溫肺降濁方對血管性癡呆模型大鼠ERK1/2信號通路相關蛋白的影響

宋晨曦,張 鼎,胡芷涵,姜明賀,李方存,胡躍強

(1.廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530001;2.上海中醫藥大學,上海 201203;3.廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是癡呆的常見類型之一,是由缺血性或出血性腦血管疾病引起低血流灌注導致的一種癡呆類型[1]。其臨床表現以認知障礙為主,伴隨運動異常、行為癥狀以及自主神經功能障礙等[2-4]。VaD的形成因素較為復雜,病因病機尚未可知[5]。多數學者指出,炎癥因子、神經遞質、氧化應激、細胞自噬等共同發揮作用導致了VaD的發生[6-9]。

《素問·宣明五氣》曰：“心藏神,肺藏魄,肝藏魂,脾藏意,腎藏志。是謂五臟所藏。”五臟中任何一臟的功能失調,都會引起癡呆的發生。故歷代醫家基于藏象學說的系統理論,運用中醫學整體觀念和辨證論治的基本特點,從不同角度以不同方藥來論治癡呆,為后世預防和治療癡呆積累了大量寶貴的臨床經驗。鑒于VaD病理機制的復雜性與其所致多個臟器同病、多種危險因素并存的病理特點和中醫防病、治病的理論體系相符,故中醫在治療VaD上有著明顯的優勢,而中藥因其具有多成分、多途徑、多靶點的系統優勢,對于VaD的預防和治療也有著重要的意義[10-11]。本研究基于ERK1/2信號通路,通過探討溫肺降濁方是否抑制Calpain、Bad蛋白表達,上調Bcl-xl蛋白表達量,從而發揮治療血管性癡呆的藥效作用,以期為中醫藥預防和治療VaD提供新的思路和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康級成年雄性SD大鼠(n=30)購自于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物質量合格證號SCXK(湘)2019-0004,飼養于廣西中醫藥大學科學實驗中心動物房,所有動物常規護理,自由飲食,室溫保持在(23.0±3.0)℃,濕度保持在(45.0±10.0)%,間隔3 d測量大鼠體重并記錄。本研究經廣西中醫藥大學科學實驗中心動物倫理委員會批準;倫理批號DW20230425-105。

1.1.2 藥物與試劑：溫肺降濁方由制附子20 g(先煎),黨參15 g,干姜、田七、酒大黃各10 g,炙甘草6 g組成。所有藥物購買于廣西中醫藥大學第一附屬醫院門診中藥房,本方分2 次煎煮,取汁200 ml,加熱濃縮至含有原藥材1.5 g/ml。蘇木色精,Solarbio,批號 H8070;伊紅Y(水溶),Solarbio,批號 E8090;無水乙醇、二甲苯,國藥集團,批號10009218、10023418;中性樹膠,國藥集團,批號10004160;彩虹180廣譜蛋白Marker(11-180 KD),Solarbio,批號PR1910;ERK1/2抗體、Calpain抗體、Bad抗體、Bcl-xl抗體,英國Abcam,批號分別為ab184699、ab108400、ab32445、ab32370。

1.1.3 實驗儀器：全波長酶標儀系統,美國賽默飛世爾科技;正置顯微鏡,奧林巴斯BX53型生物顯微鏡等。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立：適應性喂養大鼠2周,體重(250±30) g。大鼠通過永久性雙側頸總動脈閉塞(2 VO)建立VaD大鼠模型。具體方法[12]：用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔內麻醉大鼠,經頸部正中切口暴露雙側頸總動脈,輕輕分離雙側頸總動脈和迷走神經,用6-0 號絲線結扎雙側血管。假手術組只暴露動脈不進行結扎。整個手術過程操作輕柔,減少觸碰迷走神經,術后用加熱毯維持大鼠體溫。

1.2.2 分組與給藥：隨機分為五組,假手術組、模型組、溫肺降濁方低、中、高劑量組(n=3)。模型組和假手術組予以等體積蒸餾水灌胃,溫肺降濁方低、中、高劑量組分別以1.5 g/kg藥物濃度,灌胃1.5、3、6 ml,持續8周。末次給藥后,各組大鼠禁食禁水24 h,1%戊巴比妥鈉腹腔過量麻醉。各組分別取3只進行心臟灌注包埋,其余3只立刻斷頭取腦剝離海馬組織,放入凍存管,-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 Morris水迷宮實驗檢測大鼠行為學：正式實驗前進行為期2 d的大鼠游泳尋找逃生平臺訓練,依次從第1～4 象限指定點面向池壁放入水迷宮中,于60 s內成功停留站臺,即完成實驗;若60 s未成功找到站臺,人工引導停留10 s,第1～2天為訓練實驗,后3 d記錄逃避潛伏期數據,以均數來評估大鼠空間記憶能力。

