基于金納米花的雙信號適配體傳感器檢測紅酒中真菌毒素

祁興普，董騏瑋，朱麟菲，鄒婷婷，鄭 義，張婧怡，李 倩,*

（1.江蘇農牧科技職業學院食品科技學院，江蘇 泰州 225300；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

隨著生活質量的提高，食品安全越來越受到人們的關注，尤其是真菌毒素污染問題。真菌毒素是絲狀真菌產生的一組有毒次生代謝產物，由于真菌毒素的熱穩定性和化學穩定性極強，高溫烹飪、工業加工都不會造成其結構性質的破壞或分解，因此食物中可能存在真菌毒素，對動物或人健康有很大危害[1]。赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）主要由赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、碳黑曲霉（A.carbonarius）、純綠青霉（Penicillium viridicatum）產生。由于其具有免疫毒性、腎毒性和潛在“三致”作用，國際癌癥研究中心將OTA列為2B類致癌物質[2-3]。玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）主要由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）產生，是具有類雌激素樣性質的非甾體毒素。由于其具有生殖系統、神經系統毒性及潛在致癌性，被國際癌癥研究中心歸為第3類致癌物[4-6]。OTA和ZEN是廣泛存在于食品中的真菌毒素，會對人體的肝臟、腎臟和免疫系統產生不良影響。因此，建立一種可同時檢測OTA及ZEN的方法具有重要意義，而且與單一毒素檢測法相比，可以提供更為準確的食品安全監測信息，同時在縮短周轉時間、提高篩選效率、降低檢測成本和樣本量等方面有明顯的優勢[7-9]。迄今為止，酶聯免疫分析法[10-11]、電化學法[12-14]、表面增強拉曼散射法[15]和化學發光法[16]等方法已被報道用于真菌毒素的測定，均具有優越的性能。然而，這些方法大多只能對單一真菌毒素進行檢測，不能對多種真菌毒素進行檢測，這限制了它們在實際中的應用。多種真菌毒素檢測所用色譜方法包括高效液相色譜和液相色譜-質譜聯用[17-19]。然而，這些色譜方法的儀器昂貴，對專業人員訓練素養要求高，程序繁瑣，這限制了它們在實際生活中的應用。

熒光分析法是通過研究熒光探針的熒光強度與目標物濃度之間的線性關系來對目標物實現定量檢測的一種分析方法，具有操作簡便、靈敏度高、分析速度快等優點[20]。其中，熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是該方法的檢測原理，具有能量供體和能量受體兩個重要的組成部分。當供體與受體的距離在10 nm以內時，供體激發態的能量轉移給受體的非輻射過程即為共振能量轉移[21-22]。金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）具有很強的吸附能力和優異的生物相容性，被廣泛用作負載材料。AuNPs作為常用的等離子體材料，具有獨特的光學、熱學和電子特性、良好的生物相容性、優異的化學穩定性，較強的信號產生和轉導能力，使基于AuNPs的納米探針在開發先進的傳感器、實現更靈敏的診斷方面發揮著重要作用[23]。在熒光傳感器構建過程中，AuNPs主要發揮固定生物分子猝滅熒光和放大信號等作用，由于其寬吸收光譜能和大多供體發射圖譜發生重疊，常常在FRET體系中扮演重要角色[24]。適配體的特異性和親和性較高，正越來越多地被用于食品安全和其他生物檢測，例如天然毒素、環境污染物、代謝產物等，適配體具有良好的熱穩定性和結構轉換特性，基于適配體構建熒光傳感器具有操作簡單、靈敏度高、特異性強等優點，在真菌毒素檢測領域得到廣泛關注[25-27]。基于適配體和熒光分析開發一種靈敏、準確、快速的OTA和ZEN同時檢測方法對食品安全監測具有重要意義。

