基于電子鼻與GC-MS融合技術的優(yōu)質紅茶和缺陷紅茶香氣品質評價

王立磊，楊艷芹，謝佳靈，繆伊雯，王啟威，江用文，鄧余良，童華榮,*，袁海波,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特種經(jīng)濟動植物生物學與遺傳育種重點實驗室，浙江 杭州 310008）

工夫紅茶作為我國特有的紅茶品類，以其香高、色艷、味濃的特點深受消費者喜愛。香氣是影響工夫紅茶市場價格和消費者喜好度的重要因素之一，一款優(yōu)質的工夫紅茶常具有香氣鮮甜的品質特點，而諸如青氣、陳味、熟悶味、老火香、焦末氣等令人不悅的氣味則會導致茶葉綜合品質下降，從而產(chǎn)生缺陷紅茶[1]。加工工藝是決定工夫紅茶香氣品質的關鍵因素，主要包括萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥4 個步驟。萎凋程度輕、發(fā)酵程度低容易促使成品茶產(chǎn)生青氣；揉捻不足則造成香氣淡薄；發(fā)酵過度會導致香氣熟悶；干燥溫度過高或時間過久致使產(chǎn)生老火香和焦末氣。如今，紅茶市場魚龍混雜，以次充好、虛假標注等現(xiàn)象屢見不鮮，嚴重損害消費者利益，因此，做好優(yōu)質紅茶與缺陷紅茶的香氣品質評價具有十分重要的意義。

目前，紅茶香氣品質評價主要依賴于傳統(tǒng)的人工感官審評，此方法易受個體因素影響，穩(wěn)定性較差；同時由于評價人員的缺乏及其檢測效率偏低，該方法無法實現(xiàn)大批量樣品的快速檢測[2]。因此，開發(fā)以儀器分析為手段的客觀評價方法迫在眉睫。快速氣相電子鼻（fast gas chromatography-electronic-nose，GC-E-Nose）基于氣相色譜分離的原理，配有2 根不同極性的色譜柱以及2 個氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），可分離檢出更多的氣味化合物信號，目前在茶葉風味研究中廣泛應用。Chen Jiayu等[3]使用GC-E-Nose對滇紅工夫紅茶茶湯香氣進行評價，發(fā)現(xiàn)呋喃、乙酸甲酯、2,3-戊二酮、檸檬烯和芳樟醇等揮發(fā)性組分與滇紅工夫香氣質量成正比。氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術以其強大的定性和定量性能，目前在茶葉領域廣泛應用。鮑忠贊等[4]采用GC-MS分析溫州綠茶陳化前后香氣物質的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)順-2-戊烯-1-醇、2,4-庚二烯醛和3,5-辛二烯-2-酮是鑒別新茶與陳茶的關鍵物質。肖作兵等[5]采用GC-MS結合偏最小二乘回歸分析，發(fā)現(xiàn)工夫紅茶的青草氣屬性與己醛、反-2-己烯醛和2,3-丁二酮等物質呈顯著正相關。Yang Yanqin等[6]研究指出，經(jīng)由美拉德反應及Strecker降解所形成的吡嗪、呋喃等雜環(huán)類物質是焦末氣和老火香產(chǎn)生的重要原因。單一分析儀器只能對茶葉某一特定屬性進行表征，多種分析技術相融合可以多角度、全方位反映茶葉的綜合品質特征，進而提高茶葉分類的準確性和可靠性，多元數(shù)據(jù)融合技術在食品風味及品質評價方面發(fā)揮著越來越重要的作用[7]。陳佳瑜等[8]使用電子鼻、電子舌和電子眼融合信息實現(xiàn)了對滇紅工夫紅茶綜合品質的定性和定量評價，且基于多元融合信息所建立的分類模型較單一技術信息模型效果更優(yōu)。

