復配香辛料精油對鯰魚肉風干腸品質及安全性的影響

張雨婷，董笑溦，張伯雅，馬儷珍,2，梁麗雅

（1.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300392；2.天津市水產品加工及質量安全校企協同創新實驗室，天津 300392；3.天津農學院農學與資源環境學院，天津 300392）

風干腸是一類傳統發酵肉制品，通常是將腌制過的畜禽肉糜灌入腸衣中，經風干制成，利用在自然條件下微生物發酵作用形成特有的風味和質地，并達到長期貯存的目的。不同地區對風干腸原料的選擇也不同，北方多以豬肉作為原料[1]，而少數民族地區通常選用牛肉或羊肉制作[2-3]，隨著水產品加工業的不斷發展，也出現了以魚肉為原料加工的風干腸，革胡子鯰魚含有豐富的蛋白質和脂肪，是制作風干腸的理想原料[4-5]。

隨著人們食品安全意識的提高，發酵肉制品的安全品質越來越受到關注。自然發酵的鯰魚肉風干腸容易出現雜菌生長產毒的隱患[6]，此外淡水魚的土腥味也是有待解決的問題。研究發現，香辛料精油具有較高的抑菌性和抗氧化活性[7]，還能去除肉制品中的不良風味[8]，可用于風干腸的加工和魚肉保鮮。新鮮鯰魚肉中主要的微生物群落有變形菌門、放線菌門和厚壁菌門[9]。李曉宏[10]研究發現添加植物提取物可以降低樣品中微生物的多樣性。Xiao Qing等[11]研究表明高壓加工導致的香腸氧化現象可以通過添加丁香和肉桂精油延緩，并能顯著抑制腐敗菌的生長。姚正穎等[12]發現紫蘇精油能有效掩蓋魚腥味，并賦予白鰱魚丸較好的風味。

對于單一香辛料精油在肉制品中的抑菌和抗氧化效果已有大量研究，結果表明香辛料精油能抑制肉制品中有害微生物的生長、延緩氧化，在增添風味的同時還能提升安全性。課題前期研究了單一香辛料精油對鯰魚肉風干腸品質和安全性的影響，結果表明八角精油和紫蘇精油（添加量為肉質量的0.03%，下同）對鯰魚肉風干腸中生物胺和N-亞硝胺的抑制效果較好，丁香精油和八角精油均能延緩風干腸的氧化、提高乳酸菌水平，不同香辛料精油對鯰魚肉風干腸的影響各具優勢[4]。研究發現，香辛料精油復配能擴大抗菌譜，增強精油的抑菌效果，進而減少使用量，避免某些精油的特殊氣味給產品的感官品質帶來影響[13-14]。張依潔等[15]發現不同稀釋度的肉桂油樹脂、生姜精油、八角茴香精油、青花椒油樹脂等體積混合，可以代替化學防腐劑應用于食品中。楊柳等[16]的研究結果表明，丁香精油和肉桂精油1∶1復配得到的精油，其抑菌協同作用有一定選擇性。復配香辛料精油對風干腸的影響鮮有報道，因此本研究選擇了前期實驗效果較好的丁香、八角、紫蘇3 種精油進行不同的復配組合，同時設置空白對照，對鯰魚肉風干腸的理化性質進行檢測。在此基礎上，考慮進一步研究香辛料精油復配使用對鯰魚肉風干腸中幾種微生物數量的影響，同時通過16S rDNA測序分析樣品中微生物群落組成。篩選出能有效提高產品品質和安全性的精油復配組合，為香辛料精油復配在風干腸中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

革胡子鯰魚（1.5～1.6 kg）天津市紅旗農貿綜合水產批發市場；鹽、白糖、白酒、醬油、味精 世紀華聯超市；紫蘇精油 吉安市青原區利康天然香料油有限公司；丁香精油、八角精油 頂興（天津）食品科技發展有限公司。

抗壞血酸鈉 蘇州佰億鑫生物科技有限公司；生物胺標準品 美國Sigma公司；N-亞硝胺標準品（N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-甲基乙基亞硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamide，NDBA）、N-亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDphA））美國Supelco公司；氯化鉀、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、鹽酸、三氯甲烷（分析純）、乙腈、二氯甲烷（色譜純）天津市風船化學試劑科技有限公司；高氯酸、丙酮、丹磺酰氯（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；配制試劑均使用超純水。