1.2.4 HE染色觀察大鼠海馬組織形態：各組大鼠干預完成后,取材,固定,脫水后常規蠟塊包埋,取出包埋好的組織蠟塊,冰凍切片機切片4 μm左右。進行HE染色后脫水、透明、中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.5 免疫組化法檢測大鼠海馬組織中細胞外信號調節激酶(Extracellular-signal regulated kinase,ERK)1/2、Bcl-xl、Bad蛋白表達：組織切片,梯度酒精脫水、透明,抗原修復,室溫山羊血清封閉30 min,繼續加入ERK1/2(1∶100)、Bcl-xl(1∶100)、Bad(1∶100)孵育,4 ℃濕盒避光孵育過夜。分別滴加熒光標記物,濕盒繼續室溫孵育1 h,滴加DAPI避光核染,抗熒光淬滅劑封片,倒置熒光顯微鏡采集圖片、數據分析。

1.2.6 RT-qPCR法檢測大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain、Bad、Bcl-xl mRNA表達量：總RNA嚴格按照Trizol試劑盒試劑的說明提取,微量分光光度計測定OD值,計算RNA的純度和濃度。將總RNA逆轉錄為cDNA,反應條件：42 ℃、2 min,50 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃、10 min,1 個循環。擴增程序分為兩步：95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸45 s。以GAPDH為內參,2-ΔΔCt法計算最終mRNA的相對表達量。PCR引物由南寧捷尼斯生物有限公司合成,引物序列見表1。

表1 各基因PCR相關引物序列

1.2.7 Western blot檢測大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain、Bad、Bcl-xl蛋白表達：從-80 ℃冰箱取出腦組織,剪出一部分組織放入裝有鋼珠的1.5 ml的EP管中,自動制冷勻漿機勻漿,加RIPA裂解液,加入PMSF蛋白酶抑制劑,BCA蛋白檢測試劑盒進行定量分析。根據分子量制備相應分離膠,通過電泳、轉膜、5%BSA封閉,TBST洗膜,一抗稀釋比例：ERK1/2(1∶2000)、Calpain(1∶2000)、Bad(1∶2000)、Bcl-xl(1∶2000)孵育,4 ℃過夜;TBST洗膜3次,每次10 min,稀釋二抗比例為(1∶5000),將PVDF膜放置于二抗中,37 ℃搖床孵育1.5 h,TBST洗膜,超敏ECL顯色后曝光,以GAPDH為內參,計算目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠認知水平的比較 見表2。術后4周,模型組和各干預組大鼠之間逃避潛伏期較假手術組明顯延長(P<0.05),而穿越平臺次數較假手術組明顯縮短,差異具有統計學意義(P<0.05),模型組和各干預組之間差異無統計學意義(P>0.05)。術后8周,模型組和各干預組大鼠逃避潛伏期較假手術組明顯延長(P<0.05),穿越平臺次數較假手術組明顯縮短(P<0.05);和模型組比較,溫肺降濁方低劑量組、溫肺降濁方中劑量組逃避潛伏期和穿越平臺次數差異無統計學意義(P>0.05),溫肺降濁方高劑量組逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺次數明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠Morris水迷宮測試認知能力比較

2.2 各組大鼠海馬組織病理學變化情況 假手術組大鼠海馬區細胞排列緊湊,形態規整,數量較多;模型組大鼠海馬區細胞排列散亂,形態極其不規則,細胞間質染色稀疏,出現部分水腫和細胞核縮小;各劑量中藥組大鼠海馬區神經元數量增加,以溫肺降濁方高劑量組改善最為明顯(圖1)。

A：假手術組;B：模型組;C：溫肺降濁方低劑量組;D：溫肺降濁方中劑量組;E：溫肺降濁方高劑量組

2.3 各組大鼠海馬組織中ERK1/2、Bcl-xl、Bad的陽性蛋白表達情況比較 見表3(圖2)。與假手術組相比,模型組大鼠海馬組織ERK1/2、Bad陽性蛋白表達量升高(P<0.05),Bcl-xl蛋白表達量下降(P<0.05);和模型組相比,溫肺降濁方中劑量組、溫肺降濁方高劑量組ERK1/2、Bad陽性蛋白表達量下降(P<0.05),Bcl-xl蛋白表達量升高(P<0.05),其中以溫肺降濁方高劑量組差異最為顯著。