本研究以市售工夫紅茶為材料，通過專家感官評定篩選出優(yōu)質工夫紅茶和缺陷工夫紅茶，基于GC-ENose和GC-MS融合技術結合正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）對茶樣進行綜合研究，探明優(yōu)質工夫紅茶與缺陷工夫紅茶的關鍵差異組分，以期為工夫紅茶品質提升提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司；C7～C40正構烷烴 上海源葉生物科技有限公司；C6～C16正構烷烴美國Restek公司。

1.2 儀器與設備

Heracles II GC-E-Nose 法國Alpha M.O.S.公司；7890B-7000C型GC-MS聯(lián)用儀、20 mL頂空樣品瓶、18 mm頂空瓶蓋（magnetic PTFE/sil）美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取纖維美國Supelco公司；MTC-100恒溫混勻儀 杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官審評

感官審評依據(jù)GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[9]，由5 位來自中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所的高級評茶師組成審評小組，采用百分制對茶葉的香氣進行評價。具體審評方法如下：準確稱取代表性茶樣3.0 g于審評杯中，茶水比1∶50（g/mL），注滿沸水加蓋沖泡5 min，將茶湯濾至審評碗，葉底留于杯中。嗅杯中葉底香氣，采用評語和百分制評分，結合熱聞（杯溫約75 ℃）、溫聞（杯溫約45 ℃）、冷聞（杯溫接近室溫）對樣品香氣類型、強度、純異和持久性進行評價。

1.3.2 GC-E-Nose分析

采用頂空自動進樣裝置結合氣相電子鼻進行檢測分析。準確稱取0.5 g工夫紅茶樣品放入20 mL頂空瓶中，加入3 mL水，用硅膠蓋密封。由電子鼻自動進樣器轉移至孵化箱中，在60 ℃、500 r/min條件下孵化20 min。孵化結束后，采用氣密注射器（70 ℃）以300 μL/s的流速將5 000 μL含有揮發(fā)性有機化合物的頂空氣體在22 s內注入系統(tǒng)。揮發(fā)性有機化合物采用Tenax捕集阱（20 ℃）富集27 s，隨后在240 ℃進行熱解吸并進入毛細管柱中（MXT-5弱極性和MXT-1701中等極性）進行分離。升溫程序：初始溫度50 ℃，持續(xù)5 s，又以0.1 ℃/s升溫速率上升至80 ℃，再以0.4 ℃/s的速率升溫到250 ℃，保持10 s。載氣：氦氣，流速0.8 mL/min。2 個FID檢測器溫度為260 ℃，分析時長為740 s。每個樣品重復3 次實驗。

1.3.3 GC-MS分析

采用頂空固相微萃取結合GC-MS進行分析。準確稱取0.5 g茶樣置入20 mL頂空瓶中，加入5 mL純凈水，瓶蓋密封，輕輕搖晃混勻。將DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中，置于60 ℃恒溫混勻儀中提取60 min。隨后將萃取頭插入進樣口于230 ℃熱解吸5 min。香氣組分采用HP-5ms毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.5 μm）進行分離。升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升溫速率升至160 ℃，維持2 min，再以10 ℃/min速率升溫至270 ℃，持續(xù)2 min。電離模式為電子電離裂解模式；電離能量為70 eV；質量掃描范圍m/z40～450；離子源溫度為230 ℃。

另外,本實驗中的MOSCAP采用的高k介質層/SiOx界面層的疊層結構,所以Ig不僅與高k介質的物理厚度有關,還與退火過程中高k介質的晶相變化以及SiOx界面層厚度變化有關。

