真空冷凍干燥提高乳酸菌存活率及延長(zhǎng)貯藏期的研究進(jìn)展

劉開(kāi)文，馬 雯,2，金 剛,2,*

（1.寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏葡萄與葡萄酒研究院，寧夏 銀川 750021）

乳酸菌真空冷凍干燥簡(jiǎn)稱(chēng)凍干，是指將乳酸菌細(xì)胞懸液置于冰點(diǎn)以下的溫度進(jìn)行預(yù)凍，利用真空環(huán)境下冰晶低溫升華去除水分，進(jìn)而以?xún)龈煞坌问奖４娴募夹g(shù)。凍干可使菌體保持原有生化特性及活性[1]。但凍干過(guò)程也會(huì)造成乳酸菌的活性降低，甚至死亡[2]。

保持較高的存活率是乳酸菌凍干粉充分發(fā)揮其功能的重要保障[3]，為了探究?jī)龈蛇^(guò)程中致使乳酸菌菌粉失活的機(jī)制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥后乳酸菌存活率降低的原因主要有以下幾個(gè)方面：凍干過(guò)程造成的細(xì)胞膜通透性增加[4]、膜流動(dòng)性降低[5]、酶及蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)變性[6]、遺傳物質(zhì)改變[7]等。為進(jìn)一步提高凍干后乳酸菌存活率及延長(zhǎng)貯藏期，本文就凍干過(guò)程中影響乳酸菌存活率的因素及提高其存活率、延長(zhǎng)貯藏時(shí)間的措施進(jìn)行總結(jié)，旨在為制備活性高且耐貯藏乳酸菌制劑提供依據(jù)與參考。

1 真空冷凍干燥對(duì)乳酸菌的影響

真空冷凍干燥分為冷凍和干燥兩個(gè)階段，均會(huì)導(dǎo)致乳酸菌活力下降甚至死亡。目前，諸多學(xué)者對(duì)凍干引起的乳酸菌失活機(jī)理進(jìn)行了深入的探討。凍干過(guò)程主要通過(guò)以下方面影響乳酸菌的存活率。

1.1 凍干對(duì)菌體的物理?yè)p傷

在凍干過(guò)程中溫度的急劇下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)晶，損傷細(xì)胞膜，進(jìn)而對(duì)乳酸菌菌體產(chǎn)生物理?yè)p傷。眾多研究表明，冷卻速率會(huì)極大地影響冰晶的產(chǎn)生，冷卻速率過(guò)快，容易產(chǎn)生較大的冰晶，從而刺破細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[8]。在凍干過(guò)程中，存在兩個(gè)最大的冰晶生成溫度帶，即0～－3.7 ℃和－30～－37.4 ℃。在上述溫度區(qū)間內(nèi)，若物料溫度升降緩慢，會(huì)產(chǎn)生較多冰晶，更易損傷菌體[9]。因此，快速通過(guò)最大冰晶生成帶可以有效減少菌數(shù)損失。

1.2 凍干對(duì)細(xì)胞膜的損傷

細(xì)胞膜能隔絕外界環(huán)境，是乳酸菌的重要保護(hù)屏障[8]，其完整性是凍干成功的關(guān)鍵。

在干燥脫水環(huán)節(jié)，磷脂雙分子層頭部基團(tuán)上的水分子被酰基替換，致使鏈間的作用力增大，同時(shí)磷脂分子的狀態(tài)也從液晶態(tài)向凝膠態(tài)轉(zhuǎn)化，使磷脂分子之間產(chǎn)生空隙，細(xì)胞膜的通透性增大，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄露，從而降低細(xì)胞的活力[7]（圖1）。Basholli-Salihu等[10]比較冷凍干燥和冷凍之后的菌體活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥后的菌體活性較冷凍后的菌體活性有明顯的下降。此外，有研究表明未添加保護(hù)劑的菌體相較于添加保護(hù)劑的菌體β-半乳糖苷酶（細(xì)胞衰老標(biāo)志物）活性有明顯增大[11-12]，這也進(jìn)一步說(shuō)明在凍干過(guò)程中細(xì)胞膜發(fā)生變化，造成物質(zhì)流失，影響細(xì)胞活力。

膜的流動(dòng)性與磷脂分子脂肪酸飽和度及長(zhǎng)度密切相關(guān)[13]。增加不飽和脂肪酸的比例可以提高細(xì)胞膜對(duì)不良環(huán)境的抵抗力[14]。乳酸菌菌體可通過(guò)增加膽固醇在細(xì)胞膜中的比例、調(diào)節(jié)飽和/不飽和脂肪酸的比例從而調(diào)節(jié)外界環(huán)境對(duì)其造成的影響[15]。如Zhao Yinsuo等[16]的研究表明菌體細(xì)胞膜的流動(dòng)性提高與細(xì)胞膜中環(huán)丙烷脂肪酸比例的增加有關(guān)。Fonseca等[17]研究表明培養(yǎng)基中加入吐溫-80能夠增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的比例，隨之改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，降低凍干過(guò)程中的菌體死亡率。

