精氨酸對(duì)變異鏈球菌生物膜及牙骨質(zhì)再礦化作用的體外研究

王素蘋,方立新,陶地豪,張宜爽,郭安迪,劉 飛

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052

根面齲是一種發(fā)生在牙根面的細(xì)菌感染性疾病,發(fā)生位置特殊且發(fā)病率高,徹底去除齲壞組織和干燥窩洞較困難,治療難度相對(duì)較大,臨床上應(yīng)以病因預(yù)防和早期治療為主。變異鏈球菌作為主要致齲菌,具有產(chǎn)酸、耐酸和酵解有機(jī)物的特點(diǎn),在根面齲發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[1],因此,抑制變異鏈球菌生物膜的形成可有效預(yù)防根面齲的發(fā)生。目前根面齲的治療效果尚不令人滿意,如何在其脫礦早期通過再礦化終止齲損、改善預(yù)后逐漸受到關(guān)注[2-3]。精氨酸是人體必需的氨基酸,也是一種有效的再礦化的成分,主要存在于唾液中[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn),精氨酸不僅可被部分口腔細(xì)菌代謝利用而產(chǎn)堿,阻止致齲菌產(chǎn)酸和耐酸菌生長,抑制牙菌斑生物膜形成;還能有效促進(jìn)Ca、P離子在牙體表面沉積,誘導(dǎo)脫礦牙體組織再礦化。因此,本實(shí)驗(yàn)觀察了不同質(zhì)量濃度精氨酸處理后變異鏈球菌生物膜產(chǎn)酸情況及生物膜細(xì)菌活性,分析精氨酸對(duì)變異鏈球菌致齲力的影響,并通過建立根面齲模擬口內(nèi)再礦化過程,進(jìn)一步分析精氨酸在早期根面齲發(fā)生后的治療效果,以探究精氨酸在根面齲病因預(yù)防及早期治療方面的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌培養(yǎng)和細(xì)菌懸液的制備取-80 ℃凍存的變異鏈球菌ATCC 25175(河南省醫(yī)藥科學(xué)院生物與免疫實(shí)驗(yàn)室),常規(guī)復(fù)蘇后接種于腦心浸液(brain heart infusion agar,BHI)瓊脂培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫厭氧環(huán)境(80%的N2,10%的CO2,10%的H2;均為體積分?jǐn)?shù))中培養(yǎng)24 h后挑取單克隆菌株,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,制備細(xì)菌懸液。用PBS將細(xì)菌懸液稀釋至1×107CFU/mL,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 精氨酸溶液的配制及生物膜的形成將精氨酸粉末(北京索萊寶科技有限公司)溶于10.0 g/L的BHI蔗糖液體培養(yǎng)基中,配制成含有5.0、7.5、15.0和30.0 g/L精氨酸的液體培養(yǎng)基,作為實(shí)驗(yàn)組,以不加精氨酸的10.0 g/L BHI蔗糖液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組,121 ℃高壓滅菌20 min,備用。

1.3 精氨酸對(duì)變異鏈球菌生物膜產(chǎn)酸及生物膜量的影響

1.3.1生物膜的制備 將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)基分別加入24孔板中,每組4個(gè)復(fù)孔,每孔2 mL。每孔加入200 μL變異鏈球菌懸液,37 ℃恒溫厭氧環(huán)境過夜,培養(yǎng)形成成熟的變異鏈球菌生物膜,備用。

1.3.2生物膜產(chǎn)酸的測定 從培養(yǎng)24 h的變異鏈球菌生物膜培養(yǎng)液中每孔取樣1 mL,轉(zhuǎn)移到新的24孔板中,用pH 計(jì)(瑞士 Mettler-Toledo公司)測定pH,每組重復(fù)測定4次。

