基于硅烷化三聚氰胺海綿的改良QuEChERS結合UPLC-MS/MS快速測定豬肉中49 種抗生素多殘留

季寶成，侯鑄琛，任承雨，許 旭，楊貽軻，王洪云，呂 佳，白艷紅,*

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001；3.食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001）

抗生素是用于預防和治療牲畜疾病，或通過加速牲畜生長而提高經濟效益的藥物，已經被廣泛用于畜牧產業[1]。目前自然界中大約存在200多種抗生素，根據其不同的化學結構和功能主要可分為氨基糖苷類、林可酰胺類、大環內酯類、多肽類、β-內酰胺類、喹諾酮類、磺胺類、四環素類、氯霉素類等[2]，由于磺胺類和四環素類抗生素成本較低、效果較好而成為我國養殖領域使用最多的抗生素?？股氐臑E用會產生耐藥菌株，成為影響養殖產業可持續發展的安全隱患[3]。此外，抗生素濫用導致動物組織和動物源性食品中藥物殘留會對消費者的健康構成潛在危害[4-6]。

近年來已經在豬肉中檢測到多種抗生素殘留[7-9]。為了確保食品安全和人類健康，包括中國、歐美在內的許多國家和組織均對豬肉中的抗生素最大殘留限量（maximum residue limits，MRLs）有明確規定[10-11]。目前，抗生素殘留的檢測方法主要有酶聯免疫分析法[12]、薄層色譜法[13]、液相色譜法[14]及液相色譜質譜聯用法[15-17]等。其中，液相色譜質譜聯用法具有高靈敏度、高精確度、高通量的特點[18-20]，逐漸發展成為抗生素多殘留的主要確證技術。

有效的樣品前處理方法能夠提高樣品的檢測率和方法的靈敏度。QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged and safe）法因簡單、高效、成本低等特點，已經廣泛用于抗生素多殘留檢測領域[21-24]，QuEchERS法中常用的凈化材料包括N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）及碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）等[25-27]，能夠實現對大部分動物源性食品中抗生素多殘留的檢測。QuEChERS前處理技術對操作人員要求低、步驟簡單，但其基質凈化過程主要通過限速、耗時的渦流和離心過程實現，且部分吸附劑存在材料團聚、分散性不足等問題[28-30]。

三聚氰胺海綿（melamine sponge，MeS）是由甲醛、三聚氰胺與亞硫酸氫鈉共聚而成，內部為三維多孔網狀結構，不僅孔隙率高、比表面積大，而且其微孔表面具有豐富的仲胺基，能通過修飾不同官能團作為不同功能化材料開發的活化位點[31-34]。此外，MeS理化性質穩定均一、成本低廉，且能在各種有機溶劑中保持良好的彈性和機械性能，在吸附與凈化方面顯示出較大的開發和應用潛力。本課題組前期將其用于牛奶中抗生素多殘留凈化，研究結果表明其在牛奶基質凈化中具有良好的吸附性能[35]。目前，在食品分析領域中基于MeS及其功能化改性材料的抗生素多殘留基質凈化方法還鮮有報道。

本研究基于硅烷化MeS結合超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），建立豬肉中同時檢測49 種抗生素的分析方法，以期為動物源食品中抗生素多殘留的快速分析及食品安全監管提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉 河南鄭州各大型超市及農貿市場。