1.3 凍干對(duì)菌體內(nèi)外滲透壓的損傷（溶質(zhì)損傷）

由于細(xì)胞內(nèi)外液組成成分不同，故凝固點(diǎn)也不同，即凍干過(guò)程中，菌體內(nèi)外液的凍結(jié)時(shí)間不同步。胞外液凝固點(diǎn)較內(nèi)液高，在冷凍過(guò)程中更早被凍結(jié)、濃縮，為維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，細(xì)胞內(nèi)液向外移動(dòng)，致使內(nèi)液溶質(zhì)濃縮，此現(xiàn)象又稱(chēng)“溶質(zhì)效應(yīng)”[18]。“溶質(zhì)效應(yīng)”可使細(xì)胞物質(zhì)代謝紊亂或蛋白失活，甚至造成細(xì)胞死亡。

1.4 凍干對(duì)酶類(lèi)及蛋白質(zhì)的損傷

細(xì)胞內(nèi)酶的活力與菌體的物質(zhì)交換、能量代謝以及生長(zhǎng)速度等密切相關(guān)[19]，而凍干會(huì)因?yàn)槊撍鸺?xì)胞內(nèi)酶類(lèi)及蛋白質(zhì)失活[20]；細(xì)胞失水會(huì)破壞蛋白質(zhì)與水分子、細(xì)胞膜之間的相互作用力，從而削弱蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，降低酶的活性，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，使其失去功能[4]。故在凍干后細(xì)胞中保持一定的水分很關(guān)鍵。

1.5 凍干對(duì)遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的損傷

遺傳穩(wěn)定性改變是導(dǎo)致細(xì)胞失去活性的主要原因之一。干燥引起的DNA結(jié)構(gòu)變化是導(dǎo)致細(xì)胞生理?yè)p傷的主要原因[2]。乳酸菌的遺傳物質(zhì)為DNA雙螺旋，常與載體蛋白形成復(fù)合體存在。凍干過(guò)程中脫水會(huì)導(dǎo)致載體蛋白變性，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。此外，由于失水量的增加，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞溶質(zhì)濃度升高，電荷發(fā)生改變，削弱DNA中堿基對(duì)之間的疏水性，使菌體的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制，甚至發(fā)生基因變異[21]。

2 優(yōu)化凍干保護(hù)條件提高乳酸菌存活率

2.1 優(yōu)化培養(yǎng)基組成提高乳酸菌活菌密度

2.1.1 優(yōu)化培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)能有效提高乳酸菌細(xì)胞生理活性

乳酸菌的體外培養(yǎng)與培養(yǎng)基密切相關(guān)，培養(yǎng)基是適合微生物生長(zhǎng)所需的碳源、微量元素、氮源、水分等各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成的混合物[22]。通過(guò)對(duì)MRS培養(yǎng)基中各組分的比例進(jìn)行優(yōu)化，能夠?qū)θ樗峋x關(guān)鍵酶（β-半乳糖苷酶、K＋-ATP酶等）起到保護(hù)作用，從而提高乳酸菌的生理活性[23]。李娜等[24]通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基各成分及比例發(fā)現(xiàn)：當(dāng)培養(yǎng)基為蔗糖43 g/L、玉米漿干粉60 g/L、Na2HPO4-檸檬酸0.12 mol/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、MnSO4·H2O 0.10 g/L、吐溫-80 1 mL/L時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的活菌數(shù)較對(duì)照組提高了3.44 倍。趙玉鑒等[25]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌C88在優(yōu)化培養(yǎng)基上的活菌數(shù)相比于MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了2 倍。Choi等[26]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在優(yōu)化MRS培養(yǎng)基中，植物乳桿菌200665的生長(zhǎng)活性得到明顯增強(qiáng)，相同時(shí)間內(nèi)菌種產(chǎn)生量較對(duì)照組提高1.58 倍。此外，由于乳酸菌的菌株特異性和多樣性，不同種類(lèi)的乳酸菌對(duì)培養(yǎng)基中各種成分的偏愛(ài)程度不同，因此，可以根據(jù)不同菌株的喜好對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，從而提高菌株的活性。孫瑞胤等[27]在MRS培養(yǎng)基中加入0.5 mmol/L的Ca2＋，可以使植物乳桿菌LIP-1的凍干存活率提升21.52%。Chen He等[28]通過(guò)將6 種天然分子分別添加到MRS培養(yǎng)基中優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl、山梨醇二者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.6%、0.15%時(shí)，對(duì)乳桿菌菌株的凍干存活率有顯著影響，保加利亞乳桿菌的凍干存活率分別達(dá)到了為42.7%和45.4%。因此，可以根據(jù)不同乳酸菌的特異性，開(kāi)發(fā)出特異性?xún)?yōu)化培養(yǎng)基，從而增強(qiáng)菌體的生理活性，進(jìn)而提高菌體的凍干存活率。