1.3.3生物膜量的測定 吸除24孔板中培養(yǎng)液,PBS輕柔漂洗3次,去除生物膜表面浮游細(xì)菌及殘留培養(yǎng)液。每孔加入100 μL甲醛于室溫下固定15 min,PBS沖洗去除甲醛,風(fēng)干;加入100 μL 1.0 g/L 結(jié)晶紫溶液,室溫下浸染30 min后吸出,PBS漂洗3遍,風(fēng)干;加入100 μL冰乙酸溶液,37 ℃孵育30 min。吸取200 μL溶有結(jié)晶紫的冰乙酸溶液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中,酶標(biāo)儀測定590 nm處的吸光度,表示各組生物膜量,每組重復(fù)測定4次。

1.4 精氨酸對(duì)根面齲牙骨質(zhì)再礦化的影響

1.4.1根面齲模型建立及牙骨質(zhì)再礦化模擬 收集表面無齲壞的人離體前磨牙48顆,刮除牙周膜及牙石后于釉牙骨質(zhì)界下2 mm處行冠根分離。用金剛砂片切取4 mm×4 mm×2 mm的牙組織塊,碳化硅砂紙流水下磨平、拋光。超聲振蕩除去碎屑及玷污層,自然干燥后以牙骨質(zhì)面作為實(shí)驗(yàn)區(qū)并外涂雙層耐酸指甲油保護(hù)。將牙骨質(zhì)塊放置于人工酸蝕液中37 ℃脫礦處理96 h,建立早期根面齲模型。取8塊不進(jìn)行脫礦處理的酸蝕牙骨質(zhì)塊作為陰性對(duì)照,以不加精氨酸的人工唾液組為對(duì)照組,將精氨酸粉末溶于人工唾液中,制備7.5、15.0和30.0 g/L的精氨酸溶液,將已形成根面齲的樣本隨機(jī)分為4組,每組10塊。各組樣本分別浸泡于人工唾液、7.5、15.0和30.0 g/L的精氨酸溶液中,20 min/d,操作完畢后放回37 ℃人工唾液(每48 h更換一次)中。連續(xù)操作20 d,模擬早期根面齲形成后牙骨質(zhì)在口腔內(nèi)的再礦化過程。

1.4.2牙骨質(zhì)表面物理形態(tài)的觀察 在各組中隨機(jī)選取4塊牙組織,PBS漂洗3次,戊二醛溶液4 ℃避光固定12 h,梯度濃度乙醇脫水,干燥后噴金,掃描電鏡(QUANTA FEG 250型,美國FEI公司)下觀察牙骨質(zhì)表面形態(tài)。每塊牙組織選擇 3個(gè)位點(diǎn),采集鏡下圖片,選取具有代表性的圖片,觀察牙骨質(zhì)塊表面形貌的區(qū)別。

1.4.3牙骨質(zhì)表面化學(xué)元素的構(gòu)成 在各組再礦化模型中隨機(jī)選取4個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?用PBS漂洗3次,每個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ碗S機(jī)選擇3個(gè)位點(diǎn),置于能譜儀下分析各元素的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組變異鏈球菌生物膜產(chǎn)酸和生物膜量,以及各組牙骨質(zhì)表面化學(xué)元素含量的差異,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 精氨酸對(duì)變異鏈球菌生物膜產(chǎn)酸和生物膜量的影響見表1。由表1可知,與對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組pH值均有所升高,且精氨酸質(zhì)量濃度越高,pH值也越高(P<0.001),說明變異鏈球菌生物膜在加入精氨酸處理后產(chǎn)酸量下降。與對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組精氨酸含量越高,生物膜量越少(P<0.001),提示精氨酸對(duì)細(xì)菌生物膜的形成具有抑制作用。

表1 精氨酸對(duì)變異鏈球菌生物膜產(chǎn)酸和生物膜量的影響

2.2 體外根面齲模型建立見圖1。掃描電鏡下觀察可見,未經(jīng)人工唾液脫礦前的牙骨質(zhì)表面較為平坦(圖1A),或有少許裂隙(圖1B),表面紋路似魚鱗狀(圖1C),排列整齊。脫礦后,牙骨質(zhì)表面呈現(xiàn)鏤空疏松結(jié)構(gòu),膠原纖維交織成復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),深部有大量牙本質(zhì)小管口敞開(圖1D);提示根面齲模型構(gòu)建成功。