甲醇、乙腈（均為色譜純）美國賽默飛公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜純）、分散固相萃取吸附劑（dispersive solid phase extraction，d-SPE）（PSA、C18和GCB）上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酸（色譜純）、十八烷基三氯硅烷（octadecyltrichlorosilane，OTS）、N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺（N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine，ATS）上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉（NaCl）、硫酸鎂（MgSO4）、硫酸鈉（Na2SO4）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）（均為分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；QUICLEAR FQuECHERS-AOAC MFF 3202多功能針型過濾器（50 mg PSA、50 mg C18和150 mg MgSO4）天津阿爾塔科學有限公司；MeS 科林美高新材料有限公司；49 種抗生素標準品：磺胺胍（sulfaguanidine，SGD）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathiazole，STA）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SPD）、磺胺二甲基異噁唑（sulfisoxazole，SSX）、磺胺氯噠嗪（sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺氯吡嗪（sulfachloropyrazine，SPZ）、氨苯砜（dapsone，DAP）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，SQZ）、磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SM1）、磺胺二甲基嘧啶（sulfamethazine，SM2）、磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole，SMZ）、甲氧芐定（trimethoprim，TMP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadoxine，SDX）、磺胺二甲基異嘧啶（sulfisomidine，SID）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ）、磺胺對甲氧嘧啶（sulfameter，SMT）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，SBZ）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazole，SPP）、琥珀酰磺胺噻唑（succinylsulfathiazole，SST）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺甲氧噠嗪（sulfamethoxypyridazine，SMP）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、奧比沙星（orbifloxacin，ORB）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、萘啶酸（nalidixic acid，NA）、二氟沙星（difloxacin，DIF）、麻保沙星（marbofloxacin，MAR）、洛美沙星（lomefloxacin，LOM）、氟甲喹（flumequine，FLU）、吡哌酸（pipemidic acid，PIP）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、氟羅沙星（fleroxacin，FLE）、依諾沙星（enoxacin，ENO）、西諾沙星（cinoxacin，CIN）、司帕沙星（sparfloxacin，SPA）、噁喹酸（oxolinic acid，OXA）、交沙霉素（josamycin，JOS）、泰勒菌素（tylosin，TYL）、柱晶白霉素（kitasamycin，KIT）、洛硝噠唑（ronidazole，RON）、甲硝唑（metronidazole，MET）、二甲硝咪唑（dimetridazole，DMZ）、克林霉素（clindamycin，CLR）、雙氯青霉素（dicloxacillin，DIC）美國o2si公司。

1.2 儀器與設備

1290 Infinity II UPLC超高效液相色譜儀 美國Agilent公司；QTRAP 5500質譜儀 美國AB SCIEX公司；JSM-7001F冷場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）日本JEOL公司；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；ZGDCY-12干式氮吹儀上海梓桂儀器有限公司；Vortex-Genie2多功能旋渦混合器 美國Scientific Industries公司；SB-4200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ME204分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 硅烷化MeS的制備與表征

硅烷化MeS采用兩步溶膠-凝膠法制備[36]。將MeS剪裁成底部直徑為9 mm、高為3 mm的微型圓柱體，分別浸入含有不同種類硅烷試劑（OTS、ATS，10 mg/g）的甲苯溶液中振蕩30 min。將收集的海綿用甲苯洗滌數次，并置于120 ℃干燥1 h。將得到的硅烷化海綿分別表示為OTS@MeS和ATS@MeS。

將得到的OTS@MeS和ATS@MeS樣品剪切成薄片，鋪展在導電膠片上，噴金條件：20 mA，40 s。用SEM觀察不同放大倍數下的改性海綿微觀結構。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2.0 μL；流動相A 為含有0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨的甲醇-水溶液（5∶95，V/V），流動相B 為甲醇。流動相梯度洗脫程序：0～4 min，95%～55% A、5%～45% B；4～10 min，55%～10% A、45%～90% B；10～11 min，10% A、90% B；11～11.1 min，10%～95% A、90%～5% B；11.1～13.1 min，95% A、5% B。

1.3.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；電離模式：ESI＋；離子掃描模式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化氣流速：3.0 L/min；干燥氣流速：10.0 L/min；加熱氣流速：10.0 L/min；脫溶劑溫度：250 ℃；接口溫度：300 ℃；加熱氣溫度：400 ℃。

1.3.4 標準溶液的配制

49 種抗生素標準品儲備液：分別準確稱取49 種抗生素標準品，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL標準儲備溶液，于－18 ℃冰箱保存。精密量取各化合物標準品儲備液0.5 mL置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋，配制成5 μg/mL的混合標準中間液，于4 ℃冰箱冷藏保存。在實驗過程中根據需要精確吸取適量標準溶液，用初始流動相稀釋成所需質量濃度。

1.3.5 樣品前處理

準確稱取2.5 g充分均質的樣品于50 mL離心管中，加入1 mL水，渦旋混合0.5 min后，加入10 mL 1.0%乙酸-乙腈溶液，渦旋混合2 min；然后依次加入2.0 g Na2SO4和0.5 g NaCl，立即渦旋2 min，在4 ℃、8 000 r/min離心10 min。將OTS@MeS和ATS@MeS（2∶2，n/n）預先裝入2.5 mL注射筒中，然后取1 mL上清液于注射筒中，通過拉動、按壓注射器柱塞進行基質凈化，凈化液用等量甲醇-水溶液（50∶50，V/V）稀釋后，用0.22 μm濾膜過濾，供UPLC-MS/MS檢測。