2.1.2 促進(jìn)乳酸菌生物膜的合成從而有效提高菌體抵抗凍干損傷的能力

生物膜是乳酸菌的重要保護(hù)屏障，同時(shí)也是維持細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的場(chǎng)所，并具有一定的機(jī)械穩(wěn)定性[29]。研究表明，細(xì)胞膜的形成與培養(yǎng)基中的碳源密切相關(guān)，如培養(yǎng)基中缺乏碳源，可使細(xì)胞膜形成困難，反之，碳源濃度過(guò)高又會(huì)抑制細(xì)胞膜形成[30]，故合適的碳源濃度有助于菌體細(xì)胞膜合成。另外Mn2＋、Mg2＋和Fe3＋等一些金屬離子也對(duì)細(xì)胞膜的形成有影響。E Jingjing等[31]將細(xì)胞膜測(cè)定和轉(zhuǎn)錄組分析相結(jié)合發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的K＋能顯著促進(jìn)植物乳桿菌LIP-1生物膜的形成，增強(qiáng)菌體的抗逆能力。但并非所有的金屬離子都對(duì)細(xì)胞膜形成有積極作用，如Cu2＋、Al3＋、Zn2＋和Pb＋等金屬離子可抑制生物膜形成，不利于菌體抵抗逆境[32-33]。因此，在培養(yǎng)基中選擇性地添加一些金屬離子，如K＋、Ca2＋等能夠促進(jìn)細(xì)胞膜的形成，增強(qiáng)菌體抗逆性，進(jìn)而提高凍干存活率。

2.1.3 改變細(xì)胞膜不飽和酸脂肪酸比例從而影響菌體逆境耐受性

凍干過(guò)程中細(xì)胞會(huì)因?yàn)槊撍畬?dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，代謝功能受阻，菌株凍干存活率降低。脂肪酸對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性起著至關(guān)重要的作用，其中較高的不飽和脂肪酸含量可提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)逆境的抗性。為此，研究者們采用了多種方法，如通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值、加入適當(dāng)濃度的油酸、無(wú)機(jī)鹽離子、吐溫-80等組分可使不飽和脂肪酸含量增加。陳境等[34]研究表明，若將MRS培養(yǎng)基的初始pH值從7.4下調(diào)至6.8，植物乳桿菌LIP-1凍干存活率也隨之變化，其凍干存活率從72.43%增加至81.76%。錢(qián)志浩等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入2 mL/L吐溫-80能夠提高細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量，從而提升鼠李糖乳桿菌FJND和短乳桿菌173-1-2的凍干存活率。E Jingjing等[36]研究表明，K＋可以上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)，有助于延長(zhǎng)脂肪酸碳鏈，促進(jìn)不飽和脂肪酸含量的合成，提高細(xì)胞膜流動(dòng)性，增強(qiáng)菌體耐凍干性。何棕柏等[37]研究不同濃度油酸對(duì)菌株凍干存活率的影響發(fā)現(xiàn)，加入0.001%油酸到培養(yǎng)基中，同樣可以提高細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量，提升菌體凍干存活率。

總之，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，能夠增強(qiáng)乳酸菌生理活性，提升乳酸菌自我保護(hù)能力，增加乳酸菌細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量，增強(qiáng)乳酸菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性，顯著提升其凍干存活率。

2.2 脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳酸菌抗凍能力

脅迫預(yù)處理是指將乳酸菌菌液放置特定環(huán)境中一段時(shí)間，鍛煉菌體在該環(huán)境下的耐受性，增強(qiáng)其對(duì)逆境的抵抗能力，從而提升菌株的凍干存活率。一般的脅迫預(yù)處理方式有冷脅迫、酸脅迫和熱脅迫等[38-39]。

2.2.1 冷脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳酸菌抗凍能力

冷脅迫預(yù)處理可以顯著增強(qiáng)菌株對(duì)低溫的耐受性，其作用機(jī)理可能與維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性及促進(jìn)冷應(yīng)激蛋白的表達(dá)有關(guān)。在此過(guò)程中，低溫可以使乳酸菌細(xì)胞膜上的脂肪酸成分發(fā)生變化，進(jìn)而增強(qiáng)其對(duì)低溫的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，隨著不飽和脂肪酸含量的增加，細(xì)胞膜的流動(dòng)性相應(yīng)增強(qiáng)，抗凍性能也隨之增強(qiáng)。王曉萌等[40]將嗜酸乳桿菌ATCC4356在8 ℃低溫條件下培養(yǎng)16 h，其凍干存活率比正常對(duì)照組提高了17.56%。此外，冷脅迫還可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)冷應(yīng)激蛋白（cold shock proteins，CSPs）的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)冷凍的耐受能力。李夢(mèng)洋等[41]以保加利亞乳酸菌為材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對(duì)其低溫脅迫下的應(yīng)激蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)被處理的菌株冷應(yīng)激蛋白基因cspA mRNA的拷貝量增加3.34 倍左右，說(shuō)明冷應(yīng)激蛋白的表達(dá)量得到了明顯提高。先前有研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌體內(nèi)CSPs的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)在低溫環(huán)境下有較高的穩(wěn)定性，并且保持著良好的催化活性。同時(shí)，CSPs還能防止細(xì)胞由于相關(guān)酶的變性失活引起的菌體損傷，提高了細(xì)胞的低溫耐受性[42]。因此，針對(duì)不同的乳酸菌進(jìn)行不同的預(yù)冷脅迫處理可以提高其凍干存活率。

