯源分析,提高了平衡易位攜帶者的檢出率,針對(duì)這類家庭進(jìn)行遺傳指導(dǎo),可避免不良孕產(chǎn)結(jié)局,對(duì)降低缺陷胎兒孕育和提高人口素質(zhì)具有重要意義。