使用安捷倫MassHunter工作站軟件內置插件參照NIST 11質譜庫進行揮發(fā)性有機化合物的搜索與識別，根據(jù)C7～C40正構烷烴計算化合物保留指數(shù)（retention index，RI）并與文獻中RI相比對（文獻RI來源于https://webbook.nist.gov/chemistry/）。采用峰面積歸一化法對已定性化合物進行定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 23.0軟件對所采集數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。使用Excel軟件將電子鼻采集的揮發(fā)物響應峰面積數(shù)據(jù)集與GC-MS采集的揮發(fā)物相對百分含量數(shù)據(jù)集進行初級融合，得到電子鼻-GC-MS融合數(shù)據(jù)集。采用SIMCA 14.1軟件分別對電子鼻數(shù)據(jù)集、GC-MS數(shù)據(jù)集、電子鼻-GC-MS融合數(shù)據(jù)集進行UV（unit variance scaling）歸一化處理，在此基礎上進一步開展OPLS-DA[8]。柱狀堆積圖和箱線圖采用Origin 2018軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 感官審評結果分析

依據(jù)專家感官審評結果（表1）將14 個茶樣分成兩類：優(yōu)質紅茶組，用R表示（7 個）；缺陷紅茶組，用F表示（7 個）。優(yōu)質紅茶組香氣特征主要呈現(xiàn)甜香、甜花香等，從香氣評分來看，優(yōu)質紅茶香氣評分均高于90 分，分值范圍介于90.40～92.57 分之間。缺陷紅茶組香氣主要表現(xiàn)為熟悶、不純、駁雜、青草氣強、火工偏高等，其評語中以“偏、透、欠”等傾向性強的副詞修飾較多，從香氣評分來看缺陷紅茶評分則低于85 分，分值范圍76.07～83.57 分。綜上分析可知，兩類紅茶香氣品質存在明顯差異性。

表1 工夫紅茶感官審評結果Table 1 Results of sensory evaluation of Congou black tea

2.2 基于GC-E-Nose的優(yōu)質紅茶和缺陷紅茶揮發(fā)性組分表征

2.2.1 揮發(fā)性成分定性定量分析

區(qū)別于傳統(tǒng)的傳感器型電子鼻，Heracles II GC-ENose采用氣相色譜原理，經(jīng)2 根不同極性的毛細管柱進行分離，可以在較短時間內獲取樣品的揮發(fā)性指紋圖譜信息[10]。依據(jù)峰響應面積＞500的原則，2 根色譜柱共分離篩選出44 個特征峰，進一步采用RI結合AroChemBase數(shù)據(jù)庫對化合物進行鑒定，共定性出36 個化合物，主要包括醛類8 個、烯烴類6 個、酯類5 個、酮類4 個、醇類3 個、雜環(huán)類物質3 個、硫化物2 個、酸類2 個、烷烴類2 個和芳烴類1 個。乙醇、乙醛、二甲基硫醚、乙酸乙酯、苯、二甲基二硫化物、異丁酸乙酯、3-己酮8 個揮發(fā)性香氣化合物在2 根色譜柱中同時檢出。綜上所述，兩組紅茶樣本采用GC-E-Nose技術得到1 個44 維的數(shù)據(jù)集用以表征其香氣品質（表2）。

表2 基于GC-E-Nose技術的揮發(fā)性化合物定性結果Table 2 Qualitative results of volatile compounds based on GC-E-Nose

2.2.2 OPLS-DA

為了進一步考察兩組紅茶的分類情況，進行OPLSDA。相較于PLS-DA，OPLS-DA添加了正交計算以消除與分類無關的信息，能有監(jiān)督地實現(xiàn)不同分組間樣品的有效分離。基于GC-E-Nose檢測的揮發(fā)性成分響應峰面積數(shù)據(jù)集構建OPLS-DA模型，其得分圖如圖1A所示，缺陷紅茶位于第2象限和第3象限，優(yōu)質紅茶位于第1象限和第4象限，兩者分離趨勢明顯，模型＝0.973，Q2＝0.925，表明該模型具有較好的解釋能力和預測能力。置換檢驗（n＝200）中R2和Q2的截距分別為0.426和－0.865，Q2截距＜0，說明該模型不存在過擬合（圖1B）。結果表明，GC-E-Nose結合多元統(tǒng)計分析可實現(xiàn)缺陷紅茶與優(yōu)質紅茶快速區(qū)分。

