烹飪溫度對牦牛肉蛋白質氧化和體外消化特性的影響

張 燕，李升升,2, ，趙立柱，張強龍

（1.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810000；2.國家牦牛肉加工專業技術研發中心，青海 西寧 810000）

牦牛（Bos gruniens）是分布于中國青藏高原及其沿線的特有畜種[1]，能較好地適應高寒、低氧及牧草缺乏的地區。目前，全球約有1 600萬 頭牦牛，95%以上的牦牛分布在國內的青海、西藏、甘肅、四川、云南、新疆等地[2]。牦牛肉為高原人提供所需的必需氨基酸、脂肪酸、維生素和礦物質等[3-4]，而且青藏高原地區的人們將牦牛肉作為動物蛋白的主要來源。由于牦牛肉脂肪含量較低，蛋白質含量較高，深受消費者的歡迎[5]。

肉類在烹飪過程中，高溫加熱雖然能消滅有害微生物，保證肉類食用的安全性，但同時也會生成活性氧等自由基，進而攻擊蛋白質分子，促使氧化的發生[6]。因此，肉制品的蛋白質在加工過程中很容易發生氧化，導致其結構發生變化，對其功能特性產生一定影響[7]。許多研究表明肉制品的烹飪會加劇蛋白質氧化的程度，而蛋白質氧化程度在消化過程中會進一步加重[8]。在人體消化過程中，蛋白質氧化產物也會因消化液中的促氧化劑（pH值、抗壞血酸、鐵離子等）而不斷發生氧化[9]。目前，直接研究肉類蛋白質在人體內的消化代謝很困難，所以主要通過體外模擬胃腸道消化實驗進行研究[10]。一些學者通過對肉類蛋白進行模擬胃腸道消化實驗后發現，肉制品經過烤制[11]、煮制、蒸制、高壓[12]以及真空烹飪[13]等加工后其肌肉蛋白更容易被消化吸收，顯著提高了蛋白質的消化率。但Li Li等[14]對100 ℃燉煮的豬肉進行體外模擬消化后發現，與原料肉相比，其消化率降低。此外，在消化過程中蛋白質氧化主要表現為蛋白變性和蛋白水解，會導致蛋白質結構完整性的改變。有學者發現在70 ℃甚至更高的溫度條件下烹飪豬肉，會增加豬肉蛋白的胃蛋白酶水解能力，在長時間的消化過程中，熱處理提高了蛋白質的降解能力[15]。綜上所述，肉制品的加工條件會顯著影響肉制品蛋白的消化性以及在消化過程中肉蛋白的生物利用率。

目前，關于牦牛肉制品在胃腸道消化過程中的消化性以及蛋白質氧化的研究較少，為此，本實驗通過模擬體外胃腸道消化，研究烹飪牦牛肉至不同中心溫度后其肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）氧化程度及消化性的變化，旨在為牦牛肉的精深加工和新產品研發技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉購自青海夏華清真肉類食品有限公司。挑選6 頭（36±6）月齡的生長發育良好、體況相近的牦牛，宰后采集背最長肌，在（3±1）℃運回實驗室，待用。

牛血清白蛋白 美國Sigma公司；胃蛋白酶（牛源，酶活力≥3 000 NFU/mg）、胰蛋白酶（牛源，酶活力≥2 500 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、5,5’-二巰代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）、尿素、硫酸亞鐵、碘酸鈉、無水乙醇、KHPO4、KCl、KHPO4、KOH、MgCl2、甲醇、氯仿、冰醋酸 北京索萊寶科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電磁爐 美的集團；家用煮鍋 浙江蘇泊爾股份有限公司；平底鍋 寧波方太廚具有限公司；FSH-II型高速電動勻漿機 江蘇金壇市振興儀器廠；電熱恒溫振蕩水浴鍋 上海一恒科技有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Cary Eclipse熒光分光光度計美國安捷倫公司；DYCZ-24DN型電泳槽、DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；2500R凝膠成像儀上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛肉加工