本研究利用具有分支狀納米花瓣結構的金納米花（gold nanoflower，AuFL）為載體，以特異性識別的核酸適配體為分子識別元件，基于新穎的AuFL、核酸適配體和修飾有熒光染料的DNA制備一種新型功能納米探針。結合熒光技術，利用功能納米探針上兩種熒光染料供體和AuFL受體之間的FRET和靶標誘導的熒光恢復，構建一種簡單、新穎的雙信號熒光適配體傳感器用于同時檢測OTA和ZEN。紅酒中的真菌毒素是研究熱點，本研究采用紅酒作為樣品，驗證基于AuFL的雙信號適配體傳感器檢測技術檢驗效果，以期為利用功能探針進行多種毒素檢測提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長城紅酒 蘇果超市（中國）；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）、巰基聚乙二醇和雙(對-磺酸苯基)苯基膦（bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphine dihydrate dipotassium salt，BSPP）美國Sigma-Aldrich公司；檸檬酸三鈉、鹽酸多巴胺、氯金酸（HAuCl4）國藥控股化學試劑有限公司；所有寡核苷酸DNA包括R1（5’-SHATCGTGGAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA）、R2（5’-TCATCTATCTATGGTACAT TAC TAT CTG TAA TGT GAT ATGCACGAT-SH-3’）、F1（5’-FAM-CGC CAC CCA CAC CCG ATC-3’）、F2（5’-CAT ATC ACA TTA CAG ATA-Cy3-3’）以及pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（含136.7 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、8.72 mmol/L Na2HPO4和1.41 mmol/L KH2PO4）生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

JEM-2010透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）、JSM-7001F掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本電子株式會社；UV-2450紫外-可見光譜儀 日本島津公司；FluoroMax-4熒光光譜儀 美國HORIBA公司。

1.3 方法

1.3.1 AuNPs的制備

首先，通過檸檬酸三鈉還原法制備AuNPs種子：將檸檬酸三鈉溶液（38.8 mmol/L，5 mL）快速加入攪拌中且沸騰的氯金酸溶液（1 mmol/L，50 mL）。混合溶液顏色在2 min內依次從透明變為黑色、紫色和深紅色。溶液繼續攪拌并保持沸騰15 min，待自然冷卻至室溫后，4 ℃冰箱中貯存備用。然后，通過種子生長法制備粒徑為50 nm的AuNPs：將25 mL超純水，1 mL新鮮制備的AuNPs種子和400 μL 0.2 mol/L的NH2OH·HCl溶液依次加入50 mL燒杯中。室溫下將4 mL質量分數為0.2%氯金酸逐滴加入上述混合溶液中劇烈攪拌30 min，所制得的AuNPs于4 ℃冰箱中貯存備用。

1.3.2 AuFL的制備

將1 mL的AuNPs離心后重新分散在pH 8.5的10 mmol/L Tris緩沖液中，加入5 μL 0.5 mg/mL鹽酸多巴胺溶液，并在25 ℃下渦旋振蕩4 h。最后，將該混合物在6 000 r/min下離心5 min，制得的聚多巴胺（polydopamine，PDA）包覆的AuNPs（PDA/AuNPs）重新分散在1 mL超純水中。1 mL新鮮制備的PDA/AuNPs溶液、150 μL 5 mmol/L HAuCl4溶液、100 μL 5 g/100 mL PVP溶液和150 μL 50 mmol/L羥胺溶液混合均勻，25 ℃劇烈攪拌5 min。6 000 r/min離心5 min，并用超純水洗滌數次后，將制得的AuFL分散在1 mL超純水中并在4 ℃貯存備用。

1.3.3 DNA功能化納米探針的制備

首先，將1 mg的BSPP加入1 mL AuFL（0.1 nmol/L）溶液中，并在室溫下孵育過夜。6 000 r/min離心5 min并用超純水洗滌數次后，將得到的1 mL BSPP修飾的AuFL（0.1 nmol/L）與5 μL R1（100 μmol/L）和5 μL R2（100 μmol/L）一起混合，并在室溫下振蕩24 h。然后，加入5 μL 0.2 mmol/L巰基聚乙二醇，在室溫下反應60 min來阻斷粒子的非特異性結合位點。6 000 r/min離心水洗后，重新分散在1 mL PBS（pH 7.4）中，加入5 μL F1（100 μmol/L）和5 μL F2（100 μmol/L），并在37 ℃孵育6 h。最后，通過6 000 r/min離心洗去未鍵合的DNA，制得DNA功能化納米探針，將其重新分散在1 mL PBS（pH 7.4）中，并在4 ℃冰箱中貯存備用。

