蛋白質磷酸化和亞硝基化互作對宰后羊肉嫩度的影響

杜曼婷，高夢麗，游紫燕，李 可，白艷紅,*

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001；3.食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001）

肉嫩度是重要的肉品質之一，也是吸引消費者購買的主要因素[1-2]。影響宰后肉嫩度的因素最主要的是肌原纖維蛋白和細胞骨架蛋白的降解[3-4]。鈣蛋白酶系統主要包括μ-鈣蛋白酶、m-鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白，其中，μ-鈣蛋白酶參與宰后肌肉肌原纖維蛋白和細胞骨架蛋白的降解[5-6]，對宰后肌肉的嫩化具有重要作用。在宰后復雜的生理生化變化過程中，蛋白質翻譯后修飾如磷酸化和亞硝基化會作用于μ-鈣蛋白酶或肌原纖維蛋白，使其結構和功能發生變化，進而影響μ-鈣蛋白酶的降解活性或肌原纖維蛋白對蛋白酶降解作用的敏感性，導致肌原纖維蛋白和細胞骨架蛋白的降解程度發生改變，最終影響宰后肉的嫩度。

研究表明，低嫩度組羊肉肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平高于高嫩度組，肌原纖維蛋白的磷酸化差異大多數與肌肉收縮相關；磷酸化會降低μ-鈣蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解，引起肌肉收縮，降低肉嫩度[7-10]。本團隊前期研究了肌漿蛋白磷酸化對μ-鈣蛋白酶活性的影響，發現μ-鈣蛋白酶的磷酸化負向調控其活性，進一步研究了磷酸化對純μ-鈣蛋白酶的活性調控機制，發現磷酸化和去磷酸化均正向調控μ-鈣蛋白酶活性，過高的溫度和鈣離子濃度會削弱磷酸化對μ-鈣蛋白酶的作用[11-12]。Hou Qin等[13]發現S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）處理會提高蛋白質的亞硝基化水平而一氧化氮合成酶抑制劑卻會降低蛋白質的亞硝基化水平，并且蛋白質的亞硝基化會降低μ-鈣蛋白酶的自溶、肌原纖維蛋白和肌間線蛋白的降解、提高剪切力，而去亞硝基化處理后結果相反，表明蛋白質亞硝基化通過抑制μ-鈣蛋白酶自溶和肌原纖維蛋白降解降低肉嫩度。張朝陽[14]也得到類似的研究結果。劉瑞[15]在離體條件下對肌原纖維蛋白進行不同程度的亞硝基化修飾，研究其對μ-鈣蛋白酶蛋白水解的敏感性，結果發現，肌原纖維蛋白的亞硝基化修飾使其對μ-鈣蛋白酶的敏感性發生改變，抑制了肌鈣蛋白-T的降解，但促進肌間線蛋白的降解。

以上相關研究表明，蛋白質磷酸化和蛋白質亞硝基化均會對宰后肉嫩度產生影響。在宰后肌肉成熟的過程中，肌細胞會發生一系列復雜的生化變化，蛋白質磷酸化和蛋白質亞硝基化往往會伴隨這些變化同時發生，或通過交互作用共同調控宰后肉嫩度。目前的研究主要集中在蛋白質磷酸化、蛋白質亞硝基化等單一翻譯后修飾對宰后肉品質的影響，而對蛋白質磷酸化和蛋白質亞硝基化如何交互調控共同作用于宰后肉品質的相關研究鮮有報道。因此，本研究采用不同處理方式使宰后羊背最長肌獲得不同程度的磷酸化和亞硝基化修飾水平，通過探究不同水平磷酸化和亞硝基化處理對宰后羊背最長肌pH值、肌原纖維小片化指數（myofibrillar fragmentation index，MFI）、肌原纖維蛋白降解程度的影響，明確蛋白質磷酸化和亞硝基化對宰后羊肉嫩度的交互影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用3 只10 月齡的小尾寒公羊購自河南鄭州滎陽某屠宰場，飼養條件、生理成熟度等條件一致，胴體質量約為25 kg。在宰后30 min內迅速取羊背最長肌，剔除脂肪和肉眼可見的筋膜，低溫運輸至實驗室備用。

磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑 瑞士Roche公司；激酶抑制劑 美國Abmole公司；GSNO、一氧化氮合成酶抑制劑（NG-nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride，L-NAME）美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺 上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