2.2.2 熱脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳酸菌抗凍能力

熱脅迫是將乳酸菌置于比其生長(zhǎng)適宜溫度更高的條件下，使其進(jìn)行一段時(shí)間的高溫脅迫，提高乳酸菌的逆境耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，熱脅迫預(yù)處理的微生物有較高的凍干存活率，且經(jīng)過(guò)處理的微生物在真空冷凍干燥后能快速恢復(fù)生長(zhǎng)和產(chǎn)酸[43]。Zhen Ni等[44]將嗜酸乳桿菌ATCC4356在45 ℃條件下脅迫處理30 min，發(fā)現(xiàn)菌體凍干存活率提升了17.2%。此外，菌體的糖代謝和能量代謝能力也得到了提高，與對(duì)照組相比，多糖含量增加了32.24%，半乳糖產(chǎn)量增加9%。王慧君等[45]通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)了10.5 h的嗜酸乳桿菌在56 ℃環(huán)境下熱脅迫處理30 min，嗜酸乳桿菌的凍干存活率比對(duì)照組提升了50.66%。此外，將熱脅迫處理與篩選的優(yōu)良保護(hù)劑結(jié)合，45 ℃熱脅迫處理嗜酸乳桿菌ATCC 4356 30 min后，菌體的凍干存活率達(dá)到了92.8%[46]。綜上，熱脅迫處理促進(jìn)了菌體的熱激蛋白的表達(dá)，對(duì)維持細(xì)胞的能量代謝，維持細(xì)胞的生存有積極作用，從而提高細(xì)胞的抗凍性和存活率。

2.2.3 酸脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳酸菌抗凍能力

酸脅迫預(yù)處理是指將乳酸菌放置于其適宜酸性環(huán)境下一段時(shí)間，以提高菌體的凍干存活率，不同種類(lèi)的乳酸菌有各自專(zhuān)屬的酸脅迫預(yù)處理?xiàng)l件。酸脅迫預(yù)處理主要通過(guò)調(diào)節(jié)菌體細(xì)胞的糖酵解途徑和脂肪酸代謝途徑以增強(qiáng)抗凍能力[47]。有研究發(fā)現(xiàn)，酸脅迫促進(jìn)了菌株糖酵解途徑中丙酮酸與乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化，為菌體細(xì)胞提供更多生長(zhǎng)所需的能量，菌體細(xì)胞通過(guò)利用這些能量增強(qiáng)對(duì)逆境的耐受性[47]。E Jingjing等[48]研究表明，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）家族基因、脂肪酸合成（fatty acid binding，F(xiàn)AB）家族基因和丙酮酸脫氫酶基因在經(jīng)過(guò)酸脅迫后會(huì)表達(dá)上調(diào)。ACC家族基因和FAB家族基因的表達(dá)對(duì)延伸脂肪酸碳鏈和碳鏈上不飽和雙鍵的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，從而提高了不飽和脂肪酸的相對(duì)含量，而丙酮酸脫氫酶基因表達(dá)上調(diào)影響了細(xì)胞膜脂肪酸的代謝和合成。綜上所述，經(jīng)過(guò)酸脅迫預(yù)處理的乳酸菌，其在凍干過(guò)程中細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性均得到改善，凍干存活率也明顯提高。

除單一脅迫外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者還開(kāi)展了多因素協(xié)同脅迫的研究。如楊婕等[49]通過(guò)對(duì)酸-冷交互脅迫條件下乳酸菌ATM的凍干存活率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其凍干存活率可達(dá)87.19%，較對(duì)照組有顯著提高。交互脅迫預(yù)處理需要在不同的脅迫條件下進(jìn)行，故對(duì)各種脅迫條件的要求很?chē)?yán)格，因此有待于進(jìn)一步的研究。

2.3 添加保護(hù)劑降低乳酸菌凍干的損傷

國(guó)內(nèi)外學(xué)者多年的研究發(fā)現(xiàn)，有很多因素會(huì)對(duì)乳酸菌凍干存活率產(chǎn)生影響，包括細(xì)胞生理狀態(tài)、細(xì)胞大小、菌液濃度、pH值以及冷凍保護(hù)劑等，其中保護(hù)劑對(duì)菌體的保護(hù)效果較為突出。保護(hù)劑可以增強(qiáng)菌體凍干過(guò)程中各生理機(jī)能的穩(wěn)定性，優(yōu)良的凍干保護(hù)劑可以改善菌體凍干時(shí)的環(huán)境，能較好地緩解菌體在冷凍干燥過(guò)程中受到的各種損傷。最大限度地保留菌體原有的各種生理生化特性和生物活性[50-54]。如曾小群等[55]通過(guò)使用脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑，制備出了凍干存活率達(dá)98.74%的高活性L(fǎng)actobacillus casei發(fā)酵劑。