A:脫礦前牙骨質(zhì)表面(×5 000);B:脫礦前牙骨質(zhì)表面裂隙(×3 000);C:脫礦前魚鱗狀紋路(×2 000);D:脫礦后牙骨質(zhì)表面疏松結(jié)構(gòu)(×3 000)。

2.3 各組牙骨質(zhì)表面物理形態(tài)的變化見圖2。與酸蝕后牙骨質(zhì)塊相比,對(duì)照組牙骨質(zhì)表面形貌改變并不顯著(膠原纖維排列均較松散,呈網(wǎng)狀,表面可見鏤空疏松結(jié)構(gòu))。7.5 g/L精氨酸組牙骨質(zhì)塊表面可見明顯的牙本質(zhì)小管,牙本質(zhì)小管口周圍未見明顯再礦化沉積物質(zhì),牙本質(zhì)小管口敞開;15.0 g/L精氨酸組牙骨質(zhì)片表面輕微凹陷,電鏡下示表面大顆粒狀沉積物;30.0 g/L精氨酸組牙骨質(zhì)片表面平坦,可見大量白色沉積物平鋪在牙骨質(zhì)面,牙本質(zhì)小管口被大量白色顆粒狀沉積物封閉,表面未見明顯牙本質(zhì)小管口敞開與鏤空疏松結(jié)構(gòu)。

A:對(duì)照組;B:7.5 g/L精氨酸組;C:15.0 g/L精氨酸組;D:30.0 g/L精氨酸組。

2.4 各組牙骨質(zhì)表面化學(xué)元素構(gòu)成的比較牙骨質(zhì)表面主要含有Ca、P、Na、O、C等元素,能譜儀下分析各元素的含量如圖3和表2所示。各實(shí)驗(yàn)組Ca、P含量都有所升高,且精氨酸含量越高,Ca、P含量升高越明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:未脫礦;B:脫礦后;C:對(duì)照組;D:7.5 g/L精氨酸組;E:15.0 g/L精氨酸組;F:30.0 g/L精氨酸組。

表2 各組牙骨質(zhì)表面化學(xué)元素含量比較 %

3 討論

齲病的發(fā)生發(fā)展與口腔微生態(tài)失衡密切相關(guān),口腔微生態(tài)內(nèi)的酸堿代謝影響著微生物群落的組成及性狀,是調(diào)控口腔微生態(tài)平衡的重要因素。牙菌斑生物膜中的變異鏈球菌作為主要致齲菌,產(chǎn)酸及耐酸性是其主要的毒力因子和致齲因素,其黏附于牙面形成的生物膜對(duì)抗菌藥物和免疫系統(tǒng)均具有很強(qiáng)的抵抗力。近年來有學(xué)者[6]發(fā)現(xiàn),牙菌斑生物膜中的產(chǎn)堿活動(dòng),尤其是精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)參與的精氨酸代謝活動(dòng)以及尿素酶作用下的尿素水解反應(yīng)代謝,可以有效調(diào)控微生態(tài)酸堿平衡,從而有利于齲病防治。