T25高速勻漿機 德國IKA公司；TGL-20KR高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；Tecan-Spark-20M多功能微孔板檢測儀 上海迪奧生物科技有限公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳設備、Mini Trans-Blot轉膜設備、ChemiDocTMXRS＋凝膠成像儀、ChemiDocTMMP凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；Milli-Q?Reference超純水系統 德國Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將同一只羊的雙側背最長肌切塊混勻絞碎后隨機均分成6 個組，每組3 次生物學重復。對照組（C）：向肉糜中添加等體積的生理鹽水；高磷酸化水平組（P＋）：向肉糜中添加磷酸酶抑制劑（每5 g樣品中1 片抑制劑）；低磷酸化水平組（P－）：向肉糜中添加激酶抑制劑（每5 g肉中添加0.144 μmol激酶抑制劑）；亞硝基化處理組（S＋）：向50 g肉糜中添加50 mL 400 μmol/L的GSNO溶液；去亞硝基化處理組（S－）：向50 g肉糜中加入50 mL 0.1 mol/LL-NAME溶液；磷酸化和亞硝基化水平組（P＋＋S＋）：向50 g肉糜中添加磷酸酶抑制劑（每5 g樣品中1 片抑制劑）和50 mL 400 μmol/L GSNO溶液。并在4 ℃環境中孵育3 d，為保證宰后肉中的能量不被完全消耗，上述操作均在羊宰后40 min內完成。分別在宰后12、24、48、72 h取樣，液氮速凍，于－80 ℃貯藏備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

肌原纖維蛋白的提取參考Huang Honggang[16]和Li Chunbao[17]等的方法，并稍作修改。1 g肉樣與6 mL蛋白提取液（100 mmol/L Tris，pH 8.3）、1 片蛋白酶抑制劑（50 mL/片）、2 片磷酸酶抑制劑（25 mL/片），在10 000 r/min條件下冰浴均質3 次，每次30 s；然后4 ℃、10 000×g離心30 min，棄上清液，將沉淀在8 mL體積分數為5% SDS溶液（60 ℃）中勻漿30 s后，80 ℃加熱20 min，得到肌原纖維蛋白溶液，分裝后液氮速凍，放置于－80 ℃備用。

1.3.3 樣品制備

用超純水將肌原纖維蛋白溶液稀釋20 倍，BCA法測定肌原纖維蛋白質量濃度并用超純水稀釋至4 mg/mL。肌原纖維蛋白分離參考Chen Lijuan等[7]的方法。制備好的肌原纖維蛋白與上樣緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、10 mmol/L二硫蘇糖醇、40 g/L SDS、1 g/L溴酚藍、250 g/L甘油）等體積混合，混勻后沸水浴5 min，冷卻至室溫，于12 000 r/min離心2 min，取上清液分裝，于－20 ℃貯存備用。

1.3.4 磷酸化水平測定

采用體積分數4%濃縮膠和體積分數12%分離膠進行電泳，濃縮膠電壓70 V，當條帶到達分離膠時將電壓調至110 V，并且當溴酚藍指示條帶到達距離凝膠底部0.5 cm時停止電泳。電泳結束后，參照Chen Lijuan等[7]的染色方法，采用Pro-Q Diamond對磷酸化蛋白進行染色，SYPRO Ruby對全蛋白進行染色。先使用固定液（體積分數10%乙酸溶液，體積分數50%甲醇溶液）固定凝膠1 h（30 min，2 次）后水洗30 min（10 min，3 次），Pro-Q Diamond染色液避光孵育染色70 min，用Pro-Q脫色液（體積分數20%乙腈溶液，50 mmol/L乙酸鈉，pH 4.0）避光脫色1 h（30 min，2 次）后水洗15 min（5 min，3 次），采用凝膠成像儀掃描磷酸化蛋白染色條帶。而后將凝膠用SYPRO Ruby染色液避光過夜染色，SYPRO Ruby脫色液（體積分數7%乙酸溶液，體積分數10%乙醇溶液）避光脫色1 h（30 min，2 次）后水洗15 min（5 min，3 次），采用凝膠成像儀掃描全蛋白染色條帶。使用Quantity One軟件分析蛋白質磷酸化水平。蛋白質磷酸化水平為整體磷酸化蛋白光密度值（P）與全蛋白光密度值（T）的比值。