將背最長肌表面的筋、腱、膜及脂肪剔除，切成6 cm×6 cm×1.5 cm大小的肉樣。平底鍋中加油20 mL，在226～228 ℃條件下煎制，每30 s翻面1 次，肉樣連接K型熱電偶探頭數顯溫度計進行中心溫度測定，直至肉樣中心溫度分別為40、50、60、70、80 ℃時立即取出，吸干表面油漬后冷卻至室溫并稱質量，除去表皮放入液氮中速凍待后續分析[16]。原料肉作為對照組，所有處理組肉樣一式3 份。

1.3.2 MP提取

參考布鑫榮等[17]的方法并略作修改。將3.0 g肉樣放入8 倍體積磷酸鉀緩沖液（20 mmol/L）中，并在由KCl（0.1 mol/L）、EGTA（2 mmol/L）和MgCl2（2 mmo/L）配制而成的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 6.8）中混勻，1 000×g冷凍離心10 min后保留沉淀，以上操作重復3 次。用8 倍體積100 mmol/L的KCl溶液將沉淀溶解，1 000×g冷凍離心10 min后繼續保留沉淀，以上操作重復2 次，即得MP，供后續實驗使用。采用雙縮脲法測定蛋白質量濃度，以牛血清白蛋白為標準品繪制標準曲線，x為蛋白質量濃度，y為吸光度，牛血清白蛋白的標準曲線方程為y＝0.476 6x－0.005 3（R2＝0.994）。

1.3.3 體外模擬胃腸消化

參考Yin Yantao等[18]的方法，略作修改。用甘氨酸緩沖液（33 mmol/L，pH 1.8）將MP溶液的質量濃度稀釋至4 mg/mL，將2 份制備好的樣品分別與胃蛋白酶（5 U/mg）按照體積比1∶3混合均質，一份在37 ℃連續振蕩孵育90 min模擬胃消化，定量沉淀物質量（m1，mg）。剩余的一份用甘氨酸緩沖液（33 mmol/L，pH 8.0）稀釋，按照體積比3∶1的比例與胰蛋白酶（6.6 U/mg）混合均質，在37 ℃連續振蕩孵育1 h模擬腸消化，定量沉淀物質量（m2，mg）。

1.3.4 蛋白質水解率測定

將上述1.3.3節中的m1和m2代入式（1）～（3）分別計算胃蛋白酶和胰蛋白酶對蛋白質的水解率及總水解率。

1.3.5 總羰基含量測定

參考韋婕妤[19]的方法并稍作修改。用100 mmol/L KCl溶液將MP溶液質量濃度調整為5 mg/mL，取2 份0.5 mL蛋白液，一份加2 mL含體積分數為0.2% DNPH的2 mol/L HCl溶液，另一份加2 mL 2 mol/L HCl溶液作為對照，室溫避光反應1 h（每10 min渦旋振蕩1 次）。分別添加2 mL體積分數為20%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，離心（8 000×g，5 min）。沉淀用2 mL乙酸乙酯-乙醇（體積比1∶1）清洗，重復3 次。分別加3 mL 20 mmol/L PBS（含6 mol/L鹽酸胍，pH 6.5）后置于37 ℃水浴中保溫30 min溶解沉淀，離心（8 000×g，5 min）取上清液，在370 nm波長處測其吸光度。按式（4）計算羰基含量：

式中：A1為370 nm 波長處吸光度；ρ為蛋白質質量濃度/（mg/mL）；ε1為摩爾消光系數（22 000 mol/（L·cm））。

1.3.6 總巰基含量測定

參考萬紅兵等[20]的方法并稍作修改。用25 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.25）調整蛋白質量濃度為2 mg/mL。取0.5 mL依次加入2 mL尿素-SDS溶液（含8.0 mol/L尿素、30 g/L SDS、0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液，pH 7.4）和0.5 mL 10 mmol/L DTNB試劑（含0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液，pH 7.4），室溫靜置反應15 min，取上清液在412 nm波長處測定其吸光度，25 mmol/L磷酸鉀緩沖液代替蛋白液用于空白對照。按式（5）計算總巰基含量：

