紫苜蓿提取物抵抗光損傷的作用及其機理研究

黃芳 周利丹 盧伊娜

[摘要]目的：通過多種評價方法，探究紫苜蓿提取物（Medicago Sativa extract，MS）抵抗光損傷的作用及其機理。方法：通過體外清除ABTS自由基模型，高頻藍光（High-energy visible light，HEVL）照射角質形成細胞（HaCaT）產生ROS自由基模型，紫外線照射HaCaT后細胞活力、產生前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）和基質金屬蛋白酶1（Matrix metalloproteinase 1，MMP-1）模型及HEVL誘導的人體皮膚損傷模型來驗證MS的抗光損傷功效。結果：MS具有良好的抗氧化能力，其清除ABTS自由基的IC50為0.048%，質量分數為0.25%～0.5%的MS可顯著減少HEVL照射下的HaCaT細胞中ROS活性氧的產生，質量分數為0.1%～0.3%的MS劑量依賴性地增加紫外線輻照損傷模型中細胞存活率，并降低PGE2和MMP-1的表達量。在HEVL誘導的人體皮膚損傷模型中，質量分數為0.5%～5%的MS能明顯降低皮膚紅斑的形成，增加皮膚亮度，減少黑色素的生成。結論：MS作為一種植物來源的抗光損傷型原料，可應用于舒緩、修護及抗皺類功效宣稱的產品中。

[關鍵詞]紫苜蓿提取物；光損傷；抗氧化；高頻藍光；紫外線；抗皺

[中圖分類號]R285? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）01-0058-05

Mechanism of the Medicago Sativa Extract Against Ultraviolet and Blue Light Induced Photodamage

HUANG Fang，ZHOU Lidan，LU Yina

（JAKA BIOTECH Co.，LTD.，Shanghai 200241，China）

Abstract： Objective? To explore the effect and mechanism of Medicago Sativa extract （MS） against light damage through various evaluation methods. Methods? The ABTS free radical detection model was built in vitro， the ROS free radical detection model was produced by high energy visible light （HEVL） irradiation on keratinocytes （HaCaT）， the cell viability， production of prostaglandin E2 （PGE2） and matrix metalloproteinase-1 （MMP-1） models after UV irradiation on HaCaT， and the human skin injury model induced by HEVL were used to verify the efficacy of MS. Results? MS had a good antioxidant capacity. The IC50 of MS scavenging ABTS free radicals was 0.048%. MS with a mass fraction of 0.25%-0.5% could significantly reduce ROS production in HaCaT cells exposed to HEVL. MS with a mass fraction of 0.1%-0.3% increased the cell survival rate in UV irradiation injury model in a dose-dependent manner， and decreased the expression of prostaglandin E2 （PGE2） and matrix metalloproteinase-1 （MMP-1）. In the human skin injury model induced by HEVL， MS with a mass fraction of 0.5%-5% can significantly reduce the formation of skin erythema， increase skin brightness and reduce the formation of melanin. Conclusion? As a kind of anti photodamage raw material from plants， MS can be used in the products claimed to have soothing， repairing and anti wrinkle effects.

Key words： Medicago Sativa extract; photodamage; antioxidant; high-energy visible light; ultraviolet; anti-wrinkle

太陽光譜主要由紫外線（UV）、可見光和紅外線組成[1]。皮膚是接受陽光輻射最多的器官，陽光慢性暴露會引起皮膚慢性光損傷。而UV和部分可見光是造成皮膚光損傷、老化甚至皮膚癌的最主要誘因[2]。UV按波長可分為UVC、UVB和UVA，能夠到達地球表面的UV由95%的UVA（320～400 nm）以及5%的UVB（280～320 nm）組成[3]。UVB主要影響表皮層，導致曬傷細胞的產生，UVA可同時到達表皮層和真皮層，引發光損傷和光老化[3]。皮膚細胞在接受UVB或UVA照射之后，細胞產生損傷，合成并分泌多種細胞因子，如PGE2、白介素、MMP-1等，導致細胞活力下降、細胞應激反應增多、膠原蛋白降解等，進而造成皮膚光損傷、光老化[4-7]。可見光中則以波長范圍為（400～500 nm）的藍光能量最高，對人體傷害最大[8]，其中HEVL對皮膚的影響最大，高劑量的HEVL作用于皮膚，誘導大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產生，激活細胞應激反應，誘發皮膚紅斑反應和色素沉著，同時加速皮膚衰老、松弛等[9-10]。