1.3.5 亞硝基化水平測定

參考Zhang Chaoyang等[18]的方法略作修改，將羊背最長肌切碎并加入提取緩沖液（50 mmol/L NaCl和50 mmol/L NH4HCO3，pH 7.8），12 000 r/min勻漿2 次，每次30 s，8 000×g冷凍離心勻漿10 min，吸取上清液，用BCA試劑盒測上清液蛋白質量濃度，并用緩沖液將蛋白質量濃度稀釋至1 mg/mL，然后進行亞硝基硫醇（S-nitrosothiol，SNO）含量測定。取50 μL蛋白溶液分別與溶液A（含1 g/100 mL磺胺的0.5 mol/L鹽酸）和溶液B（含0.2 g/100 mL氯化汞的溶液A）等體積混合，室溫避光反應5 min；然后加入100 μL溶液C（含0.02 g/100 mLN-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽的0.5 mol/L鹽酸），室溫（25 ℃）避光反應5 min。用酶標儀測定混合物在540 nm波長處的吸光度。使用200 μmol/L的GSNO溶液倍比稀釋至1.56 μmol/L，測得吸光度，繪制標準曲線。根據標準曲線方程，由溶液B和溶液A的吸光度差值計算SNO含量，單位為nmol/mg（以蛋白質量計）。

1.3.6 pH值測定

參考GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》[19]，略作修改。取0.5 g肉糜，加入5 mL 0.1 mol/L KCl溶液，于12 000 r/min冰浴均質，測定均質液的pH值，每組樣液測定3 次平行。

1.3.7 MFI測定

參考Culler等[20]的方法并略作修改。約0.5 g肌肉加入5 mL預冷緩沖液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L MgCl2，pH 7.1），勻漿2 次，每次30 s，中間間隔1 min。勻漿液在4 ℃、3 000×g條件下離心15 min，棄去上清液，用5 mL預冷緩沖液重懸，再次離心。再使用1.25 mL緩沖液將沉淀重懸，使用雙縮脲法測定蛋白質量濃度。用緩沖液將蛋白質量濃度調至（0.50±0.05）mg/mL，使用紫外分光度計測定540 nm波長處的吸光度。MFI按下式計算：

1.3.8 肌原纖維蛋白降解測定

1.3.8.1 肌間線蛋白降解

采用體積分數4%的濃縮膠和體積分數12%的分離膠進行電泳，濃縮膠電壓70 V，當指示條帶到達分離膠時將電壓調至110 V，并且當溴酚藍指示條帶到達距離凝膠底部0.5 cm時停止電泳。電泳結束后，去除濃縮膠并取下凝膠，于預冷的轉膜緩沖液中平衡凝膠和PVDF膜20 min，平衡前將PVDF膜放在無水甲醇中活化15 s，按照黑板、黑海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、黑海綿的順序放置于預冷轉膜緩沖液中，100 V冰浴60 min，結束后用Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline，TBS）（10 mmol/L Tris、150 mmol/L氯化鈉，pH 7.5）清洗PVDF膜上的轉膜緩沖液（3 次，每次2 min），封閉液（含0.05%吐溫-20、3%牛血清白蛋白的TBS）室溫封閉2 h，一抗使用鼠抗-肌間線蛋白抗體（D1033，稀釋比為1∶1 000），在4 ℃孵育過夜（14 h）后用含0.1%吐溫-20的TBS（TBS with 0.1% Tween-20，TBST1）洗滌（3 次，每次20 min），然后與二抗（辣根過氧化酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白G，稀釋比為1∶2 500）在室溫孵育2 h后用TBST2（50 mmol/L Tris、150 mmol/L氯化鈉、0.1%吐溫-20，pH 7.5）洗滌（3 次，每次10 min），與電化學發光顯色液避光孵育后用凝膠成像儀曝光成像。

1.3.8.2 肌鈣蛋白-T降解

肌鈣蛋白-T的降解測定方法同1.3.8.1節，但是其采用體積分數15%的分離膠，一抗是鼠抗-肌鈣蛋白-T抗體（ab13003，稀釋比為1∶1 000）。

1.4 數據分析

實驗均3 次重復，每個樣品3 次平行，用SPSS 26.0和Origin 21.0軟件對實驗結果進行處理，采用單因素方差分析法對數據進行分析，利用Duncan方法對數據進行多重比較，其中P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蛋白質磷酸化水平分析