式中：A2為412 nm波長處吸光度；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）；ε2為摩爾消光系數（13 600 mol/（L·cm））。

1.3.7 Schiff堿含量測定

Schiff堿含量的測定參照Gatellier等[21]的方法。按照蛋白液（1 mg/mL）∶PBS（20 mmol/L）＝1 mL∶20 mL混勻后取上清液進行測定，激發波長為350 nm，激發和發射狹縫為10 nm，待測范圍為400～500 nm；所有樣品重復測定3 次。

1.3.8 紫外吸收光譜測定

參考張海璐等[22]的方法并稍作修改。將MP 用10 mmol/L PBS稀釋至1 mg/mL后離心7 000×g，取上清液倒入比色皿中并置于紫外-可見分光光度計測定，掃描波長范圍為240～350 nm，掃描速率快速，采樣間隔為2 nm。

1.3.9 內源熒光光譜測定

參考鄭云芳等[23]的方法并稍作修改。用0.6 mol/L PBS將MP溶液質量濃度調整為0.5 mg/mL，PBS作對照組，采用熒光分光光度計進行測定，激發波長設定為295 nm，發射光譜范圍為300～400 nm。

1.3.10 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）測定

將各蛋白質樣品與上樣緩沖液以體積比3∶1比例混合，沸水加熱5 min。制樣完畢后，在質量分數為5%的濃縮膠和質量分數為15%的分離膠組成的電泳系統中，每孔加入10 μL樣品，在120 V條件下進行電泳操作，結束后取下膠片，用考馬斯亮藍R-250染色1.5 h。用混合溶液（甲醇∶乙酸∶水＝45∶10∶45，V/V）進行脫色。最后用凝膠成像系統對膠片進行拍照[20]。

1.4 數據分析

采用SPSS Statistics 26軟件對數據進行單因素方差分析，各組間差異用Duncan多重比較法，結果用±s表示；采用Origin 2021軟件繪圖；所有統計分析的顯著水平均為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 牦牛肉蛋白質消化率變化

如表1所示，采用胃蛋白酶對蛋白質的水解率模擬胃消化率，胰蛋白酶對蛋白質的水解率模擬腸消化率。與原料肉相比，經加工后牦牛肉的胃蛋白酶水解率和總蛋白酶水解率均顯著降低（P＜0.05），胰蛋白酶水解率顯著升高（P＜0.05）。隨著中心溫度的升高，胃蛋白酶對MP的水解率呈先升高后降低的趨勢，60 ℃時胃蛋白酶水解率最高達74.89%。胰蛋白酶水解率隨著中心溫度的升高呈先上升后降低的趨勢，70 ℃時水解率最大，為23.37%。總蛋白水解率隨著中心溫度的升高先增大后減小，在60 ℃時水解率最大（88.64%）。相較于原料肉，80 ℃時胃蛋白酶水解率和總蛋白酶水解率分別降低了34.10%和22.47%，胰蛋白酶水解率提高了75.34%。總蛋白水解率與胃蛋白酶水解率變化趨勢一致，可見蛋白質的消化性主要取決于胃蛋白酶水解作用。

表1 不同中心溫度下經胃腸消化前后MP消化率變化Table 1 Changes in gastrointestinal digestibility of MP from yak meat cooked to different internal temperatures

上述研究結果表明，蛋白質經加工后，在胃腸消化過程中水解率降低，可能是因為加工可以誘導與肌肉蛋白質氧化相關的修飾，從而通過影響胃蛋白酶的水解位點來降低其消化率[24]。此外，胃蛋白酶在早期對蛋白質的水解作用較弱時，胰蛋白酶的降解作用會增強，這與Santé-Lhoutellier等[25]的研究結果類似。