紫苜蓿，主要生長于西藏、新疆等高海拔、高日照地區，富含蛋白質、黃酮類成分，一般作為牧草使用，較少有文獻報道其抵抗光損傷的作用。本研究將干紫苜蓿剪碎后通過特定的工藝進行提取，富集黃酮成分，獲得紫苜蓿提取物（MS），于HEVL、UVB、UVA誘導的細胞或皮膚模型中驗證其作用機理和臨床效果，為其在光防護中的應用提供依據。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：紫苜蓿，收購自西藏拉薩；人角質形成細胞（HaCaT），北納創聯（蘇州）有限公司；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素（PS），美國Gibco公司；中性紅染液、抗壞血酸、ROS染色試劑盒，美國Sigma公司；PGE2、MMP-1檢測試劑盒，欣博盛生物科技有限公司；ABTS試劑盒，碧云天生物科技有限公司；DAPI封片劑，美國abcam公司。多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；中波紫外線治療儀、長波紫外線治療儀、紅藍光治療儀，希格瑪高技術有限公司；正置熒光顯微鏡，德國Leica公司；皮膚亮度測試探頭、黑色素和紅色素測試探頭，德國CK公司；VISIA，美國Canfield公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MS制備及細胞毒性檢測：紫苜蓿切段后90℃水提2 h，加入聚酰胺吸附，再加入70% 1，3-丁二醇解吸附，濾液絮凝、過濾后即得，總黃酮含量為2.5%，并使用分光光度計檢測MS在紫外波段和可見光波段的光吸收作用。將HaCaT細胞以2×105個/孔接種至96孔板中，每孔100 μl。次日，使用DMEM完全培養基梯度稀釋MS，使濃度為終濃度的2倍，每孔100 μl加入孔板中，正常對照組每孔加100 μl完全培養基，每組設置至少3個復孔，于37℃、5% CO2恒溫培養箱繼續孵育24 h后，使用中性紅染色法檢測細胞活力。

1.2.2 ABTS自由基清除檢測：取ABTS溶液、氧化劑溶液按比例混勻，室溫避光靜置12～16 h，使用去離子水稀釋50倍[11]。將維生素C（VC）、MS配制成8個不同濃度點，于96孔板上依次加入20 μl測試樣品、180 μl ABTS工作液，混勻后室溫孵育10 min，于酶標儀405 nm處檢測吸光度值（A）。空白對照為樣品溶液，陰性對照為ABTS溶液，按以下公式計算抑制率，并分析半數抑制濃度（IC50）。抑制率（%）=（A陰性對照-A樣品）/A陰性對照×100%。

1.2.3 HEVL誘導細胞ROS檢測：將HaCaT細胞以1×105個/孔接種至預先鋪設爬片的24孔板中，培養過夜。細胞板更換培養基，加入或不加入0.25%、0.5%（wt）的MS，然后將含樣品的培養板置于藍光輻照儀正下方10 cm的距離，藍光照射10 min，總劑量為72 J/cm2[12-13]。37℃、5% CO2恒溫培養箱繼續孵育18 h后，PBS清洗細胞，在暗處每孔加入200μl ROS染液（內含熒光探針DCFH-DA），培養箱中染色1 h，洗滌并封片后置于正置熒光顯微鏡下拍照（200×）。