2.3.1 保護(hù)劑種類(lèi)

為使人臉人耳的特征向量在多模身份識(shí)別中具有相同表現(xiàn)力，在特征向量融合之前，要將經(jīng)過(guò)特征提取后的訓(xùn)練樣本矩陣和測(cè)試樣本向量分別進(jìn)行歸一化處理，用向量來(lái)代表人臉訓(xùn)練樣本中第i個(gè)類(lèi)別的第j個(gè)向量，對(duì)歸一化處理：，其中μf為Df中所有列向量的均值向量，σf為Df中所有列向量的方差向量。同理，用相同處理方法對(duì)經(jīng)過(guò)核映射后的人耳訓(xùn)練矩陣進(jìn)行歸一化處理。對(duì)特征提取后的測(cè)試向量進(jìn)行歸一化處理：zf=(zf-μf)/σf，ze=(ze-μe)/σe。

凍干保護(hù)劑分類(lèi)的方法有很多，按其滲透性可以分為3 類(lèi)，即滲透性保護(hù)劑、半滲透性保護(hù)劑及非滲透性保護(hù)劑[56]。如圖2所示，滲透性保護(hù)劑指可以很容易的透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用的物質(zhì)，如甘油就是一種典型的滲透性保護(hù)劑，它可以提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而抑制細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體的保護(hù)[57]；半滲透性保護(hù)劑指能穿過(guò)細(xì)胞壁而不能穿過(guò)細(xì)胞膜發(fā)揮作用的物質(zhì)，其能誘導(dǎo)菌體質(zhì)壁分離，抑制冰晶的形成，包括單糖、蔗糖、氨基酸等[58]；非滲透性保護(hù)劑指被排除在細(xì)胞外部，在細(xì)胞外側(cè)為菌體提供保護(hù)的物質(zhì)，包括多糖、海藻糖、脫脂乳等大分子，這類(lèi)保護(hù)劑通過(guò)在細(xì)胞壁外側(cè)形成保護(hù)層實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體的保護(hù)，從而減輕細(xì)胞的損傷[57-58]。

圖2 不同滲透性保護(hù)劑的作用原理Fig.2 Action mechanisms of cryoprotectants with of different permeability

按凍干保護(hù)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為有機(jī)保護(hù)劑和無(wú)機(jī)保護(hù)劑，如表1所示，由于有機(jī)保護(hù)劑所特有的結(jié)構(gòu)與乳酸菌的有效抗冷凍密不可分，而無(wú)機(jī)保護(hù)劑僅表現(xiàn)為無(wú)機(jī)鹽，故在乳酸菌發(fā)酵劑生產(chǎn)過(guò)程中廣泛應(yīng)用有機(jī)保護(hù)劑提升凍干存活率[59]。

表1 常見(jiàn)凍干保護(hù)劑及其作用機(jī)理Table 1 Common lyophilized protective agents and their action mechanisms

2.3.2 復(fù)配保護(hù)劑的保護(hù)作用

不同的組織、細(xì)胞對(duì)冷凍處理有不同的響應(yīng)。由于不同保護(hù)劑的作用機(jī)理存在很大差別，并且在多數(shù)情況下，單一的保護(hù)劑只能發(fā)揮單一的效果，不能為組織、細(xì)胞提供最佳的保護(hù)效果[66]。因此，復(fù)配多種保護(hù)劑以達(dá)到最佳保護(hù)效果是重要的優(yōu)化途徑。

國(guó)內(nèi)外研究表明，通過(guò)正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法，將不同種保護(hù)劑以一定比例進(jìn)行復(fù)配對(duì)菌體的保護(hù)效果更好，顯著提高了活菌數(shù)和發(fā)酵活力。辛明等[67]采用響應(yīng)面法對(duì)植物乳桿菌L5、L12凍干保護(hù)劑中的脫脂奶、海藻糖、硫酸錳的最佳配比進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，當(dāng)凍干保護(hù)劑的配比為脫脂奶30.98 g/100 mL、海藻糖22.15 g/100 mL、硫酸錳0.19 g/100 mL時(shí)，植物乳桿菌L5發(fā)酵劑的生長(zhǎng)速度更快，產(chǎn)酸能力更強(qiáng)，且凍干存活率達(dá)82.55%；而植物乳桿菌L12的最佳凍干保護(hù)劑配方為15.98 g/100 mL脫脂乳、10.85 g/100 mL海藻糖、0.05 g/100 mL硫酸錳，凍干存活率達(dá)到了83.66%[67]。Stefanello等[68]研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖、蔗糖和脫脂牛奶的組合為乳桿菌IAL454提供了最有效的保護(hù)，使其凍干存活率保持在83%～85%之間。綜上所述，不同的保護(hù)劑配方對(duì)凍干乳酸菌的存活率有很大的影響。