不同處理組在不同孵育時間下的相對磷酸化水平變化如圖1和圖2所示，各處理組相對磷酸化水平隨孵育時間的改變無顯著變化。在孵育過程中，磷酸化處理組的相對磷酸化水平高于對照組，其他處理組的相對磷酸化水平則低于對照組，并且在宰后孵育前期（12 h）和后期（48～72 h），磷酸化處理組的磷酸化水平顯著高于磷酸化和亞硝基化共同處理組（P＜0.05），表明蛋白質亞硝基化會抑制磷酸化修飾反應。細胞外調節蛋白激酶的亞硝基化會抑制其磷酸化并導致細胞凋亡[21]。但Guequen等[22]研究結果相反，可能是不同的研究對象具有不一樣的作用效果。

圖1 Pro-Q磷酸化蛋白（A）和Ruby全蛋白（B）熒光染色圖Fig.1 Fluorescent staining gel images of phosphorylated myofibrillar protein with Pro-Q diamond (A) and total protein with SYPRO Ruby (B)

2.2 蛋白質亞硝基化水平分析

SNO含量越高，表明其蛋白質亞硝基化程度越大。由圖3可知，不同處理組的SNO含量隨孵育時間的延長發生顯著改變（P＜0.05）。在孵育過程中，不同處理組間SNO含量差異顯著（P＜0.05），對照組、亞硝基化處理組和去亞硝基化處理組的亞硝基化水平顯著升高（P＜0.05），而磷酸化處理組的亞硝基化水平卻顯著降低（P＜0.05），亞硝基化處理組的SNO含量顯著高于對照組，磷酸化與亞硝基化共同處理組的SNO含量顯著低于對照組（P＜0.05），磷酸化處理組則在孵育中后期（24～72 h）低于對照組，磷酸化與亞硝基化共同處理組的SNO含量在反應前期和中期（12～48 h）均顯著低于磷酸化處理組，孵育后期（72 h）則顯著高于磷酸化處理組（P＜0.05），表明蛋白質磷酸化能夠抑制蛋白質亞硝基化反應。Chen Yong等[23]研究發現磷酸化Dexras1導致鐵流量減少，是因為Dexras1的磷酸化抑制了其亞硝基化水平，與本研究的結果一致。

圖3 宰后各組在不同孵育時間下的相對亞硝基水平Fig.3 Relative S-nitrosylation level of each group at different times of postmortem storage

2.3 pH值分析

pH值是反映宰后肉成熟進程的重要指標[24]。由圖4可知，在孵育過程中，去亞硝基化處理組的pH值隨著孵育時間的延長顯著降低（P＜0.05），直至趨于穩定，一氧化氮合酶抑制劑通過減少肌肉細胞中NO含量、加速糖酵解的進程，促進pH值下降[25]。磷酸化處理組樣品的pH值先顯著升高后顯著降低直至趨于穩定，可能是磷酸酶抑制劑促使磷酸基團進入磷酸化修飾位點導致溶液體系pH值減小，而后由于磷酸化水平的升高加速了糖酵解進程[26]。對照組、去磷酸化處理組、亞硝基化處理組和磷酸化與亞硝基化共同處理組的pH值則是先降低后升高直到趨于穩定，這是無氧糖酵解產生的乳酸、蛋白質被降解產生的堿性物質以及NO含量共同調控的結果[27]。當磷酸化和亞硝基化修飾共同作用時，磷酸化修飾對pH值的影響占主導作用，并且亞硝基化可能會促進磷酸化對pH值的進一步影響。

圖4 宰后各組在不同孵育時間下的pH值Fig.4 pH of each group at different times of postmortem storage

2.4 MFI分析

MFI是表征宰后肉嫩度的重要指標[28-29]。MFI越大，肌原纖維結構被破壞得越嚴重，肌原纖維蛋白降解程度越大，肉嫩度越好[30-31]。由圖5可知，在整個孵育過程中，亞硝基化處理組、磷酸化與亞硝基化共同處理組的MFI均小于對照組，并且從孵育24 h起，磷酸化處理組的MFI也低于對照組。在孵育前期（12 h）和后期（48～72 h），磷酸化處理組的MFI顯著大于磷酸化與亞硝基化共同處理組（P＜0.05），且亞硝基化處理組與磷酸化和亞硝基化共同處理組差異不顯著，表明與蛋白質磷酸化相比，亞硝基化對宰后羊背最長肌肌原纖維內部結構的破壞起主要作用。