圖1 基于GC-E-Nose技術的工夫紅茶揮發(fā)性成分OPLS-DAFig.1 OPLS-DA plot of volatile components in Congou black tea based on GC-E-Nose and permutation test of OPLS-DA model

2.3 基于GC-MS技術的優(yōu)質紅茶和缺陷紅茶揮發(fā)性組分表征

2.3.1 揮發(fā)性組分定性定量分析

為進一步深入比較兩組樣品的揮發(fā)性組分差異情況，采用GC-MS技術對兩組茶樣進行定性定量分析，共鑒定出73 種揮發(fā)性組分，具體結果如表3所示。根據(jù)化學結構可分為8 類，包括醇類化合物12 種、醛類化合物10 種、烯烴類化合物9 種、酯類化合物23 種，酮類化合物11 種，雜環(huán)類化合物4 種，芳香烴類化合物3 種和烷烴類化合物1 種。不同類別的化合物在兩組紅茶中含量各異（圖2A、B），以其特定的含量配比形成優(yōu)質紅茶和缺陷紅茶的品質特征。

圖2 基于GC-MS技術的工夫紅茶揮發(fā)性成分分析Fig.2 Analysis of volatile components in Congou black tea based on GC-MS

表3 基于GC-MS技術的揮發(fā)性化合物定性定量結果Table 3 Qualitative and quantitative results of volatile compounds based on GC-MS

醇類化合物相對含量最高，在優(yōu)質紅茶中平均相對含量44.25%，高于缺陷紅茶組平均相對含量（31.30%），代表性物質為苯乙醇、芳樟醇與香葉醇，呈現(xiàn)花香和甜香，為紅茶特征性香氣物質[11]。其次為醛類化合物，在優(yōu)質紅茶中平均相對含量為21.61%，在缺陷紅茶組平均相對含量為29.45%，主要物質為苯乙醛、己醛與檸檬醛等，有助于工夫紅茶花香和清香的產(chǎn)生[12]。烯烴類化合物在優(yōu)質紅茶中平均相對含量為19.28%，在缺陷紅茶組平均相對含量為26.91%，主要化合物為β-羅勒烯、1,3,8-對孟三烯以及β-月桂烯等，具有木香、清香和果香等[13]。酯類化合物在優(yōu)質紅茶和缺陷紅茶中平均相對含量分別為12.82%和6.55%，水楊酸甲酯是構成斯里蘭卡紅茶冬青風味的關鍵香氣物質，可以作為區(qū)分中國紅茶和斯里蘭卡紅茶的指示化合物[14]；二氫獼猴桃內酯具有成熟漿果香、木香，梅思凡[15]研究發(fā)現(xiàn)其在紅茶提香中后期含量呈上升趨勢，與焦糖香和烘焙香相關。酮類化合物在優(yōu)質紅茶中平均相對含量為1.51%，在缺陷紅茶組平均相對含量為4.86%，6-甲基-5-庚烯-2-酮、大馬士酮和β-紫羅酮等，是紅茶重要的香氣化合物，能產(chǎn)生焦糖香和花香[16-17]。雜環(huán)類化合物主要包括3-苯基呋喃、2-戊基呋喃和吲哚等，是形成紅茶焦糖風味和烘烤風味的重要原因，在優(yōu)質紅茶中平均相對含量為0.25%，在缺陷紅茶組平均相對含量為0.42%[18]。

2.3.2 OPLS-DA

以GC-MS鑒定的73 種揮發(fā)性成分相對含量數(shù)據(jù)集為基礎，建立了工夫紅茶香氣品質分類OPLS-DA模型，結果如圖2C所示，缺陷紅茶樣品與優(yōu)質紅茶樣品分別位于X軸的負半軸和正半軸，兩組間分離明顯（＝0.951，Q2＝0.930），存在可視化的差異，與GC-E-Nose模型結果較好地吻合。置換檢驗結果顯示，R2＝0.356，Q2＝－0.582（圖2D），回歸直線Q2與Y軸的截距小于0，表明模型未過擬合。該結果說明GC-MS結合多元統(tǒng)計分析可以實現(xiàn)缺陷紅茶和優(yōu)質紅茶的準確分類。