1.3.4 熒光傳感器對OTA和ZEN檢測

200 μL DNA功能化的納米探針溶液和不同質量濃度OTA和ZEN溶液混合，振蕩孵育60 min，轉移至熒光吸收池，熒光分光光度計掃描得到熒光圖譜，測定其熒光強度。對于OTA的檢測，設置激發波長為495 nm，檢測518 nm波長處的熒光強度。對于ZEN的檢測，設置激發波長為550 nm，檢測570 nm波長處的熒光強度。

1.3.5 實際樣品檢測

首先，將1 mL紅酒用pH 7.4的PBS稀釋50 倍。然后，將不同質量濃度的已知OTA和ZEN加入預處理樣品中。最后，按照構建的熒光傳感器檢測方法，對加入已知質量濃度的OTA和ZEN紅酒樣品進行定量檢測。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 OTA和ZEN同時檢測的原理

基于雙熒光信號對OTA和ZEN同時檢測的原理如圖1所示。R1和R2為修飾有巰基的單鏈DNA，且部分序列可互補雜交（黑色部分），不互補的部分分別含特異性識別OTA（綠色部分）和ZEN（紅色部分）的適配體。F1和F2為與OTA適配體和ZEN適配體互補的單鏈DNA，且分別修飾熒光染料FAM和Cy3，作為FRET過程的兩個不同的能量供體。首先，制備了AuFL作為能量受體，通過Au-S鍵將R1和R2組裝在AuFL表面；然后，加入互補鏈F1和F2進行堿基互補配對，將F1和F2組裝到AuFL表面形成DNA功能化納米探針。適配體和互補鏈之間的雜交反應使兩種熒光染料（FAM和Cy3）和AuFL之間距離足夠接近，引起供體向受體的能量轉移。因此，由于FRET的發生，導致FAM和Cy3熒光的猝滅，納米探針溶液自身無熒光。當加入OTA后，OTA和R1上的適配體特異性結合，R1-F1雙鏈發生解離，導致修飾有FAM的F1從探針上脫落和FRET過程的中斷，518 nm波長處FAM的熒光得到恢復。當加入ZEN后，ZEN和R2上的適配體特異性結合，R2-F2雙鏈發生解離，導致修飾有Cy3的F2從探針上脫落和FRET過程的中斷，570 nm波長處Cy3的熒光得到恢復。因此，通過利用兩個供體和單個受體的雙信號FRET和靶標誘導的熒光恢復，可以實現基于熒光“關-開”的方式同時檢測OTA和ZEN。

圖1 雙信號熒光適體傳感器檢測OTA和ZEN的原理圖Fig.1 Schematic illustration of dual-signal fluorescent aptasensor for the detection of OTA and ZEN