1.2.4 UV誘導細胞光損傷檢測：HaCaT細胞以2.5×104個/孔鋪于96孔板中，過夜培養后，加入或不加入不同濃度的MS預處理2 h，分別采用UVB（585 mJ/cm2）或UVA照射（65 J/cm2）后，繼續培養24 h。采用中性紅染色法檢測細胞活力[14]，計算公式如下：細胞活力（%）=OD 540樣品/OD 540陰性對照×100%。收集細胞培養上清液，ELISA法檢測PGE2和MMP-1表達量[15]。按以下公式計算抑制率：抑制率（%）=（表達量模型-表達量樣品）/表達量模型×100%。

1.2.5 HEVL刺激皮膚損傷檢測：選擇正常健康受試者15人，其中男5人、女10人，平均年齡約26歲。清洗手臂內側后，于恒溫恒濕室[溫度（20±2）℃，相對濕度30%～60%]干燥平衡20～30 min。標記6個1 cm×1 cm的受試區域，分別隨機涂抹0.5%、1%、2%、5%濃度的MS樣品、基質對照20 μl。待干燥后，使用藍光波段照射7 min，總劑量30 J/cm2。照射后，立即采用CL400、MX18探頭分別檢測皮膚ITA°值、黑色素含量（Melanin）、血紅素含量（Erythem），并于VISIA上拍照記錄，分析紅區程度，計算變化率[16-17]。公式如下：變化率（%）=（檢測值各組輻照藍光后/檢測值各組對應正常組–1）×100%。

1.3 統計學分析：采用GraphPad Prism 5軟件對數據進行作圖和統計分析，采用t檢驗計算組間顯著性差異，P＜0.05表示差異有統計學意義，P＜0.01表示差異有顯著統計學意義，P＜0.001表示差異有極顯著統計學意義。

2? 結果

2.1 MS的光吸收作用及細胞毒性考查：結果顯示，MS在紫外線中的UVB（280～320 nm）及UVA（320～400 nm）波段具有較明顯的吸收峰，在可見光波段中的藍光波段（400～500 nm）具有較弱的吸收作用，見圖1A。將MS添加至HaCaT細胞中，進行細胞毒性檢測，結果顯示0.5% MS細胞活力為80.67%，即后續細胞試驗中的MS使用濃度均在0.5%及以下，見圖1B。

2.2 MS對ABTS自由基的清除作用：預實驗時設置溶劑（1，3-丁二醇）對照組對ABTS自由基的清除率無影響。陽性對照VC的IC50為2.665 μg/ml，MS的IC50為0.048%。質量分數為0.1%的MS抑制率為69.8%，0.3%抑制率達到97.5%（見圖2），且與陰性對照相比差異有極顯著統計學意義（P＜0.001）。

2.3 MS對藍光誘導下ROS的作用：圖3為HEVL誘導下ROS產生量對應的熒光圖片，檢測原理為ROS能與定位于細胞質的熒光傳感器發生反應，產生熒光產物（λex=490/λem=520 nm），該熒光產物與ROS含量成正比。與陰性對照（normal）相比，72 J/cm2 HEVL照射HaCaT細胞后，綠色熒光顯著增強，說明細胞內產生了較多ROS。而0.25%、0.5%質量分數的MS同步處理細胞時，綠色熒光強度顯著下降，0.25%濃度下即與陰性對照類似，且細胞形態無明顯變化。