1.4 數據處理

所有數據均采用Analyst 1.6.3 軟件采集，用MultiQuantTM3.0軟件建立標準曲線、計算結果；圖表繪制采用Microsoft Excel 2013軟件。

2 結果與分析

2.1 硅烷化MeS的表征

如圖1所示，采用不同硅烷化試劑對海綿改性后，其微觀形貌發生顯著變化。MeS由纖維骨架相互交織而成，整體呈多孔網絡結構，硅烷化改性前其表面較光滑平整。相比之下，MeS通過OTS和ATS烷化改性，硅烷化試劑在海綿表面發生共聚反應，海綿纖維骨架表面微觀形貌變得粗糙，所制備得到的OTS@MeS和ATS@MeS表面聚合物分別呈絨毛狀和泥狀。此外，采用移液槍滴加5 μL超純水至上述不同海綿表面觀察其親疏水性質變化，發現微液滴能夠緩慢浸潤未改性MeS，而在OTS@MeS和ATS@MeS表面均形成了良好的球形液滴且難以進入海綿內部。改性后海綿表面疏水性發生改變，水滴在改性海綿界面上不能被親水吸附，因此在水的表面張力作用下形成球形液滴。以上實驗結果均表明成功制備的兩種硅烷化海綿具有與原始海綿不同的理化性質。

圖1 未修飾MeS與硅烷化改性MeS的SEM圖Fig.1 SEM images of raw and silylated MeS

2.2 質譜條件的優化

通過直接注射質量濃度為0.1 μg/mL的單標溶液，快速優化MRM參數。分別將各標準溶液在全掃描模式下依次注入質譜中進行檢測。結果發現所有化合物在正離子（ESI＋）模式下，均能得到質子化分子離子[M＋H]＋。雖然少數藥物還能得到[M＋Na]＋，但其[M＋H]＋強度更高且能產生更穩定的碎片離子，因此，在ESI＋模式下選擇[M＋H]＋作為各種抗生素的母離子，將得到的母離子進行二級質譜掃描，選擇強度最高的2 個子離子分別作為定量離子和定性離子，優化后MRM參數如表1所示。

表1 49 種抗生素的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of 49 antibiotics

2.3 提取條件的優化

適宜的提取條件是利用UPLC-MS/MS實現準確、靈敏檢測多類抗生素的重要前提。本實驗分別對比和考察了以下4 種不同提取條件對回收率結果的影響：1）1 mL 0.5 mmol/L Na2EDTA溶液和10 mL乙腈溶液，脫水劑為2.0 g無水Na2SO4和0.5 g NaCl；2）1 mL純水和10 mL乙腈溶液，脫水劑為2.0 g無水Na2SO4和0.5 g NaCl；3）1 mL 0.5 mmol/L Na2EDTA溶液和10 mL乙腈，脫水劑為2.0 g無水MgSO4和0.5 g NaCl；4）1 mL純水和10 mL乙腈溶液，脫水劑為2.0 g無水MgSO4和0.5 g NaCl。如圖2所示，通過對4 種提取條件下目標化合物的回收率分布統計結果進行比較發現，組合2回收率處于80%～120%的目標物數量最多且回收率小于60%的化合物數量最少，因此選擇組合2用于進一步提取條件的優化。

圖2 提取條件對回收率的影響Fig.2 Effect of extraction condition on the recoveries of analytes

由于部分抗生素屬于兩性化合物，提取溶液的pH值可能會影響目標物的存在狀態及其提取效率。本實驗比較了乙腈中不同乙酸添加量（0%、0.5%、1%、3%和5%，體積分數）對抗生素回收率分布的影響。如圖3所示，在提取溶劑中添加乙酸能夠明顯提高化合物的回收率，且當乙酸添加量為1%時，抗生素回收率處于80%～120%理想區間的數目最多。當持續提高乙酸添加量至1%以上時，回收率在80%～120%范圍內的化合物數量逐漸減少。此外，過高的乙酸添加量會致使豬肉樣品在提取過程中出現結塊團聚現象而不利于抗生素的充分提取以及實驗結果的重現，這可能與豬肉中蛋白質在較低pH值環境下會發生變性有關。

圖3 提取溶劑中乙酸的含量對回收率的影響Fig.3 Effect of acetic acid content on the recoveries of analytes

因此，綜合上述兩部分實驗結果，研究最終選擇1 mL純水和10 mL 1%乙酸-乙腈溶液作為提取溶劑，并用2.0 g無水Na2SO4和0.5 g NaCl作為脫水劑。

