3種類型煙草種質資源煙葉生物堿等化學成分差異性分析

許美玲 焦芳嬋 賀曉輝 吳興富 馮智宇

關鍵詞：煙草種質；化學成分；總植物堿；煙堿；降煙堿；煙堿轉化率

煙草中生物堿達50余種，其中最主要是煙堿、降煙堿、假木賊堿和新煙草堿等[1]，其含量煙堿>新煙草堿>降煙堿>假木賊堿[2-3]。煙堿是煙草中重要的生物堿，正常情況下，煙堿含量占總生物堿含量的93%以上[4]，降煙堿含量一般不超過總生物堿含量的3%[5]。降煙堿極易發生亞硝化反應生成亞硝酸和煙草特有亞硝基降煙堿（NNN）[6]，隨著降煙堿含量的升高，NNN含量呈直線增加[7]，煙堿轉化導致降煙堿含量增高而影響煙葉的品質和安全性[8]，而隨著煙堿轉化程度的提高，白肋煙風格下降，香氣量變少，香氣質變劣，雜氣增加，主要香氣物質含量降低[9]。研究發現，煙堿轉化率與煙堿含量呈極顯著負相關，而與降煙堿含量呈極顯著正相關；新煙堿含量和假木賊堿含量與煙堿轉化率無顯著相關關系[10]；不同類型的煙草、不同的研究材料其總生物堿、煙堿和降煙堿含量有差異。其中，總生物堿和煙堿含量曬煙>白肋煙>烤煙>馬里蘭煙>香料煙，降煙堿的含量和煙堿轉化率以白肋煙最高，烤煙最低，香料煙、馬里蘭煙和地方曬煙均存在煙堿轉化問題，降煙堿也有烤煙較高的情況[11-17]。我國國家煙草種質庫目前已編目煙草資源5267份[18]，云南也收集保存并編目煙草資源3076份，編寫出版了《煙草種質資源圖鑒》，編入各類型煙草資源1477份[19]，本項目選擇來自中國主要煙葉產區省份和美國、古巴等國家的165份3個類型煙草種質資源進行分析研究，以找出不同煙草類型、不同品種和不同來源地資源的生物堿差異，并篩選出優異資源為煙草育種、科研和生產提供材料支撐。

1材料與方法

1.1材料

從云南省煙草農業科學研究院種質庫中保存的3076份煙草種質資源中，按5%左右的比例抽取不同產地的資源，主要來自中國河南、山東、山西、安徽、貴州、黑龍江、遼寧、福建等省份及美國和古巴等國家的煙草種質資源165份，其中，烤煙141份、白肋煙18份、雪茄煙6份（表1）。試驗位于云南省玉溪市研和鎮的云南省煙草農業科學研究院試驗基地，采用隨機區組設計，重復3次，每個小區20株，行距1.20cm，株距0.50cm，每公頃施純氮97.5kg，N∶P2O5∶K2O=1.0∶0.5∶3.0，18份白肋煙種質資源施肥量加倍；種植土壤為砂壤土，pH6.41，含有機質11.20g/kg、全氮0.56g/kg、全磷1.03g/kg、全鉀6.45g/kg，有效氮84mg/kg、有效磷91mg/kg，有效鉀162mg/kg。按優質煙種植技術規范進行管理，成熟煙葉分小區采收，編稈后統一進行烘烤和晾曬調制，取中部煙葉各種質重復混合煙葉樣品，送云南三標農林科技有限公司檢測常規化學成分（總糖、還原糖、總氮、煙堿、水溶性氯、氧化鉀、淀粉）和主要生物堿（煙堿、降煙堿、新煙堿、假木賊堿）等。

1.2方法

參照YC/T159—2002測定水溶性糖含量，參照YC/T166—2003測定總蛋白質含量，參照YCT160—2002測定總植物堿含量，參照YC/T173—2003測定鉀含量，參照YC162—2002測定氯含量，參照GB/T5009.9—2003測定淀粉含量，采用氣相色譜/質譜分析煙草中的主要生物堿。按以下公式計算煙堿轉化率：煙堿轉化率=[降煙堿/（煙堿+降煙堿）]×100%。