2.2 牦牛肉總羰基含量變化

蛋白羰基產物可通過直接氧化產生或者與脂肪氧化產物發生加成作用形成[26]，其含量是測定蛋白氧化程度的重要指標之一，反映了蛋白質被氧化破壞的程度。一般來說，羰基含量越高，蛋白氧化程度越大[27]。如圖1所示，牦牛肉蛋白質經胃腸消化前后的總羰基含量均隨中心溫度的升高顯著增大（P＜0.05），且高于原料肉。與原料肉相比，80 ℃時消化前的蛋白質總羰基含量增大了85.16%，經胃消化后蛋白質的總羰基含量增大了81.42%，經腸消化后的總羰基含量增大了77.40%。在相同中心溫度下，腸消化后的總羰基含量高于胃消化后的，消化前的總羰基含量最低。80 ℃牦牛肉蛋白質在腸消化后的總羰基含量是胃消化后的1.07 倍，是消化前的1.14 倍。上述結果表明，MP經過胃腸道消化后總羰基含量顯著升高（P＜0.05），表明消化道的氧化酶和其他促氧化劑進一步促進了蛋白質羰基化，這與Van Hecke等[28]的研究結果一致。不同烹飪溫度導致蛋白質氧化程度的高低決定了其對肉類消化性的影響。在煎制加工下，肉中的蛋白暴露于油脂中，所以脂質氧化促進了蛋白質氧化引起的羰基含量增加[29]。

圖1 不同中心溫度下經消化前后牦牛肉蛋白質總羰基含量變化Fig.1 Changes in total carbonyl content of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

2.3 牦牛肉蛋白質總巰基含量的變化

MP在氧化過程中其巰基容易轉變成二硫鍵，導致巰基含量降低，所以巰基含量也是表示蛋白氧化程度的重要指標之一，巰基含量越低代表蛋白質氧化程度越高[30]。如圖2所示，隨著中心溫度的升高，牦牛肉MP經胃腸消化前后總巰基含量均顯著降低（P＜0.05）。與原料肉相比，80 ℃時消化前的蛋白質總巰基含量降低至（67.79±22.95）nmol/mg，減少了40.33%，經胃消化后蛋白質的總巰基含量降低了30.02%，經腸消化后的總巰基含量降低了36.43%。與消化前相比，經胃消化后的樣品總巰基含量顯著增加（P＜0.05），而在腸消化階段總巰基含量又顯著低于消化前（P＜0.05）。

圖2 不同中心溫度下經消化前后牦牛肉蛋白質總巰基含量變化Fig.2 Changes in total sulfhydryl content of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

隨著中心溫度的升高，牦牛肉MP中的總巰基含量不論是消化前還是經過胃腸消化均呈下降趨勢，可能是當溫度持續升高時，肌動球蛋白構象改變，巰基被氧化成二硫鍵，使巰基含量降低[31]。另外，胃消化后的總巰基含量高于消化前的總巰基含量，可能是由于胃蛋白酶作用，使部分水解蛋白質的結構展開，暴露出更多的巰基基團并發生反應。在胃消化階段，可能有大量二硫鍵被還原生成巰基，導致巰基含量增加。而腸消化階段總巰基含量降低，猜測是由于胰蛋白酶水解全部蛋白質導致半胱氨酸或含半胱氨酸的短肽顯現。韋婕妤[19]也發現與消化前相比，羊肉制品在經過模擬胃消化后巰基含量升高，腸消化后巰基含量降低，與本研究結果一致。

2.4 牦牛肉Schiff堿含量的變化

Schiff堿含量象征著脂肪和蛋白質相互作用的程度。Schiff堿類物質存在較強的熒光特性，因而可以通過熒光光譜表征其含量的變化情況[32]。如圖3所示，耗牛肉蛋白質不論是消化前還是經胃腸消化后，隨中心溫度的升高，代表Schiff堿含量的熒光光譜強度先增大后降低，70 ℃時其熒光強度最高，尤其是經腸消化后其熒光強度達到了807.9。此外，消化前的熒光光譜在410 nm波長處附近均出現了一個峰值，但經過腸消化后其峰值出現了不同程度的紅移。在同一中心溫度下，與消化前相比，經過胃腸消化后的Schiff堿熒光強度均增大，且腸消化后的熒光強度增幅更顯著。