2.4 凈化條件的優化

2.4.1 硅烷化海綿配比優化

OTS@MeS和ATS@MeS存在較大的理化性質差異，其基質凈化能力不同?；诖?，研究考察2 種不同硅烷化海綿不同配比對基質凈化效果的影響。以1 mL提取液為凈化對象，將不同數目的硅烷化海綿微柱預先裝入2.5 mL注射器中，通過抽拉注射器塞桿輔助完成對體積樣品溶液的“自發浸潤-物理擠壓”基質分離過程。當使用1 個或2 個海綿微柱時，浸入海綿內部微孔的溶液體積均不足50%。當填裝過多海綿微柱時（n≥5），頂部的海綿難以被提取液浸潤。同時放置4 個海綿微柱時，1 mL提取液能夠完全被吸入海綿微孔內。因此，在后續凈化過程中，均選取海綿微柱數目為4。研究比較OTS@MeS與ATS@MeS不同用量比（4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4，n/n）對回收率分布的影響，并與未改性MeS進行對比。結果如圖4所示，MeS經硅烷化改性后能顯著提高化合物的回收率，且OTS@MeS和ATS@MeS比例為2∶2和0∶4時，回收率在80%～120%的化合物數量最多。研究表明凈化吸附劑C18和PSA的使用可以有效降低豬肉樣品中磷脂含量，C18的除脂效果優于PSA，且對磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸的去除效果好于磷脂酰膽堿，而聯合使用C18和PSA吸附劑能增加弱基質效應（matrix effect，ME）（±20%）的化合物數量[37]。據此推測上述實驗結果與C18和PSA兩種吸附劑不同的基質凈化選擇性相關。綜合考慮基質凈化選擇性及回收率結果，選擇OTS@MeS和ATS@MeS配比為2∶2用于后續豬肉提取液基質凈化。

圖4 不同MeS及其用量配比對回收率分布的影響Fig.4 Effect of MeS and mixtures of OTS@MeS and ATS@MeS in different proportions on the recoveries of analytes

2.4.2 動靜態凈化模式對比

MeS良好的機械性能和彈性可支持動態凈化和靜態凈化2 種模式。動態凈化是通過反復快速抽拉注射器塞桿加速基質在提取液混合擴散，以達到高效吸附基質的目的，屬于動力學行為；而靜態凈化則是將提取液吸取到注射器內后，通過穩態的自由擴散方式達到基質吸附的目的，屬熱力學行為。本實驗比較了6 種凈化方式對回收率結果的影響：1）動態吸附1 次（1 cycle）；2）動態吸附3 次（3 cycle）；3）動態吸附5 次（5 cycle）；4）靜態吸附1 min（1 min）；5）靜態吸附5 min（5 min）；6）靜態吸附10 min（10 min）。如圖5所示，動靜態凈化模式下目標化合物的回收率分布總體差異較小，除SMP外所有抗生素回收率均處于60%～120%之間，且動態吸附1 次處于80%～120%范圍內化合物數量較多。分析比較6 種凈化方式相應平均回收率（依次為89.0%、87.9%、88.6%、88.3%、84.8%和85.8%）可知，較長時間的靜態凈化（5 min和10 min）會降低所監測抗生素的總體回收率。綜合考慮回收率結果和凈化速率，最終選擇快速動態吸附1 次作為基質凈化模式。

圖5 不同凈化模式下吸附次數和靜置時間對回收率的影響Fig.5 Effect of number of adsorption times and standing time on the recoveries of analytes in different purification modes

2.5 方法驗證

2.5.1 線性范圍、ME、檢出限（limit of detection，LOD）及定量限（limit of quantitation，LOQ）

在1～400 μg/kg范圍內配制49 種抗生素的混合標準溶液，以目標物質量濃度為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標分別繪制標準曲線。如表2所示，49 種抗生素的線性相關系數均大于0.999，說明本實驗建立的方法具有良好的線性關系，能夠滿足定量分析的要求。分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計算目標物的LOD和LOQ，49 種抗生素的LOD為0.1～10.0 μg/kg，LOQ為0.3～30.3 μg/kg。

表2 49 種抗生素的線性方程、相關性數、ME、LOD和LOQ及MRLTable 2 Calibration curve equations,correlation coefficients,matrix effects,LODs and LOQs for 49 antibiotics