但截至目前，由于菌種的特異性以及不同保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)理不同，仍沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一種有效適合所有乳酸菌的凍干保護(hù)劑配方。如表2所示，為了最大限度地提高乳酸菌真空冷凍干燥的存活率，研究者們針對(duì)不同種類(lèi)的乳酸菌篩選出了不同的保護(hù)劑組合。其中，5%蔗糖、2%甘油、0.8%谷氨酸鈉、1%抗壞血酸、5%海藻糖為嗜熱鏈球菌MN002的最優(yōu)保護(hù)劑配方；而10%脫脂乳、7%海藻糖、2%山梨醇和0.6%酪氨酸為復(fù)合凍干保護(hù)劑時(shí)，冷凍干燥植物乳桿菌L2的存活率高達(dá)92%。雙歧乳桿菌的最佳保護(hù)條件為甘氨酸5.5%、碳酸氫鈉0.8%、低聚木糖7%、精氨酸4.5%、脫脂乳25%時(shí)，可使其凍干存活率達(dá)到90.37%。因此，對(duì)于不同的種類(lèi)要篩選不同的保護(hù)劑配方。

表2 不同乳酸菌對(duì)應(yīng)的凍干保護(hù)劑Table 2 Cryoprotectants for freeze drying of different lactic acid bacteria

2.4 優(yōu)化真空冷凍干燥工藝條件降低乳酸菌的凍干損傷

為獲得更高的菌體存活率，需要嚴(yán)格控制真空冷凍干燥工藝。目前有研究表明菌體在凍干過(guò)程中的活性損失大部分發(fā)生在預(yù)凍階段。預(yù)凍處理是將物料中的游離水凍結(jié)，為之后的干燥處理做準(zhǔn)備，預(yù)凍處理主要影響菌體產(chǎn)生的冰晶大小。故合適的預(yù)凍溫度和冷卻速率也是真空冷凍干燥工藝的重要環(huán)節(jié)。若冷卻速率過(guò)快，會(huì)產(chǎn)生大的冰晶，同時(shí)延長(zhǎng)細(xì)胞的脫水過(guò)程，會(huì)對(duì)菌體造成極大的傷害，但快速冷卻可以避免溶質(zhì)效應(yīng)和細(xì)胞過(guò)度收縮[75]。同時(shí)凍干厚度、菌泥與保護(hù)劑的比例也對(duì)冷凍干燥質(zhì)量產(chǎn)生影響。

如果冷凍溫度不夠，則會(huì)使菌液凍結(jié)得不夠徹底，造成菌液在升華干燥時(shí)發(fā)生膨脹、起泡現(xiàn)象，從而影響菌粉的品質(zhì)；但若預(yù)凍溫度太低，不但會(huì)造成菌液的浪費(fèi)，而且還會(huì)加劇對(duì)菌體的傷害，影響其凍干存活率。因此，合適的預(yù)凍溫度對(duì)乳酸菌的凍干至關(guān)重要。不同類(lèi)型的乳酸菌，其最適預(yù)冷凍溫度差別很大。如表3所示，針對(duì)不同種類(lèi)的乳酸菌，研究人員篩選了不同的預(yù)冷凍溫度，鼠李糖乳桿菌LR-1的最佳預(yù)冷凍溫度為－20 ℃[73]，植物乳桿菌LP-7501S的最佳預(yù)冷凍溫度為－80 ℃[50]，而植物乳桿菌SC1的最佳預(yù)冷凍溫度為－70 ℃[76]；同屬的乳酸菌處在不同條件下，最佳的預(yù)冷凍溫度也會(huì)有所差異。Wang Guangqiang等[77]的研究表明，當(dāng)使用山梨醇作為保護(hù)劑時(shí)，植物乳桿菌AR113、AR307、WCFS1的最佳預(yù)冷凍溫度分別為－196、－40 ℃和－20 ℃，而當(dāng)使用海藻糖為保護(hù)劑時(shí)，它們?nèi)叩淖罴杨A(yù)冷凍溫度為－20、－60 ℃和－60 ℃。因此，最佳預(yù)凍溫度的選擇是乳酸菌凍干過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。

表3 不同乳酸菌對(duì)應(yīng)的預(yù)冷凍溫度Table 3 Pre-freezing temperatures for freeze drying of different lactic acid bacteria