圖3 不同中心溫度下經消化前后牦牛肉蛋白質Schiff堿含量變化Fig.3 Changes in Schiff base content of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

Schiff堿含量隨中心溫度的升高而增大，可能是煎制時蛋白質和脂質的氧化產物醛類發生了相互作用導致大量含Schiff堿的物質生成[29]，此結果與Gatellier等[21]的研究結果一致。腸消化后的Schiff堿熒光強度相比于胃消化更為劇烈，可能是由于胰蛋白酶在水解蛋白質與脂質的過程中，促使游離脂肪酸與氨基酸形成并相互作用，導致Schiff堿含量增加。此外，峰的位移反映了不同中心溫度會產生眾多豐富的Schiff堿類物質，它們的相互結合有助于蛋白質聚集并對其消化率產生影響。

2.5 牦牛肉蛋白質紫外吸收光譜的變化

紫外吸收光譜的產生是因為蛋白質中包含酪氨酸、色氨酸等具有芳香環的氨基酸，并且它們的殘基側鏈基團能攝取紫外光，所以通過紫外吸收光譜表征蛋白質的三級結構[33]。由圖4可知，隨著中心溫度的升高，牦牛肉蛋白質的紫外吸收光譜強度逐漸增強。與原料肉相比，當中心溫度達到80 ℃時，消化前、胃消化及腸消化的紫外吸收光譜的吸光度分別增大了28.25%、23.98%和23.14%。在同一溫度下，與消化前相比，經過胃、腸消化后其吸光度顯著增強，且腸消化后在274 nm波長處的特征吸收峰發生輕微藍移。80 ℃時，經腸消化后274 nm波長處的特征吸收峰吸光度是胃消化后的1.03 倍，是消化前的1.10 倍。猜測是由于胰蛋白酶使MP中的部分氨基酸基團結構改變，這與康懷彬等[34]的研究結果一致。此外，蛋白質紫外吸收強度隨中心溫度的升高逐漸增強，可能是由于高溫處理使MP展開，越來越多的芳香族氨基酸如色氨酸和酪氨酸等殘基暴露于蛋白質表面，其所處的微環境由非極性向極性轉變[35]。

圖4 不同中心溫度下經消化前后牦牛肉蛋白質紫外吸收光譜變化Fig.4 Changes in UV absorption spectra of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

2.6 牦牛肉蛋白質內源熒光光譜的變化

內源熒光光譜是監測色氨酸殘基的環境變化、表征蛋白質分子三級結構的重要技術手段之一。內源熒光光譜強度的變化在一定程度上反映出色氨酸的氧化程度[36]。如圖5所示，隨著中心溫度的升高，MP不論是經胃腸消化前還是消化后，其內源熒光光譜強度均逐漸降低。當中心溫度為80 ℃時，消化前、胃消化及腸消化后的蛋白質內源熒光強度與原料肉相比分別降低了72.16%、72.36%和76.23%。同一中心溫度下，與消化前相比，經胃腸消化后的蛋白質內源熒光光譜強度降低，且經腸消化后更為明顯，80 ℃時經胃腸消化后在330 nm波長處的最大內源熒光光譜強度與消化前相比分別降低了51.59%和74.25%。經過胃腸消化后的內源熒光強度降低，尤其是腸消化后熒光強度下降更明顯，可能是牦牛肉蛋白質經過模擬胃腸道消化后氧化加劇，蛋白質肽鏈展開，使活性基團暴露，分子間相互作用力增強后小分子蛋白聚集，導致更多色氨酸殘基被包埋，從而引起內源熒光強度下降[37]。

圖5 不同中心溫度下經消化前后牦牛肉蛋白質內源熒光光譜變化Fig.5 Changes in endogenous fluorescence spectra of MP from yak meat cooked to different internal temperatures before and after digestion