2.4 基于GC-E-Nose和GC-MS融合技術的缺陷紅茶與優(yōu)質紅茶揮發(fā)性組分表征

為實現(xiàn)對工夫紅茶香氣品質全面而綜合的分析，將上述提及的44 維GC-E-Nose數(shù)據(jù)集與73 維GC-MS數(shù)據(jù)集融合為一個117 維數(shù)據(jù)集，并采用UV歸一化處理，以構建基于電子鼻-GC-MS融合技術的工夫紅茶香氣品質分類模型。

融合數(shù)據(jù)OPLS-DA結果如圖3所示，優(yōu)質紅茶組位于第1、4象限中，缺陷紅茶組位于第2、3象限中（圖3A），兩類茶樣分類明顯，組內聚攏趨勢更強，其模型參數(shù)（＝0.976，Q2＝0.959）較單一GC-E-Nose或GC-MS技術的OPLS-DA模型有一定提升，模型擬合和預測能力更強。為了驗證該模型的準確性，對數(shù)據(jù)進行200 次置換檢驗，結果顯示R2＝0.434，Q2＝－0.640（圖3B），說明該模型可靠，不存在過擬合現(xiàn)象。此外，依據(jù)變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1和P＜0.05的原則初步篩選缺陷紅茶與優(yōu)質紅茶的關鍵差異性組分，共篩選出47 個變量，其中34 個變量來源于GC-MS，13 個變量來源于GC-E-Nose（圖3C）。進一步地，基于VIP＞1.6的原則，篩選出8 個區(qū)分優(yōu)質紅茶與缺陷紅茶的重要差異化合物（9 個數(shù)據(jù)變量對應8 個物質），包括二甲基硫醚（B3、B25）、β-紫羅酮（A59）、(3E)-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯（A20）、二氫獼猴桃內酯（A64）、芳樟醇（A17）、苯乙醇（A19）、δ-辛內酯（A41）和γ-壬內酯（A45）。其中二甲基硫醚、(3E)-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯、芳樟醇3 個物質在載荷圖（圖3D）中更靠近優(yōu)質紅茶組，其含量在優(yōu)質紅茶組中更高（圖4），而β-紫羅酮、二氫獼猴桃內酯、苯乙醇、δ-辛內酯和γ-壬內酯5 個物質則更靠近缺陷紅茶組，其相對含量在缺陷紅茶組中更高。二甲基硫醚具有煮熟玉米的氣味，被鑒定為玉米香型綠茶的關鍵香氣物質[19]，Tao Meng等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)二甲基硫醚僅在新鮮祁門紅茶中檢出，并有助于茶葉新鮮度的保持。芳樟醇、β-紫羅酮是紅茶中的常見組分，也被認為是紅茶香氣構成的關鍵物質[21-22]。Su Dan等[23]研究發(fā)現(xiàn)β-紫羅酮對祁門紅茶香氣有顯著負向影響，隨著祁門紅茶等級降低，β-紫羅酮含量呈上升趨勢。二氫獼猴桃內酯是β-紫羅酮的氧化產(chǎn)物，有助于木質香氣的形成，在低等級的九曲紅梅中含量較高，可以作為判斷儲藏時間的標志物[24-27]。畢婉君等[28]研究發(fā)現(xiàn)(3E)-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯含量在晾青后顯著增加，可以作為烏龍茶智能化做青的香氣指標之一。嚴寒[29]研究發(fā)現(xiàn)具有椰子香和奶香的γ-壬內酯在壽眉中隨貯藏年份的延長，其含量呈上升趨勢，馮曉雪等[30]研究表明γ-壬內酯對壽眉微生物發(fā)酵后產(chǎn)生的菌花香和陳香發(fā)揮著重要作用。