1.2 儀器與設備

T25高速分散機 德國IKA公司；CLIMACELL恒溫恒濕箱 艾力特國際貿易有限公司；BVBJ-30F真空攪拌機 浙江嘉興艾博實業有限公司；ST310 pH電極美國奧豪斯公司；HD-4智能水分活度（aw）測量儀東莞迪樂電子儀器科技有限公司；CM-5分光測色計日本柯尼卡美能達公司；ST-40R冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；7890A氣相色譜儀、1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋日本TOMY有限公司；CLASSII生物安全柜 天美（中國）科學儀器有限公司；JZ-4拍打式無菌均質器 天津歆毅翎科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鯰魚肉風干腸制作

參考陳援援等[17]的方法進行修改，使用革胡子鯰魚魚糜替代豬肉，不額外添加脂肪。選用30 mm的膠原蛋白腸衣進行手工灌制，灌好的風干腸將掛入恒溫恒濕培養箱中進行12 d的發酵風干，初始發酵溫度為24 ℃（2～6 d每天降低1 ℃，7～12 d保持在15 ℃），相對濕度（第1天30%、第2天70%、第3天75%、第4～12天80%），通風機比率（第1～3天100%、第4天90%、第5天80%、第6～12天70%，按照恒溫恒濕箱使用說明設定）。

1.3.2 實驗分組

按照1.3.1節鯰魚肉風干腸制作方法，在調味過程中設計5 組，分別添加丁香精油和八角精油（CA組）、丁香精油和紫蘇精油（CP組）、八角精油和紫蘇精油（AP組）、丁香精油和八角精油和紫蘇精油（CAP組），所有組的精油復配比例均為等質量比復配（1∶1或1∶1∶1），精油總添加量為前期實驗選出的0.03%（以肉質量計），同時設置不添加香辛料精油的空白對照組（CK組）。對第12天風干成熟的終產品進行各項理化指標的測定。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 水分含量、aw的測定

樣品中的水分含量按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法進行測定。

將絞碎后的樣品平鋪在玻璃測量皿底部，保持樣品厚度一致，使用水分活度測量儀對樣品的aw進行測定。

1.3.3.2 色差值的測定

首先打開色差儀使其平衡10 min左右，再用白板進行矯正。攪碎的樣品均勻鋪在適應皿中，保持厚度一致、沒有空隙，測定樣品的色澤。

1.3.3.3 pH值的測定

按照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》中針對肉制品的檢測方法測定樣品的pH值。

1.3.3.4 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值的測定

參照Witte等[18]的方法對鯰魚肉風干腸的TBARS值進行測定。

1.3.3.5 生物胺含量的測定

根據陳援援等[19]的方法測定樣品中生物胺的含量。

1.3.3.6N-亞硝胺含量的測定

參照GB 5009.26—2016《食品中N-亞硝胺類化合物的測定》中的方法進行測定。

1.3.3.7 菌落總數、乳酸菌數、腸桿菌科數、假單胞菌數、氣單胞菌數的測定

所有樣品的稀釋根據GB 4789.2—2022《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》中的方法進行，接種方法采用傾注法，菌落總數、乳酸菌數、腸桿菌科數、假單胞菌數、氣單胞菌數測定所用培養基分別是營養瓊脂培養基、MRS培養基、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基、假單胞菌CFC選擇性培養基（含假單胞CFC選擇性培養基添加劑（凍干））、氣單胞菌鑒別瓊脂培養基，每個稀釋梯度做2 個平行。在（36±1）℃條件下，腸桿菌科培養24 h，其余樣品培養48 h，結束后對平皿上的菌落分別計數。

1.3.3.8 微生物群落結構分析

將5 組鯰魚肉風干腸樣品送至北京奧維森基因科技有限公司，采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增的方法對鯰魚肉風干腸16 Sr DNA 的V3～V4 區段進行檢測，對樣品的細菌群落結構和細菌多樣性等進行分析。使用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對16S rDNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 復配香辛料精油對鯰魚肉風干腸水分含量和aw的影響

由圖1A可以看出，不同處理組的水分含量差異顯著，除CP組外，CA組、AP組、CAP組的水分含量分別為26.42%、27.13%、25.98%，均顯著低于CK組（P＜0.05），說明香辛料精油促進了風干腸中水分蒸發。當aw低于病原微生物安全生長界限0.85時[20]，有利于延長產品的貨架期，提升安全性。CA組、CP組、AP組、CAP組的aw依次為0.734、0.802、0.765、0.753，與孫學穎等[21]研究的發酵羊肉香腸成熟后的aw相近，說明復配香辛料精油很大程度上抑制了腐敗微生物的生長。