A：假手術組;B：模型組;C：溫肺降濁方低劑量組;D：溫肺降濁方中劑量組;E：溫肺降濁方高劑量組

表3 各組大鼠海馬組織中ERK1/2、Bcl-xl、Bad陽性蛋白表達比較

2.4 各組大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain、Bad和Bcl-xl mRNA表達比較 見表4。與假手術組相比,模型組大鼠海馬組織中mRNA的相對表達量出現不同程度的上調或下調,其中,ERK1/2、Calpain、Bad表達上升(P<0.05);Bcl-xl表達下降(P<0.05)。使用溫肺降濁方各劑量組進行干預后,ERK1/2、Calpain、Bad表達下降(P<0.05);Bcl-xl表達上升(P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬組織中各項指標mRNA相對表達量比較

2.5 各組大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain、Bad和Bcl-xl蛋白表達情況 見表5(圖3)。與假手術組比較,模型組大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain和Bad蛋白表達升高,Bcl-xl蛋白的表達量降低(P<0.05);與模型組比較,各劑量中藥組大鼠海馬組織中ERK1/2、Calpain和Bad蛋白表達降低,Bcl-xl蛋白的表達量升高(P<0.05)。

圖3 各組大鼠海馬組織中蛋白相對表達量印跡圖

表5 各組大鼠海馬組織中蛋白相對表達量比較

3 討 論

血管性癡呆在中醫學歸屬于“癡呆”“呆病”等范疇,其發病機制為痰、虛、瘀等諸多因素相互影響,病位在腦髓,但以腎虛為本[13],治療原則以補虛瀉實為主[14]。肺與血管性癡呆的聯系主要與肺主氣、司呼吸的生理功能有關[15]。若肺宣發、肅降功能失常,則清氣不能宣發以滋養腦竅,濁氣不能肅降而上擾清竅,可導致癡呆的發生[16]。本研究團隊基于大量的前期研究基礎提出,以“肺臟辨治癡呆”的主要思想,認為肺金失養是構成VaD發病過程中的關鍵因素。《靈樞》中記載：“肺氣衰,魄離,故言善誤”[17]。這也提示我們肺氣虛衰可能是VaD疾病早期的病因之一,故治療上須以宣通肺金之功,增強溫煦溫化之效為主。因此,溫肺降濁方是治療VaD的關鍵臨床驗方。方中制附子和黨參共用,溫陽行氣,補益上、中二焦;干姜資助肺精,可助附子溫陽;田七活血化瘀,運化周身血脈;大黃蕩腸降濁,除陳生新;炙甘草調和諸藥,緩急補中。諸藥合用,溫補同施,走瀉并用,升降平衡。前期基礎研究提示,本方可以上調或下調線粒體相關蛋白的表達,減少神經元凋亡,改善海馬區突觸損傷,從而提升大鼠的學習記憶能力。

ERK是MAPK家族中的亞家族,是MEK的唯一下游底物[18],由ERK1激酶和ERK2激酶組成[19],可以被多種因素激活,參與到細胞凋亡和增殖等過程中來[20]。ERK1/2通路可通過增強Bad表達、活化Calpain介導等方式啟動細胞內源性的凋亡途徑。Calpain被活化后能產生較強的破壞作用,可以裂解Bcl-xl,使其與Bad結合的功能喪失,導致游離的Bad增多,進而引起細胞凋亡[21]。同時,Bad又是Bcl-2家族中的重要成員,通過形成線粒體外膜通透性(MOMP)復合物來啟動細胞凋亡[22]。此外,鈣依賴性半胱氨酸中性蛋白酶Calpain,具有強烈的破壞作用,其活化后可裂解細胞結構,破壞溶酶體膜、導致細胞溶解壞死,也可裂解Bcl-xl、使其喪失與Bad結合的能力,導致游離Bad增多、Caspases蛋白活化,進而引起細胞發生凋亡[23-25]。

本次研究顯示,成模后大鼠海馬組織ERK1/2、Calpain、Bad蛋白表達升高,Bcl-xl表達下調;而經過溫肺降濁方干預后ERK1/2、Calpain、Bad蛋白表達降低,Bcl-xl表達上升。此外,溫肺降濁方高劑量組的表達更加顯著。綜上所述,溫肺降濁方可能是通過促進VaD大鼠腦組織ERK1/2通路激活,從而抑制ERK1/2、Calpain、Bad蛋白的表達,上調Bcl-xl蛋白,進一步改善VaD大鼠的學習和記憶能力。