圖5 宰后各組在不同孵育時間下的MFIFig.5 MFI of each group at different times of postmortem storage

2.5 肌原纖維蛋白降解分析

2.5.1 肌間線蛋白降解

肌間線蛋白可作為宰后蛋白降解的標志蛋白[32]。如圖6B所示，在整個孵育過程中，去磷酸化處理組和亞硝基化處理組的肌間線蛋白相對降解率始終高于對照組，但在孵育72 h時，去磷酸化處理組肌間線蛋白的降解程度低于對照組，而在孵育過程中肌間線蛋白相對降解率一直低于對照組的去亞硝基化處理組卻在此刻略高于對照組；磷酸化處理組和磷酸化與亞硝基化共同處理組的肌間線蛋白相對降解率在宰后羊背最長肌孵育成熟過程中均低于對照組，且在孵育中后期（24～72 h），磷酸化與亞硝基化共同處理組肌間線蛋白的降解程度從顯著低于磷酸化處理組（P＜0.05）最終變化至差異不顯著（P＞0.05）。這表明蛋白質亞硝基化會促進肌間線蛋白的降解，而蛋白質磷酸化抑制肌間線蛋白的降解，且當二者共同存在時，蛋白質磷酸化抑制蛋白質亞硝基化修飾進程，而蛋白質亞硝基化相反可能會促進蛋白質磷酸化對肌間線蛋白降解的抑制作用。

圖6 宰后各組在不同孵育時間下的肌間線蛋白免疫印跡圖（A）和相對降解率（B）Fig.6 Western blot image (A) and relative degradation rate (B) of desmin in each group at different times of postmortem storage

2.5.2 肌鈣蛋白-T降解

肌鈣蛋白-T降解是宰后肉嫩化和成熟的標志[33]。由圖7可知，在整個孵育過程中，磷酸化與亞硝基化共同處理組的肌鈣蛋白-T降解程度始終顯著低于對照組（P＜0.05），亞硝基化處理組也低于對照組，但在孵育72 h顯著高于對照組。在宰后孵育的12 h內，各處理組肌鈣蛋白-T的相對降解率均低于對照組，但在24～72 h孵育過程中，磷酸化處理組、去磷酸化處理組以及去亞硝基化處理組肌鈣蛋白-T的降解程度顯著高于對照組（P＜0.05），磷酸化與亞硝基化共同處理組的肌鈣蛋白-T相對降解率則始終低于亞硝基化處理組。表明在宰后孵育前期（12 h），蛋白質磷酸化和蛋白質亞硝基化修飾相互促進，抑制肌鈣蛋白-T的降解。在孵育中期（24～48 h），蛋白質亞硝基化抑制磷酸化反應進程，而磷酸化促進亞硝基化修飾對肌鈣蛋白-T降解的抑制作用。在孵育后期（72 h），蛋白質磷酸化和蛋白質亞硝基化相互抑制，導致肌鈣蛋白-T的降解程度明顯降低。

圖7 宰后各組在不同孵育時間下的肌鈣蛋白-T免疫印跡圖（A）和相對降解率（B）Fig.7 Western blot image (A) and relative degradation rate (B) of troponin-T in each group at different times of postmortem storage

3 結論

采用不同處理方式調控宰后羊背最長肌的磷酸化和亞硝基化修飾水平，結果表明，蛋白質磷酸化和亞硝基化修飾反應可能相互抑制；當磷酸化和亞硝基化修飾共同作用時，磷酸化修飾主要影響pH值的變化，并且亞硝基化會促進磷酸化對pH值的進一步影響；與蛋白質磷酸化相比，蛋白質亞硝基化對宰后羊背最長肌肌原纖維內部結構的破壞起主要作用；當磷酸化和亞硝基化修飾共同存在時，蛋白質磷酸化抑制蛋白質亞硝基化反應，而蛋白質亞硝基化相反可能會促進蛋白質磷酸化對肌間線蛋白降解的抑制作用；在宰后孵育前期（12 h），蛋白質磷酸化和蛋白質亞硝基化修飾相互促進，在孵育中期（24～48 h），蛋白質磷酸化促進亞硝基化反應進程，而亞硝基化抑制磷酸化反應進程，在孵育后期（72 h），蛋白質磷酸化和蛋白質亞硝基化相互抑制，最終導致肌鈣蛋白-T的降解程度明顯降低。蛋白質磷酸化和亞硝基化修飾互作不利于宰后羊肉嫩度。