2.4.2 冷卻速率對(duì)乳酸菌凍干存活率的影響

在預(yù)凍過(guò)程中，冷卻速率是乳酸菌活力的關(guān)鍵因素。如圖3所示，在預(yù)冷凍階段，合適的冷卻速率可以減輕細(xì)胞在凍干過(guò)程中受到的損傷[54]。a表示冷卻速率過(guò)慢，細(xì)胞由于過(guò)度脫水收縮，容易發(fā)生“溶質(zhì)損傷”，過(guò)度收縮，可導(dǎo)致蛋白失去活性，從而使細(xì)胞失去活性而死亡；c表示冷卻速率過(guò)快，易導(dǎo)致胞內(nèi)和胞外的水分子結(jié)成冰晶，進(jìn)而穿透細(xì)胞，給菌體帶來(lái)嚴(yán)重的物理傷害；b表示最適的冷卻速率，在此條件下，細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)過(guò)度脫水收縮和胞內(nèi)結(jié)冰，能夠最大程度降低細(xì)胞受到的損傷。不同種的乳酸菌有其不同的最適冷卻速率，在冷卻速率為－1 ℃/min時(shí)植物乳桿菌ST-3的凍干存活率最高，而在－10 ℃/min條件下，干酪乳桿菌LC2W可以得到最高的凍干存活率[53]。目前，冷卻速率在乳酸菌真空冷凍干燥過(guò)程中對(duì)其凍干存活率影響的研究比較匱乏，因此，研究乳酸菌的最適冷卻速率至關(guān)重要。

圖3 不同冷卻速率對(duì)乳酸菌存活的影響Fig.3 Effect of cooling rate on the survival of lactic acid bacteria

2.4.3 保護(hù)劑與菌泥的混合比例對(duì)乳酸菌凍干存活率的影響

凍干保護(hù)劑與菌泥的配比也會(huì)影響乳酸菌的凍干活性。保護(hù)劑濃度過(guò)低，不能充分保護(hù)乳酸菌在真空冷凍干燥過(guò)程中的活性；保護(hù)劑濃度過(guò)高，細(xì)胞凍干存活率也會(huì)下降，究其原因可能是保護(hù)劑濃度過(guò)高時(shí)阻礙了水分的揮發(fā)，導(dǎo)致冰晶的生成，從而提升了細(xì)胞的死亡率[79]。如許女等[80]的研究表明，以甘油0.5%、山梨醇2%、麥芽糊精1%、脫脂奶粉10%、海藻糖1.5%為凍干保護(hù)劑配方，保護(hù)劑與菌泥的混和比例為1∶3時(shí)，植物乳桿菌MA2的凍干存活率為61%。因此，選擇合適的混合比例非常重要。

2.4.4 凍干厚度對(duì)乳酸菌凍干存活率的影響

在凍干過(guò)程中，凍干厚度也是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。凍干厚度會(huì)對(duì)后續(xù)凍干時(shí)間以及最后凍干產(chǎn)品的性狀產(chǎn)生影響，研究表明，如果樣品太薄，不僅極易融化，而且在真空冷凍干燥后，樣品的凍干存活率較低，復(fù)水率也相對(duì)較低；反之，增加樣品厚度則不易融化，降低了對(duì)菌體的傷害；但是，過(guò)厚的樣本，會(huì)延長(zhǎng)凍干所需的時(shí)間[81]。張雅碩等[79]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 cm是副干酪乳桿菌的最佳凍干厚度。植物乳桿菌299的最佳凍干厚度為1.2 cm[82]。因此，選擇最優(yōu)的凍干厚度有利于乳酸菌的凍干保護(hù)。

3 優(yōu)化貯藏條件以降低乳酸菌活菌數(shù)的損失

3.1 貯藏溫度

貯藏溫度對(duì)保持益生菌的活性至關(guān)重要，過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致氧化反應(yīng)或膜脂質(zhì)相轉(zhuǎn)變，這對(duì)益生菌的存活不利[83]；而低溫環(huán)境保存能使凍干菌體的活力得到很好的保護(hù)[84]。如馬雁等[85]研究表明，－20 ℃是乳桿菌grxo7可以長(zhǎng)時(shí)間貯藏的最適溫度，在該溫度下，菌粉的存活率、β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶等活力得到了較好維持。楊一兵[86]、姚國(guó)強(qiáng)[87]等研究表明，4 ℃有利于短期貯藏菌粉，而對(duì)于長(zhǎng)期貯藏，－20 ℃的貯藏效果更好。Shu Guowei等[88]研究發(fā)現(xiàn)，低溫可以有效保持菌粉活性，而常溫狀態(tài)下貯藏的菌粉，由于細(xì)胞內(nèi)水分比較活躍，故容易導(dǎo)致細(xì)胞喪失活力。因此，凍干粉最好保存在低溫環(huán)境中，并且在使用時(shí)必須進(jìn)行低溫誘導(dǎo)，以免引起過(guò)敏現(xiàn)象。

3.2 氣體成分

眾多研究表明凍干粉貯藏環(huán)境中的氣體組成、含氧量等對(duì)凍干菌體的保存性能有很大的影響。如張曉寧等[89]的研究表明，當(dāng)凍干后的植物乳桿菌LIP-1在真空環(huán)境下貯藏，菌體的β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶、K＋-ATP酶活性都比氮、氧兩種貯藏環(huán)境下的酶活性高。因此，在低氧環(huán)境下貯藏凍干粉，可有效地增加微生物數(shù)量，并保持其良好的活性。