圖1 不同精油復配處理對鯰魚肉風干腸水分含量（A）和aw（B）的影響Fig.1 Effect of different combinations of spice essential oils on moisture content (A) and aw (B) of air-dried catfish sausages

2.2 復配香辛料精油對鯰魚肉風干腸色差的影響

L*值和a*值分別反映了風干腸的亮度和紅綠度[22]。由圖2A可知，CP組、AP組、CAP組的L*值顯著低于CK組（P＜0.05），是由于風干過程中水分大量散失，風干腸中肌紅蛋白等色素的濃度增加，使光線的透射率降低[23]。蛋白質酸化使肌球蛋白粗絲收縮，增加了肉的光反射，也會使L*值發生變化。CA組和CAP組的a*值顯著高于CK組（P＜0.05），二者顏色紅潤，更易受到消費者青睞。而AP組的a*值顯著低于CK組（P＜0.05），說明八角精油和紫蘇精油復配使用不能提高風干腸的紅度，這可能也與精油自身的色澤有關。

圖2 不同精油復配處理對鯰魚肉風干腸L*值（A）和a*值（B）的影響Fig.2 Effect of different combinations of spice essential oils on L* (A) anda* values (B) of air-dried catfish sausages

2.3 復配香辛料精油對鯰魚肉風干腸pH值的影響

圖3顯示了不同的香辛料精油復配組對鯰魚肉風干腸pH值的影響，各組pH值范圍為5.48～6.11，添加了復配精油的處理組pH值均顯著高于CK組（P＜0.05）。與李曉宏[10]的研究結果相似，其研究中植物提取物處理組的pH值同樣高于對照組，說明香辛料精油的添加降低了風干腸產酸能力。風干腸pH值變化還會影響肌原纖維蛋白的收縮，當pH值遠離蛋白質等電點（5.4）時，肌原纖維蛋白收縮程度降低，肉的光反射減少，進而對L*值產生影響。

圖3 不同精油復配處理對鯰魚肉風干腸pH值的影響Fig.3 Effect of different combinations of spice essential oils on pH of air-dried catfish sausages

2.4 復配香辛料精油對鯰魚肉風干腸TBARS值的影響

TBARS值是評價脂肪氧化程度的重要指標，可以反映出風干腸的品質變化。不飽和脂肪酸經過氧化等一系列反應會產生肉香味[24]，過量則可能會有哈喇味。由圖4可知，4 組精油復配處理組的TBARS值均低于0.5 mg/kg，且與對照組差異顯著（P＜0.05），說明香辛料精油可以降低風干腸中脂肪氧化程度，但不同復配組合方式對TBARS值影響的差異較小。

圖4 不同精油復配處理對鯰魚肉風干腸TBARS值的影響Fig.4 Effect of different combinations of spice essential oils on TBARS value of air-dried catfish sausages

2.5 復配香辛料精油對鯰魚肉風干腸生物胺含量的影響

生物胺是具有脂肪族、芳香族或雜環結構的含氮低分子質量有機堿，由它們各自的游離前體脫羧基形成[25]。腐胺與尸胺均不易引起食物中毒，但同時存在會因協同作用增強組胺和酪胺的毒性[26]。由表1可知，5 組樣品中均未檢出色胺和腐胺。不同香辛料精油復配處理的4 組樣品尸胺含量均低于CK組，且AP組的尸胺含量顯著低于CK組（P＜0.05），抑制率高達47.8%。組胺和酪胺是毒性最大的兩類生物胺，是評價風干腸安全性應重點關注的指標。我國未規定發酵肉制品中組胺的限量標準，但研究發現，組胺攝入超過40 mg會出現中等中毒現象[27]。各組風干腸中組胺的含量均未超過標準。5 組風干腸中酪胺的含量均較低，只有AP組的酪胺含量低于CK組，但不差異顯著，說明添加復配香辛料精油對酪胺的抑制作用較小。

表1 不同精油復配處理對鯰魚肉風干腸生物胺含量的影響Table 1 Effect of different combinations of essential oils on biogenic amine content of air-dried catfish sausages mg/kg

就對人體健康的危害而言，總生物胺的最高閾值為1 000 mg/kg[28]。5 組鯰魚肉風干腸中總量最高的是CK組（67.41 mg/kg），遠低于這一限量值，說明鯰魚肉風干腸的安全性較好。4 種不同香辛料精油復配組合對生物胺抑制效果最好的是AP組（44.48 mg/kg），抑制率為34.02%。