2.7 牦牛肉蛋白質SDS-PAGE的變化

由圖6可知，牦牛肉烹飪至不同中心溫度后其MP結構發生降解與聚集。隨著中心溫度的升高，會造成長鏈蛋白發生不同程度的斷裂，短鏈蛋白相對含量進一步增加[38]。通過對圖6分析可知，出現分子質量由大到小的肌球蛋白（100 kDa）、肌動蛋白（43 kDa）、原肌球蛋白（35 kDa）、肌球蛋白輕鏈（10～30 kDa）條帶。

圖6 不同中心溫度下經胃腸消化前后MP的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE patterns of MP from yak meat cooked to different central temperatures before and after gastrointestinal digestion

消化前，隨著中心溫度的升高，在245～100 kDa范圍內的電泳條帶均逐漸模糊至消失，α-肌動蛋白（100 kDa）條帶隨著溫度的升高逐漸變淺，由此可推測蛋白質在較低烹飪溫度下發生適當氧化，其結構得以適當修飾。43 kDa處的肌動蛋白條帶略有降解，但沒有明顯的變化趨勢，說明肌動蛋白具有熱穩定性，且其熱穩定性明顯高于肌球蛋白，Tornberg[39]研究發現，在雞肉加熱過程中，肌動蛋白電泳條帶比肌球蛋白消失得更慢，與本研究結果一致。此外，35～48 kDa范圍內的蛋白質條帶數量增加，說明此時蛋白質發生了降解，陳春梅等[40]研究發現在不同蒸煮溫度下的羊肉MP在36～55 kDa之間也出現降解情況。20 kDa的條帶幾乎消失，這表明在氧化過程中羥自由基對肽鏈的進攻能夠使其某些部位發生斷裂，從而產生蛋白亞基，這也說明了氧化一定程度對蛋白質具有降解作用。

經胃消化后，原料肉蛋白質在分子質量75 kDa處的條帶還清晰可見。隨著中心溫度的升高，在135 kDa處所對應的條帶比較模糊甚至消失。表明煎制誘導肌球蛋白重鏈受熱氧化，使蛋白質部分結構展開，被胃蛋白酶水解成小分子蛋白，易于被消化吸收。經腸消化后，原料肉蛋白質在分子質量25～75 kDa范圍內的條帶可見。隨著中心溫度的升高，除50 ℃和80 ℃處理組在25 kDa處出現條帶外，各處理組均無可見條帶。由于蛋白質在胰蛋白酶的作用下被大量水解，蛋白質結構被徹底破壞，所以不可能出現蛋白質聚集，阻止蛋白酶與酶切點結合的現象，從而造成腸消化后電泳圖無條帶的現象。在25 kDa或更低的分子質量處看到模糊的泳道，有可能是蛋白質被胰蛋白酶充分水解成小段的肽，導致短肽無法繼續被水解。SDS-PAGE結果顯示了MP的交聯與聚集，表明經過胃腸消化后的蛋白質再次氧化后其降解作用更強。

3 結論

經烹飪后的牦牛肉蛋白質消化率隨溫度的升高呈總體下降趨勢，主要與蛋白質的氧化及結構變化有關。在模擬胃腸道消化過程中發現，隨著烹飪溫度的升高，蛋白質氧化程度逐漸加劇，蛋白質肽鏈展開，導致表征蛋白三級結構的芳香族氨基酸及活性基團暴露，且在腸消化階段更明顯。其次，烹飪后的蛋白質在胃腸道消化過程中的水解導致大量游離氨基酸顯現，間接催化了蛋白質的氧化。后續可以通過蛋白質組學、脂質組學和代謝組學等方法開展牦牛肉在消化過程中蛋白質、脂肪動態變化及其消化規律的深入研究。此外，可以在烹飪牦牛肉過程中添加一些天然抗氧化劑，增添牦牛肉產品的風味，保證產品的營養價值。