1.3數據處理

采用Excel軟件進行數據統計分析和作圖，采用DPS軟件進行聚類分析。

2結果與分析

2.1化學成分描述性統計

由表2可知，總糖和還原糖含量最高的為烤煙種質湄潭黑團殼，雪茄煙種質Havana503b和白肋煙種質BlueStar100最低；總植物堿含量以烤煙種質自來黃2243最高，雪茄煙種質Dutch（Ohio）最低；氧化鉀含量以雪茄煙種質Havana503b最高，烤煙種質湄潭黑團殼最低。生物堿中的煙堿、降煙堿、新煙堿、假木賊堿等含量最高、最低值均為烤煙種質，煙堿轉化率以烤煙種質平板柳葉最高，白肋煙種質Burley11B最低。變異系數除降煙堿和煙堿轉化率較高（218.23%和262.74%），為強變異性，其余成分的CV為17.13%～80.40%，均為中變異性。

2.2不同類型的煙草種質資源化學成分差異

2.2.1化學成分總體差異3種類型的煙草種質資源的化學成分中，總糖、還原糖和總植物堿含量以烤煙最高，雪茄煙和白肋煙較低；總氮和氧化鉀含量以白肋煙種質為高，總氮含量烤煙和雪茄煙較低，總植物堿含量以雪茄煙Dutch（Ohio）最低，氧化鉀含量以烤煙最低，淀粉含量以烤煙最高，雪茄煙和白肋煙較低。變異系數以雪茄煙的總植物堿含量最高（106.31%），為強變異性，其余成分為中變異性。化學成分的最大值、最小值、平均值、變異系數等不同類型煙草種質間有差異，白肋煙種質的總氮含量變異系數較小（9.61%），為弱變異性，雪茄煙種質總植物堿含量的變異系數較大（106.31%），為強變異性，其余各項為中變異性；各類煙草各化學成分的極值及其對應種質中，湄潭黑團殼、小黃金0003、Burley2、GR10、Greider等種質有2項以上的最大值或最小值（表3）。

2.2.2烤煙種質資源化學成分差異141份烤煙種質煙葉的化學成分差異較大。其中，總糖含量較高（>24.00%）的7份，在18.00%～24.00%適宜范圍的33份；總氮含量除黑苗2308、黑苗白筋2338、豎把柳葉2110、自來黃2243>3.50%外，其余種質均在2.01%～3.50%適宜范圍；總植物堿含量>5.00%的2份，4.01%～5.00%的4份，3.01%～4.00%的23份，<1.50%的38份，其余種質在1.50%～3.5%之間；氧化鉀含量為4.01%～5.00%的5份，3.01%～4.00%的18份，2.01%～3.00%的83份（表4）。

2.2.3白肋煙種質資源化學成分差異18份白肋煙種質資源總糖和還原糖含量較低，分別為0.53%～2.10%和0.30%～1.79%；總氮含量較高（3.47%～5.21%）；氧化鉀含量較高（3.59%～5.32%）；總植物堿含量差異較大（0.68%～4.64%）。其中，Burley37的總植物堿含量為4.64%，Burley49、Burley11B、Burley21（V246-Rhodesia）、GR18、GR10等種質的煙堿含量均在3.01%～4.00%之間，Burley1、GR14、Ex.12、GR10A等種質總植物堿含量較低（0.68%～1.55%），其余種質煙堿含量在2.01%～3.00%之間；氧化鉀含量Burley64、GR10A、GR14等種質的氧化鉀含量>5.00%，Burley10A、Burley2、GR18、BlueStar100、GR36、Burley1、Burley11B、GR17B、Burley37、GR10、Ex.12、GR17等種質在4.01%～5.00%之間，其余種質在3.59%～4.00%之間（表5）。

2.2.4雪茄煙種質資源化學成分差異6份雪茄煙種質資源總糖和還原糖含量較低，總氮含量適中（2.08%～3.64%），總植物堿和氧化鉀含量差異較大，分別為0.41%～4.37%和1.58%～6.08%。其中，總植物堿含量以Greider最高，Dutch（Ohio）最低；氧化鉀含量以Havana503b最高，Greider最低（表6）。