2.4 MS對UV誘導下細胞損傷的作用：先對UVB照射HaCaT細胞結果進行分析，結果顯示，與normal組相比，高劑量的UVB處理下，細胞活力下降至23.8%，細胞數量明顯減少，質量分數為0.1%和0.3%的MS與UVB共同處理細胞后，細胞活力分別提升至44.5%及82.3%（見圖4、圖5A）；再檢測培養上清中的PGE2可知，UVB輻照后，PGE2表達量從1 705.4 pg/ml上升至42 161.7 pg/ml，添加質量分數為0.1%和0.3%的MS與UVB共同處理細胞后，PGE2表達量分別下降至9 989.8及1 529.9 pg/ml，抑制率最大達到96.4%。說明UVB可造成細胞損傷，影響細胞活力和細胞因子表達量（見圖5B）。再對UVA照射HaCaT細胞進行分析，結果顯示，與normal組相比，UVA處理下，細胞活力下降至29.8%，細胞數量明顯減少，0.1%～0.3%的MS與UVA共同處理細胞后，細胞活力最大可提升至65.4%（見圖6A）；PGE2表達量從UVA處理前的1 139.0 pg/ml上升至11 314.1 pg/ml，0.1%～0.3%的MS與UVA共同處理細胞后，PGE2表達量最大可下降至672.5 pg/ml，下降率最大達到94.1%（見圖6B）；MMP-1表達量從UVA處理前的1 789.2 pg/ml上升至12 185.9 pg/ml，0.1%～0.3%的MS與UVA共同處理細胞后，MMP-1表達量最大可下降至142.8 pg/ml，下降率最大達到98.8%（見圖6C）。

2.5 MS對藍光誘導人體皮膚損傷的作用：預實驗時設置溶劑（1，3-丁二醇）對照組，溶劑對照組對結果無影響。36 J/cm2的HEVL照射皮膚，可立即降低皮膚ITA°值、升高皮膚黑色素和紅色素值，造成肉眼可見的皮膚變黑、變紅。而0.5%～5%的MS處理下，ITA°值呈現劑量依賴性上升，Melanin和Erythem變化率均呈現下降，在5%濃度時最大變化率較HEVL模型組可分別達到90.3%、-87.1%和-80.4%（見圖7）。1例典型受試者的VISIA拍照標準圖和紅區圖見圖8。

3? 討論

陽光照射對皮膚的不良影響是眾所周知的，太陽發射廣譜電磁輻射（EMR），能夠到達地球表面的電磁輻射主要由UVB（290～320 nm）、UVA（320～400 nm）、VL（400～700 nm）和紅外（700 nm～1 mm）輻射組成[3]。到達地球表面的陽光中，紫外線約占5%，可見光占50%，其中可見光中的藍光占可見光的75%，紅外線約占陽光的45%[18]。

日光中以紫外線輻射對人體皮膚的損傷作用最為嚴重，也研究得最為廣泛[18]。UV作用于細胞，會導致細胞損傷，細胞活力下降、細胞因子分泌量增加等負面影響[14-15]。UVB能穿過表皮到達真皮層上部，導致皮膚氧化應激增加，炎癥反應激活，DNA損傷積累等效應，使皮膚產生紅斑及色素沉著[19]。UVA穿透能力則更強，能到達真皮層底部，并且與UVB造成的急性損傷相比，UVA對慢性光損傷（如皮膚過早老化、多態光疹、免疫調節和皮膚癌）影響更為深遠[20]。最近，越來越多的證據表明，能量較低的輻射，如可見光和紅外輻射，也可能影響皮膚生理。盡管可見光中的HEVL的輻射強度不如紫外線，但由于HEVL光子的豐度更高，穿透皮膚的能力強于UVA，能到達皮下組織，因此HEVL對皮膚仍可產生相關的消極影響，如發生光轉導和氧化應激等變化，產生ROS等氧自由基，也可導致皮膚黑化，產生紅斑、色素沉著和光老化現象[18]。

綜上所述，紫外線及HEVL輻射通過造成皮膚細胞DNA損傷、一系列氧化應激反應的產生，炎癥反應的激活等反應而使皮膚表現出紅斑、水腫、蛻皮、色素沉著及光老化等現象。MS富含黃酮，可通過清除自由基、抗氧化、提升細胞活力、減少細胞因子合成來發揮光防護作用，能通過抵抗紫外線、高頻藍光等光輻射對細胞或皮膚造成的即時損傷反應或長期光老化反應，可應用于舒緩、修護及抗皺類功效宣稱的產品中。

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[收稿日期]2022-10-31

本文引用格式：黃芳，周利丹，盧伊娜.紫苜蓿提取物抵抗光損傷的作用及其機理研究[J].中國美容醫學，2024，33（1）：58-62.