當使用UPLC-MS/MS檢測時，豬肉樣品中的干擾基質會對化合物產生離子增強或抑制效應，稱為ME。對每種化合物在豬肉種的ME進行評估，計算公式如下：

式中：ka和kb分別為目標化合物在基質匹配溶液和標準溶液對應線性方程的斜率。

一般而言，ME＝0表示不存在ME；ME在±20%范圍內表示ME不顯著；ME＜－20%和ME＞20%則表示存在顯著基質抑制或增強效應。如表2所示，經2 種硅烷化海綿凈化后，所考察抗生素ME均不顯著（≤±20%）。除了SMP、PIP與OXA外，其余抗生素ME均在±10%以內，這表明使用硅烷化MeS凈化可有效消除豬肉的ME。為獲得更準確的定量結果，本實驗進一步采用基質匹配外標法進行定量分析。

2.5.2 加標回收率及精密度

分別在低中高3 個加標水平（10、100、200 μg/kg）向空白豬肉樣品中添加適量抗生素混合標準溶液，每個加標濃度均進行日內精密度實驗（重復6 次）和日間精密度實驗（連續3 d，每天重復3 次），計算方法的回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）?？紤]到部分抗生素LOQ較高（≥10 μg/kg），SGD、SSX和SCP的低濃度加標水平選定為15 μg/kg，DMZ的低濃度加標水平選定為30 μg/kg，其他抗生素低濃度加標水平均選定為10 μg/kg。如表3所示，49 種抗生素的加標回收率均在65.0%～112.7%范圍內，日內RSD為0.3%～11.8%，日間RSD為2.4%～18.4%，均小于20%，證明該方法具有良好的準確度和精密度。

表3 49 種抗生素在豬肉加標回收率及精密度Table 3 Spiked recoveries and precision of 49 antibiotics in pork%

2.5.3 材料對比

商業固相分散吸附劑如PSA、C18與GCB及其組合等是采用QuEChERS技術高效凈化動物源食品的常用凈化劑。在同等條件下，對比分析了所開發“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿組合材料與“PSA＋C18”組合以及“PSA＋C18＋GCB”組合吸附劑的凈化效果，加標回收率對比結果如圖6所示。采用“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿組合時加標回收率均處于60%～120%之間，且處于80%～120%區間的藥物數量最多。與“PSA＋C18”凈化組合相比（CIP 73.1%、NOR 78.1%、PEF 77.2%、ENO 69.4%），凈化海綿組合能夠顯著提升部分喹諾酮類藥物（CIP 83.4%、NOR 84.5、PEF 91.4%、ENO 81%）的加標回收率?！癙SA＋C18＋GCB”組合用于基質凈化時，大部分喹諾酮類獸藥的回收率顯著降低（＜60%）。這可能是喹諾酮類藥物分子中的芳香共軛平面結構與GCB材料間的強吸附作用導致的。此外，通過ME進一步考察和對比了“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿組合材料與“PSA＋C18”組合吸附材料的凈化效果，除SMM（ME＝47%）外，上述2 種凈化吸附劑組合ME均不顯著（ME≤±20%）（圖7）。相比較而言，“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿組合材料對較多藥物具有輕微的基質抑制效應，而“PSA＋C18”組合吸附材料呈現出輕微的基質增強效應。綜合而言，所開發“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿材料具有同等甚至更優的基質凈化效果，且基質分離過程方便快捷、無需離心等耗時環節，在豬肉抗生素多殘留分析中具有良好的適用性。

圖6 不同凈化材料對所監測49 種抗生素藥物回收率分布的影響Fig.6 Influence of different sorbents on the recoveries of 49 antibiotics

圖7 不同凈化材料對所監測49 種抗生素藥物ME的影響Fig.7 Influence of different sorbents on the ME of 49 antibiotics

2.5.4 實際樣品分析結果

應用本實驗建立的方法對市場購買的36 份豬肉樣品進行檢測，結果均未檢測出抗生素殘留。

3 結論

本實驗將硅烷化MeS用于豬肉抗生素多殘留基質凈化，通過比較不同提取條件、海綿用量配比及基質凈化模式確定最佳前處理條件，建立了改良QuEChERS結合UPLC-MS/MS技術檢測豬肉中49 種抗生素多殘留的快速分析方法。該方法用硅烷化MeS代替常規的基質凈化材料，僅需簡單推拉注射器即可完成樣品凈化，能夠大大簡化前處理過程，縮短樣品前處理時間，實現大批量樣品的快速檢測。此外，該方法線性范圍廣、ME低、準確度和精密度良好、靈敏度高、適用范圍廣，可用于豬肉中49 種抗生素多殘留的快速定量檢測。