2.3不同類型的煙草種質資源生物堿差異

2.3.1生物堿總體差異不同類型煙草煙堿含量范圍含量為烤煙為0.99～44.12mg/g、白肋煙3.74～37.40mg/g、雪茄煙1.01～35.42mg/g；煙堿平均含量以白肋煙最高，烤煙次之，雪茄煙最低；降煙堿均值以雪茄煙最高，烤煙次之，白肋煙最低；各類煙堿轉化率較高的種質為烤煙平板柳葉、雪茄煙Dutch（Ohio），白肋煙Burley1；煙堿轉化率均值以雪茄煙最高，烤煙次之，白肋煙最低；各類型煙葉的煙堿轉化率、降煙堿和雪茄煙的煙堿等變異系數均>100%，為強變異性，其余成分為中變異性。各類煙草各化學成分的極值及其對應種質中，Burley37、Ex.12、Greider、Havana503b、Dutch（Ohio）、自來黃2243、二性子等種質有2項以上的最大值或最小值（表7）。

2.3.2白肋煙種質資源間的生物堿差異白肋煙種質煙堿含量在30.01～40.00mg/g之間的有3份（Burley11B、Burley37、Burley49），20.01～30.00mg/g的有8份，10.00～20.00mg/g的6份，<10.00mg/g的1份（Burley1）；煙堿轉化率以Burley1最高，為52.98%，Burley37為6.33%，其余種質為0.28%～1.56%（表8）。

2.3.3雪茄煙種質資源間的生物堿差異雪茄煙種質資源的煙堿含量以Greider為最高，Dutch（Ohio）最低，其余種質在0.99～20.00mg/g之間；煙堿占比Dutch（Ohio）最低為18.67%，Havana501為79.42%，其余種質在97.95%～98.54%之間；煙堿轉化率以Dutch（Ohio）最高，為80.69%，Havana501為19.58%，其余種質≤1.33%，甚至低至0.64%（表8）。

2.3.4烤煙種質資源間的生物堿差異141份烤煙種質資源中，煙堿含量以自來黃2243最高，小黃金0003最低；松邊黃苗榆2202、晉太207、黑苗白筋2338、小尖梢、小黃金0029、豎把柳葉2116、黑柳子等種質煙堿含量在30.01～40.00mg/g之間，有100份種質的煙堿含量<20.00mg/g。煙堿轉化率在0.37%～89.64%之間，小白筋2515最低，平板柳葉最高；平板柳葉、小黃金0003、潑拉機、葵花煙2437、黔南9號、黑苗2319、尖煙洋苗、武鳴4號等種質煙堿轉化率>50.00%，黑苗2344、黑苗煙2343、大豎把2141等種質在20.01%～50.00%之間，烤煙、湄潭鐵桿煙、豎把2135、圓葉稠碼、小豎把2146、小黃金0091、晉太75、黑苗2341、晉太207、麻江柳葉煙等在5.01%～20.00%之間（表8）。

2.3.5各類煙堿轉化率較高的資源史志宏等[10]按煙堿轉化率將煙葉分為4組：非轉化株（<5%）、低轉化株（5%～20%）、中高轉化株（20%～50%）和高轉化株（>50%）。按此標準將165份資源進行分類，并列出各轉化類型的種質資源名單（烤煙21份，白肋煙和雪茄煙各2份）（表9）。

2.4不同來源煙草種質資源化學成分差異

為提高可比性和資料的可靠性，分別對不同來源的烤煙和雪茄煙類型資源進行比較分析，白肋煙為同一來源（美國），不作比較。

2.4.1不同來源烤煙種質資源化學成分差異由圖1可以看出，不同來源烤煙資源的化學成分和煙堿轉化率差異較大。各成分平均值中總糖和還原糖含量以來源于中國貴州的資源最高，中國黑龍江的資源最低（圖1A）；總植物堿以來自中國安徽的資源最高，氧化鉀含量以中國貴州的資源最高（圖1B）。煙堿、降煙堿、煙堿轉化率等均值以中國安徽的資源最高，遼寧的最低（圖1B、圖1C）；不同來源種質資源的總糖、還原糖、煙堿轉化率、煙堿、降煙堿等多個成分最大值差異較大，最小值以總糖、還原糖、總植物堿等差異較大，其余成分差異較小（圖1D、圖1E）。變異系數以降煙堿差異最大（圖1F）。