3.3 水分含量

含水量對(duì)乳酸菌貯藏期間的存活具有顯著影響。乳酸菌的酶活性、物理反應(yīng)速率等都對(duì)水分活度有所依賴(lài)。如王淑敏等[90]研究表明，乳雙岐桿菌A04菌粉水分活度在0.03～0.1之間時(shí)，其貯藏效果最好。Jiménez等[91]將副干酪LBC81用膠囊包裹起來(lái)，在25、35 ℃和45 ℃，水分活度為0.103～0.846條件下貯存7 周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌粉的菌體存活率在水活度為0.536時(shí)下降得很快。任琳等[92]研究發(fā)現(xiàn)，具有不同水分含量的凍干樣品中，植物乳桿菌在凍干過(guò)程中的存活率無(wú)明顯變化，而隨水分含量的減少，樣品復(fù)水后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的時(shí)間變長(zhǎng)，其恢復(fù)能力變?nèi)酢Ｒ虼耍挥斜３州^低且穩(wěn)定的含水量和水分活度，才能保證乳酸菌凍干粉的貯藏穩(wěn)定性。

3.4 包裝形式

包裝指使用一種或多種封裝材料，在微生物與周?chē)h(huán)境之間形成物理屏障，從而保護(hù)微生物[93]。一般凍干菌粉的貯藏時(shí)間受陽(yáng)光、濕度、氧氣、pH值、滲透變化等因素的影響，為保存凍干產(chǎn)品常采用阻氧、阻光的包裝材料以排除這些因素的影響[94]。此外，還需考慮凍干產(chǎn)品和包裝材料之間的交互作用。如桑躍等[95]發(fā)現(xiàn)充氮包裝的乳桿菌A6菌粉和BBMN68菌粉與普通包裝的菌粉相比，其存活率分別提升了4.2 倍和7.2 倍。張敏等[96]研究發(fā)現(xiàn)，采用不同包裝材料的植物乳桿菌LN66在4 ℃環(huán)境下貯藏1 個(gè)月，真空鋁箔袋、棕色玻璃瓶包裝的菌粉存活率均高于普通鋁箔紙包裝的菌粉，并分別上升2.8%和2.10%。

目前，真空冷凍干燥制品的包裝材料使用最多的是玻璃、塑料、橡膠和一些金屬材料，但玻璃具有易碎性、質(zhì)量大等缺點(diǎn)；塑料的阻氧性等客觀因素使其推廣受限[96]。因此，將不同材料復(fù)合應(yīng)用可以彌補(bǔ)缺陷，多層復(fù)合薄膜外層是可印刷的雙向拉伸聚丙烯薄膜、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯，內(nèi)部是封熱性能高的流延聚丙烯薄膜、聚乙烯材料等，中間還可采用鋁箔、乙烯-乙烯醇共聚物等材料提高阻隔能力。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，真空冷凍干燥技術(shù)已經(jīng)成為醫(yī)藥、食品工業(yè)中的一種非常重要的技術(shù)。利用真空冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)出高活菌數(shù)且能長(zhǎng)期保持活性的乳酸菌菌粉是醫(yī)藥及食品發(fā)酵工業(yè)的重要研究目標(biāo)。本文分析了乳酸菌細(xì)胞在真空冷凍干燥過(guò)程中的損傷及保護(hù)機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其生長(zhǎng)培養(yǎng)基、脅迫預(yù)處理、凍干保護(hù)劑、工藝條件、封裝材料等方面對(duì)乳酸菌凍干存活率和貯藏時(shí)間的影響因素進(jìn)行了總結(jié)，對(duì)乳酸菌發(fā)酵劑的凍干保藏技術(shù)在保護(hù)性條件選擇方面有一定的參考作用。保護(hù)性條件不僅能夠提高乳酸菌在凍干過(guò)程中的存活率，同時(shí)也對(duì)貯藏過(guò)程中乳酸菌的活力與穩(wěn)定性有一定積極的影響。目前研究者們?cè)谔岣呷樗峋锬ず铣膳c抗凍性、篩選最佳保護(hù)劑組合、貯藏保護(hù)性條件等方面開(kāi)展了大量研究，但仍有不足。首先，有關(guān)具有普適性保護(hù)效果凍干保護(hù)劑的配方研究較少；其次，研究表明，乳酸菌凍干粉在低溫、避光及真空環(huán)境下能基本實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期貯藏，開(kāi)發(fā)新型復(fù)合封裝材料能更好地維持其貯藏穩(wěn)定性；最后，應(yīng)加強(qiáng)促進(jìn)開(kāi)發(fā)乳酸菌生長(zhǎng)發(fā)育的新型益生元類(lèi)保護(hù)劑，減少在凍干過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)元素的損失，進(jìn)而提高乳酸菌凍干存活率、延長(zhǎng)貯藏期。