2.2 納米探針的表征

如圖2所示，首先，通過種子生長方法制備了平均粒徑為50 nm的AuNPs，其在530 nm波長處具有最大吸收峰，形狀為明顯的球形結構，且具有良好的單分散性和均勻的尺寸。然后，在AuNPs溶液中加入鹽酸多巴胺和氯金酸制備得到AuFL，通過TEM和SEM對其形貌進行了表征。如圖3A、B所示，AuFL相比于AuNPs表現出明顯的形態變化，具有高度分枝的花瓣結構，且同樣顯示出良好的單分散性和均勻的尺寸。最后，通過在AuFL表面修飾4 條DNA（R1、R2、F1、F2）得到DNA功能化納米探針。如圖3C紫外光譜所示，AuFL在595 nm波長處有一個特征吸收峰，而DNA功能化納米探針顯示出兩個特征吸收峰：一個位于260 nm波長處，對應偶聯DNA的吸收峰；另一個位于595 nm波長處，對應AuFL的吸收峰。通過測定FAM和Cy3的熒光發射峰，驗證了兩者和AuFL發生FRET的可行性，如圖3C所示，AuFL在350～700 nm范圍內有較寬的紫外吸收峰。FAM的發射峰位于518 nm波長處，Cy3的熒光發射峰位于570 nm波長處，均與AuFL較寬的紫外吸收峰發生一定程度重疊，表明AuFL可以有效地猝滅FAM和Cy3的熒光。另外，DNA雜交反應使兩種熒光染料和AuFL之間距離足夠接近，引起供體向受體的能量轉移。如圖3D所示，納米探針負電荷比AuFL更多，這表明帶負電荷的DNA在AuFL上成功組裝。為了測得AuFL上DNA的結合量，通過100 ℃高溫加熱解開DNA雙螺旋結構，并根據上清液中DNA的熒光強度，計算得到單個AuFL上F1和F2的量分別為335 條和355 條。以上實驗證明了DNA功能化納米探針的成功制備。

圖2 AuNPs的可見光圖譜（A）和TEM圖像（B）Fig.2 Visible absorption spectrum (A) and TEM image (B) of AuNPs

圖3 AuFL和納米探針的表征Fig.3 Characterization of AuFL and nanoprobe

2.3 OTA和ZEN檢測的條件優化

基于納米探針溶液體積、檢測溶液pH值、檢測時間會影響適配體和OTA/ZEN的結合，因此本研究對檢測溶液體積、溶液pH值、檢測時間進行了優化。本實驗中使用的熒光吸收池最低檢測體積是200 μL，首先考察了不同納米探針溶液體積實現OTA和ZEN檢測的最低質量濃度，如表1所示。隨著探針溶液體積的升高，OTA和ZEN檢測的最低質量濃度逐漸升高，因此選取200 μL的探針溶液體積為最優探針體積。如圖4A、B所示，不同檢測溶液的pH值對FAM和Cy3的熒光恢復效果差異顯著（P＜0.05）。隨著緩沖溶液pH值的增大，FAM和Cy3的熒光恢復強度逐漸增大，在pH 7.4時達到最大值。當pH值繼續升高，熒光恢復強度開始明顯減弱。因此，選取7.4為檢測溶液的最佳pH值。圖5A、B為檢測時間對納米探針的熒光響應，檢測時間由0 min延長到60 min時，在518 nm波長處FAM的熒光強度以及570 nm波長處Cy3的熒光強度隨著檢測時間的延長均逐漸增大；檢測時間超過60 min后，熒光強度均趨于穩定，FAM和Cy3完全脫離納米探針。因此，選取60 min為最優檢測時間。

表1 傳感器探針溶液體積實現OTA和ZEN檢測的最低質量濃度Table 1 Determination of optimal volume of probe solution for minimum detection concentrations of OTA and ZEN

圖4 檢測溶液的pH值對含500 ng/mL OTA（A）和500 ng/mL ZEN（B）納米探針的熒光強度影響Fig.4 Effect of pH on fluorescence intensity of nanoprobes containing OTA (500 ng/mL) (A) and ZEN (500 ng/mL) (B)

圖5 檢測時間對含500 ng/mL OTA（A）和500 ng/mL ZEN（B）納米探針的熒光強度影響Fig.5 Effect of detection time on fluorescence intensity of nanoprobes containing OTA (500 ng/mL) (A) and ZEN (500 ng/mL) (B)