2.4.2不同來源雪茄煙種質資源化學成分差異雪茄煙種質資源來自美國和古巴，統計結果表明，各化學成分平均值中以總氮、氧化鉀含量以古巴資源較高（圖2A）；總生物堿和煙堿轉化率以美國資源較高（圖2B、圖2C）。各化學成分的最大值和最小值差異不明顯（圖2D）；而煙堿、降煙堿含量和煙堿轉化率的最大值美國資源明顯高于古巴（圖2E）；變異系數在1.37%～285.07%之間，其中，達到強變異性（CV≥100.00%）的有：美國的總糖和還原糖；中國山西和山東以及古巴和美國的降煙堿；中國安徽、貴州、河南和山東以及古巴和美國的煙堿轉化率等。CV在10.0%以內的有中國福建、貴州、黑龍江、遼寧和山東的總氮；黑龍江的新煙堿和假木賊堿和遼寧的氧化鉀等；其余來源及化學成分的變異系數均在10.00%～99.99%之間，為中變異性（圖2F）。

2.5聚類分析

2.5.1各類煙草種質資源的聚類分析將165份煙草種質資源的總糖、還原糖、總氮、總植物堿、水溶性氯、氧化鉀、淀粉、煙堿、降煙堿、新煙堿、假木賊堿含量和煙堿轉化率等12項指標，采用標準化轉化、歐氏距離、離差平方和法進行系統聚類，在截距為0.9左右處將165份資源分成4類（圖3），每一類均可以再分為2個亞類，各類種質數量及編號見表10，其差異性比較和各成分的變異系數見圖4，各類及其主要特征特性為：第1類：包含78份種質，可分成2個亞類。

其中，1-1亞類63份均為烤煙種質；1-2亞類中烤煙、白肋煙和雪茄煙種質分別為8份、3份和4份。其主要特征是總糖和還原糖含量較高，煙堿轉化率較低。

第2類：包含28份種質，可分成2個亞類。

其中，2-1亞類中有12份烤煙和1份雪茄煙種質；2-2亞類中白肋煙有14份和烤煙1份（豎葉子0982）。其主要特征是總糖和還原糖含量低，總氮、總植物堿和氧化鉀含量高。

第3類：包含10份種質，3-1亞類有烤煙種質4份；3-2類中分別有烤煙4份、白肋煙和雪茄煙種質各1份。其主要特征是煙堿含量低，總植物堿含量低，降煙堿含量高，煙堿轉化率高。

第4類：包含烤煙種質49份，均為烤煙種質。

其主要特征是總糖、還原糖和淀粉含量高，總氮含量低。

2.5.2烤煙種質資源聚類分析按以上同樣的聚類方法對141份烤煙資源進行聚類分析，在0.9左右處將141份資源分成4類，每一類均可分成2個亞類（圖5），各類所包含的種質資源數量及編號見表11，各類主要特征特性為：第1類氧化鉀含量高；第2類總糖、還原糖、淀粉、總植物堿、煙堿含量低，降煙堿含量高，煙堿轉化率高；總植物堿、煙堿含量高；第3類總植物堿、煙堿含量最低，降煙堿含量和煙堿轉化率最高；第4類總糖、還原糖、淀粉、總植物堿、煙堿含量較高：第5類的總糖、還原糖、淀粉含量高，總氮含量低。第1、4類的降煙堿含量和煙堿轉化率的變異系數較高（≥100%），為高變異性，各類的總氮、第5類的總糖含量等為弱變異性，其余的為中變異性（圖6）。

3討論

3.1煙堿的含量

煙堿是煙葉中主要的生物堿，其含量在生物堿中占95%以上，煙堿含量隨煙草類型、品種、產地、施肥等的不同而有差異。本研究結果表明，不同類型的煙草及同一類型不同品種間的煙堿含量差異較大，其范圍為烤煙的煙堿含量為0.99～44.12mg/g、白肋煙為3.74～37.40mg/g、雪茄煙為1.01～35.42mg/g。而有研究顯示香料煙為2.33～5.19mg/g、白肋煙為17.36～25.50mg/g和烤煙為23.66～24.400mg/g[20]，本研究多樣性更豐富。孫鑫等[21]從219份烤煙資源中篩選出煙堿含量高的品種福泉朝天立、8022、開陽團魚葉、畢金一號和長葛柳葉等資源，許美玲等[22]從52份烤煙資源中篩選出煙堿含量>5.00%的小黃金0009和小黃金5209。本研究篩選出煙堿含量高（>40.00mg/g）的種質自來黃2243（烤煙）和Burley37（白肋煙）等；煙堿含量在30.00～40.00mg/g之間的烤煙種質8份（松邊黃苗榆2202、晉太207、黑苗白筋2338、小尖梢、小黃金0029、黑柳子、豎把柳葉2116、胎里富1060）等、白肋煙種質2份（Burley49、Burley11B）和雪茄煙種質Greider。這些種質可作為高煙堿資源進行進一步研究和利用。