精氨酸作為唾液黏蛋白可吸附于牙齒表面,調(diào)節(jié)細(xì)菌代謝產(chǎn)氨,創(chuàng)造堿性環(huán)境,有效抑制變異鏈球菌生物膜對(duì)牙面的黏附。本實(shí)驗(yàn)通過向蔗糖培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的精氨酸作用于變異鏈球菌生物膜,并通過檢測菌液生長pH值及結(jié)晶紫染色法驗(yàn)證精氨酸對(duì)生物膜產(chǎn)酸代謝及生成量的影響。結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)組的生物膜產(chǎn)酸量及細(xì)菌總量較對(duì)照組顯著降低,精氨酸可有效抑制致齲菌產(chǎn)酸及增殖,且精氨酸含量越高,作用效果越明顯,這與Vaziriamjad等[7]的研究結(jié)果相符。其可能的機(jī)制為:①精氨酸能夠促進(jìn)細(xì)菌的精氨酸代謝途徑。一方面,前期研究[6]證實(shí)細(xì)菌的精氨酸代謝主要通過精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)進(jìn)行,終產(chǎn)物為鳥氨酸、氨、二氧化碳和腺苷三磷酸;精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)由一系列酶構(gòu)成,包括精氨酸脫亞胺酶、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶和氨基甲酸激酶,隨著精氨酸質(zhì)量濃度的增加,其相應(yīng)的堿性代謝產(chǎn)物就越多。另一方面,編碼精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)的基因通常位于一個(gè)操縱子中,環(huán)境刺激可調(diào)控其表達(dá);在多數(shù)口腔細(xì)菌中,精氨酸及低pH值可上調(diào)精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)[8]。②精氨酸使變異鏈球菌gtfB、gtfC基因表達(dá)降低,影響葡聚糖的合成后抑制變異鏈球菌附著,減少菌斑形成而消除致齲環(huán)境[9]。③精氨酸的正電荷基團(tuán)能與牙本質(zhì)表面的負(fù)電荷基團(tuán)結(jié)合,從而提高牙齒表面的pH值[10],在本實(shí)驗(yàn)中則可能與精氨酸吸附菌懸液中的負(fù)電荷基團(tuán)有關(guān)。

臨床上牙骨質(zhì)齲呈淺碟形,齦下菌斑中的微生物產(chǎn)酸會(huì)導(dǎo)致牙體組織脫礦,Ca、P離子從牙骨質(zhì)表面流失,羥基磷灰石晶體溶解,使礦物質(zhì)平衡狀態(tài)紊亂,從而發(fā)生齲壞[11]。精氨酸在口腔內(nèi)主要分布于唾液中,是唾液黏蛋白的一種成分,能夠通過唾液黏蛋白的半透膜作用黏附在牙齒表面,并進(jìn)而調(diào)節(jié)口腔菌叢的平衡及離子間的動(dòng)態(tài)平衡。精氨酸的羧基和氨基側(cè)鏈可靜電吸引Ca、P離子并通過化學(xué)鍵的作用形成高穩(wěn)定的精氨酸-Ca-P復(fù)合物,促進(jìn)脫礦牙體組織的再礦化。

因此,本實(shí)驗(yàn)通過建立根面齲模型,利用3種不同質(zhì)量濃度的精氨酸溶液處理以模擬口內(nèi)再礦化過程,掃描電鏡及能譜分析結(jié)果表明:經(jīng)精氨酸處理后的牙骨質(zhì)表面結(jié)構(gòu)更加緊密,有大塊沉積物形成,且Ca、P離子含量升高,提示精氨酸對(duì)脫礦牙骨質(zhì)具有再礦化的效果。可能的作用機(jī)制是:精氨酸的正電荷基團(tuán)可與牙本質(zhì)表面的負(fù)電荷基團(tuán)結(jié)合,吸附Ca、P離子,促進(jìn)其沉積于牙面和牙本質(zhì)小管中[8]。但這部分實(shí)驗(yàn)仍有不足之處,比如分組情況基于既往文獻(xiàn)[12]所用精氨酸質(zhì)量濃度,缺乏更精細(xì)的質(zhì)量濃度分組,在接下來的工作中應(yīng)當(dāng)完善其他質(zhì)量濃度條件下的再礦化實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步探究再礦化作用機(jī)制。

綜上所述,本研究初步證實(shí)了精氨酸對(duì)變異鏈球菌生物膜有良好的抑制作用,且一定程度上可以有效促進(jìn)牙骨質(zhì)再礦化,提示精氨酸在根面齲的預(yù)防和早期治療方面有良好的應(yīng)用前景。但由于口腔環(huán)境的復(fù)雜性,仍需要大量的更深入的研究以探討精氨酸在根面齲臨床防治方面的長期效果。