2.4 OTA和ZEN檢測的性能分析

在最優檢測溶液pH值、檢測時間條件下，構建了雙信號熒光適配體傳感器，考察不同質量濃度OTA和ZEN加入后，518 nm和570 nm波長處的熒光響應情況。如圖6所示，隨著OTA質量濃度的增大，檢測溶液位于518 nm波長處的FAM熒光逐漸恢復，這是由于高特異性的適配體和OTA結合導致FAM從納米探針釋放的結果。在0.05～500 ng/mL質量濃度范圍內，檢測溶液在518 nm波長處的熒光強度（FL518nm）與OTA質量濃度的對數之間呈現良好的線性關系。線性方程為FL518nm＝231.799＋97.857lgρOTA（OTA質量濃度單位為ng/mL），R2＝0.998，檢出限為0.017 ng/mL。如圖7所示，檢測溶液位于570 nm波長處的Cy3熒光強度隨著ZEN質量濃度的增加而連續增加，同樣是由于高特異性的適配體和ZEN結合導致Cy3從納米探針釋放的結果。0.1～500 ng/mL質量濃度范圍內，檢測溶液在570 nm波長處的熒光強度（FL570nm）與ZEN質量濃度的對數呈線性關系。線性方程為FL570nm＝241.821＋83.874lgρZEN（ZEN質量濃度單位為ng/mL），R2＝0.995，檢出限為0.033 ng/mL。因此，所構建的雙信號熒光傳感器可以實現對OTA和ZEN的定量檢測，且具有較高的靈敏度和優異的性能（表2）。

表2 本研究傳感器與其他真菌毒素檢測方法的比較Table 2 Comparison of analytical figures of merit of the sensor with those of other mycotoxin detection methods

圖6 加入不同質量濃度OTA的傳感器熒光圖譜（A）以及熒光強度與OTA質量濃度的關系（B）Fig.6 Fluorescence spectra of the sensor with different concentrations of OTA (A) and relationship between fluorescence intensity and OTA concentration (B)

圖7 加入不同質量濃度ZEN的傳感器熒光圖譜（A）以及熒光強度與ZEN質量濃度的關系（B）Fig.7 Fluorescence spectra of the sensor with different concentrations of ZEN (A) and relationship between fluorescence intensity and ZEN concentration (B)

2.5 選擇性實驗

在實際樣品檢測中傳感器的選擇性至關重要。為了評估雙信號熒光適配體傳感器的選擇性，選用了3 種潛在的干擾物質——伏馬毒素B1（fumonisin B1，FB1）、黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB）進行實驗。5 μg/mL上述干擾物、100 ng/mL OTA、100 ng/mL ZEN分別加入檢測溶液并進行測定。如圖8所示，相比于加入OTA和ZEN后檢測溶液熒光恢復顯著，加入其他干擾物質檢測溶液基本沒有熒光變化，這證明該雙信號熒光適配體傳感器具有良好的選擇性和抗干擾能力。

圖8 雙信號熒光適體傳感器的選擇性Fig.8 Selectivity of the dual-signal fluorescent aptasensor

2.6 實際樣品檢測

所制得的雙信號熒光適配體傳感器通過采用標準加入法，檢測了處理過的紅酒中的OTA和ZEN。實際樣品檢測結果如表3所示，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）和回收率（OTA為95.0%～97.4%，ZEN為92.0%～94.0%）符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》[33]要求。結果證明了該雙信號熒光適配體傳感器檢測的準確性，可用于實際樣品中OTA和ZEN的檢測。

表3 紅酒樣品中OTA和ZEN的檢測結果（n＝3）Table 3 Recoveries and precision of OTA and ZEN in spiked red wine samples (n =3)

3 結論

本實驗基于AuFL供體和兩種熒光染料受體之間的FRET機理，構建了一種雙信號熒光適配體傳感器用于OTA和ZEN的檢測。該傳感器對OTA和ZEN檢測具有高靈敏度、選擇性和準確性，可通過顯著的熒光變化進行定量分析。在最優條件下，對OTA的檢測范圍為0.05～500 ng/mL，檢出限為0.017 ng/mL。對ZEN的檢測范圍為0.1～500 ng/mL，檢出限為0.033 ng/mL。此外，該傳感器還成功地應用于紅酒樣品中OTA和ZEN的同時檢測。OTA回收率為95.0%～97.4%，ZEN回收率為92.0%～94.0%，相對標準偏差小于5.2%。這種基于雙熒光信號響應構建的適配體傳感器在真菌毒素的同時檢測方面具有巨大潛力。