3.2煙堿轉化率與轉化類型

按煙堿轉化率的高低可將煙草分為高轉型、中高等轉化型、低轉化型和非轉化型種質[11]。本項的165份種質中，高轉型種質有烤煙8份（平板柳葉、小黃金0003、潑拉機、葵花煙2437、黔南9號、黑苗2319、尖煙洋苗、武鳴4號），占5.67%；白肋煙Burley1（占5.55%）和雪茄煙Dutch（Ohio）（16.67%）等；中高等轉化型種質烤煙3份（黑苗2344、黑苗煙2343、大豎把2141）。低轉化型種質雪茄煙Havana501和烤煙種質偏筋黃1036、晉太3號、晉太6號、黃苗2218、小黃金0029、小尖梢等。田陽陽等[23]研究的TS01株系的煙堿轉化率在93%以上，證明烤煙的煙堿轉化率也較高；雪茄煙品種均存在煙堿向降煙堿的轉化問題，煙堿轉化率范圍為5.03%～53.12%[24]，國內外不同產區雪茄煙葉和茄芯、茄衣等不同用途雪茄煙葉生物堿含量樣本間差異性均較大，特別是煙堿、降煙堿含量和煙堿轉化率變異性極大，表明雪茄煙葉煙堿向降煙堿轉化問題突出[25]，本研究結果與以上文獻基本相符。另外，SHI等[5]和BUSH等[26]的研究認為，美國白肋煙品種在群體中一般含有15%～20%的轉化株，約1/2轉化株的煙堿轉化率>20.00%。本研究認為，由于煙草類型不同、品種不同，煙堿含量及煙堿轉化率差異較大。如平板柳葉、小黃金0003等煙堿轉化率在85.00%以上，與硃砂煙（淺紅、中等紅色、深紅3種類型硃砂煙葉的煙堿轉化率分別為86.95%、90.86%、93.85%，遠高于云煙87的5.12%）煙堿轉化率相似[27]。煙堿轉化率較高的資源可作為硃砂煙葉等特殊用途進行研究和利用。

3.3不同類型煙草的化學成分差異

3種類型的煙草種質資源總糖和還原糖含量以烤煙最高，雪茄煙和白肋煙較低；總氮、總植物堿和氧化鉀含量以白肋煙種質為高，總氮含量以烤煙和雪茄煙較低，總植物堿含量以雪茄煙最低，氧化鉀含量以烤煙最低，淀粉含量以烤煙最高，雪茄煙和白肋煙較低。有研究表明，不同基因型間煙葉含鉀量有較大差異，而選擇吸收和積累鉀能力強的品種是最有效的措施[12]，黃鶯等[28]提出在常規施鉀量水平下烤煙富鉀、高鉀等基因型的劃分標準，用該標準對本研究的141份烤煙種質氧化鉀含量進行劃分的結果表明：富鉀型（>2.50%）種質36份，占25.53%，高鉀型（1.80%～2.50%）種質87份，占61.70%，低鉀型（<1.80%）種質18份，占12.77%。其中，麻江立煙、黑苗2308、豎葉子0982、豎把大柳葉2133、黔南1號等5份的氧化鉀含量>4.00%；黃苗2218、小白筋2516、黔南3號、黔南7號、黑柳子、掩心煙2441、武鳴4號、黔南9號、黑苗2344、黑苗2322、牡單79-2、核桃紋2475、豎葉子0987、三保險2440、小黃金0019、黑苗毛煙、大柳葉2020、晉太125-11等18份的氧化鉀含量在3.00%～4.00%之間。培育富鉀煙草品種可提高我國煙葉含鉀量，從而達到煙葉降焦的目的，并能提高煙株抗逆、抗病性，改善煙葉品質[29]。

綜上所述，不同烤煙種質資源間的化學成分和生物堿的含量差異較大。經過分析比較，篩選出了一批化學成分適宜，氧化鉀含量高，降煙堿含量或煙堿轉化率較低的種質，也區分出了高轉化型、中高轉化型和低轉化型的烤煙種質。相關分析結果提示了各化學成分指標間的相關關系，聚類分析將特性不同的種質歸為不同的類型。