圖3 基于GC-E-Nose與GC-MS融合信息的工夫紅茶揮發(fā)性成分OPLS-DA模型Fig.3 OPLS-DA analysis of volatile components in Congou black tea based on the fusion of GC-E-Nose and GC-MS data

圖4 基于VIP＞1.6篩選出的關鍵差異性組分箱線圖Fig.4 Boxplots of key differential components based on VIP ＞ 1.6

目前，工夫紅茶香氣的研究主要集中于某產(chǎn)地或某品種的優(yōu)質紅茶香氣品質特征上，揭示了眾多香氣物質對于紅茶香氣剖面的影響。本研究中己醛化合物在電子鼻與GC-MS檢測中均有檢出，表現(xiàn)為青草氣味，同工夫紅茶青草氣味呈顯著正相關，在缺陷組紅茶中平均相對含量略高于優(yōu)質組紅茶。Dong Rongjian等[31]研究發(fā)現(xiàn)令人不愉悅的3-甲基-1-丁醇會致使黃茶產(chǎn)生水悶味，且在悶黃后期其含量顯著增加，但在本研究中優(yōu)質組與缺陷組相對含量未見明顯差異。苯乙醇與水楊酸甲酯是紅茶香氣形成的關鍵物質，苯乙醇在缺陷組中相對含量為優(yōu)質組3 倍，水楊酸甲酯在優(yōu)質組中相對含量為缺陷組的2 倍；牛云蔚等[32]報道指出水楊酸甲酯與苯乙醇的互作表現(xiàn)為掩蔽作用，這或許是缺陷組紅茶品質下降的原因之一。缺陷組的二氫獼猴桃內酯相對含量約為優(yōu)質組百分含量的8 倍，這或許是陳味產(chǎn)生的關鍵原因之一[20,33]。Xue Jinjin等[34]研究發(fā)現(xiàn)(E)-β-法尼烯和6-甲基-5-庚烯-2-酮與工夫紅茶的花香屬性呈正相關，而與其甜香屬性呈負相關。同一化合物對樣品香氣剖面中不同特征的影響也是香氣形成的關鍵因素。香氣是同一系統(tǒng)內，揮發(fā)性成分與非揮發(fā)性成分綜合作用產(chǎn)生的結果，揮發(fā)性物質的組成、含量和配比都深刻影響香氣的形成。

3 結論

本研究依據(jù)專家感官審評結果將14 個工夫紅茶樣品劃分為缺陷紅茶和優(yōu)質紅茶兩類。基于GC-E-Nose與GC-MS技術分別獲得44 維和73 維的數(shù)據(jù)集，將其融合得到117 維多元信息數(shù)據(jù)集用于缺陷紅茶和優(yōu)質紅茶的分類判別表征。基于融合信息建立的OPLS-DA模型可實現(xiàn)兩類紅茶的有效分類，且融合信息模型的擬合性能和預測性能（＝0.976，Q2＝0.959）優(yōu)于單一數(shù)據(jù)源GC-E-Nose（＝0.973，Q2＝0.925）和GC-MS（＝0.951，Q2＝0.930）。基于VIP＞1.6和P＜0.05共篩選出8 個區(qū)分兩類紅茶的關鍵差異性組分，主要包括二甲基硫醚（B3、B25）、β-紫羅酮（A59）、(3E)-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯（A20）、二氫獼猴桃內酯（A64）、芳樟醇（A17）、苯乙醇（A19）、δ-辛內酯（A41）和γ-壬內酯（A45）。研究結果表明，基于GC-E-Nose和GC-MS融合技術結合多元統(tǒng)計分析可以實現(xiàn)缺陷紅茶和優(yōu)質紅茶的快速、準確分類。該方法可作為專家感官審評方法的補充，為紅茶品質控制和質量提升提供技術支撐。