2.6 復配香辛料精油對鯰魚肉風干腸N-亞硝胺含量的影響

N-亞硝胺是世界公認的食品污染物之一，肉制品中N-亞硝胺主要是由加工過程中添加的亞硝酸鹽和產生的二級胺類物質發生亞硝化反應生成。亞硝胺自身不具有致癌性，但經生物體內轉化后會生成致癌物[29]。我國僅規定了肉及肉制品中NDMA的含量不得超過3.0 μg/kg，由表2可知，5 組風干腸都是安全的產品。其中CAP組的NDMA含量最低，僅為0.11 μg/kg，顯著低于CK組。所有處理組均未檢出NPYR，其他幾種亞硝胺雖然能檢測到，但是含量均較低，如NDEA含量在2.17～5.97 μg/kg范圍內，NMEA的含量在1.20～3.16 μg/kg范圍內。AP組中有4 種亞硝胺未檢出，其總量也顯著低于CK組，說明八角精油和紫蘇精油復配使用能大大降低風干腸中亞硝胺含量。

表2 不同精油復配處理對鯰魚肉風干腸N-亞硝胺含量的影響Table 2 Effect of different combinations of spice essential oils on N-nitrosamine contents of air-dried catfish sausagesμg/kg

2.7 復配香辛料精油對鯰魚肉風干腸微生物數量的影響

石曉駿等[30]發現丁香精油能很好地抑制老北京肉肚中假單胞菌的生長。周偉等[31]利用紫蘇葉的水提物和醇提物抑制鰹魚魚柳中微生物的生長。從圖5A可以看出，AP組顯著降低了風干腸中的菌落總數（P＜0.05），對微生物的抑制效果優于其他3 個處理組。如圖5B所示，添加香辛料精油均能顯著提高產品中乳酸菌的數量（P＜0.05），促進風干腸發酵產酸，但是精油配比的不同對乳酸菌的生長影響不大。鯰魚肉風干腸中腸桿菌科總數由低到高依次為AP＜CAP＜CK＜CP＜CA（5.0～6.6（lg（CFU/g））），雖然AP組和CAP組能顯著抑制腸桿菌科的生長，但仍然高于瑞士對生發酵香腸中腸桿菌科的限量（100 CFU/g）[32]。盡管我國對此沒有要求，但出于對風干腸品質和安全性的考慮，未來可以通過添加乳酸菌發酵劑進行調節。氣單胞菌是水產品中常見的致腐菌，它與其他致腐菌協同作用分解脂肪和蛋白質，產生尸胺具有腐敗的不良氣味[33]。從圖5D可以看出，不同精油復配處理對氣單胞菌數的影響差異顯著（P＜0.05），其中AP組的抑制效果最好。富含蛋白質的水產品在冷鏈流通過程中易感染假單胞菌，這也是水產品腐敗的主要原因[34-35]。根據圖5E可以看出，CA組對假單胞菌有很好的作用效果，可以在一定程度上減少風干腸的腐敗變質。

圖5 不同精油復配處理對鯰魚肉風干腸中微生物數量的影響Fig.5 Effect of different combinations of spice essential oils on microbial load in air-dried catfish sausages

2.8 鯰魚肉風干腸稀釋曲線分析

稀釋曲線可以在相同測序深度下，比較不同樣本中操作分類單元數量，從而衡量不同處理組之間微生物多樣性的高低。由圖6可知，除了CK組以外，當測序深度高于25 000 時，其余4 個處理組的稀釋曲線均趨于平緩，說明當前測序結果已足夠反應當前樣本所包含的多樣性。不同香辛料精油復配處理對鯰魚肉風干腸中微生物的多樣性影響不同。

圖6 鯰魚肉風干腸稀釋曲線圖Fig.6 Rarefaction curves of microbial diversity in catfish air-dried sausages

2.9 基于門水平菌群結構分析

從圖7可以看出，鯰魚肉風干腸的群落由7 個門組成，分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、彎曲桿菌門（Campilobacterota）、藍藻門（Cyanobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteriota）。最具優勢的細菌是變形菌門和厚壁菌門，與國內外同類型的產品研究結果一致[36-38]，占比達到了99%以上。5 組樣品中，變形菌門占比最高的是CAP組（63.98%），厚壁菌門占比最高的是CP組（47.98%）。

圖7 鯰魚肉風干腸基于門水平的微生物群落結構組成及相對豐度Fig.7 Composition and relative abundance of microbial community at the phylum level in air-dried catfish sausages

2.10 基于屬水平菌群結構分析

如圖8所示，共檢測到55 個菌屬，選取相對豐度前20 位的菌屬進行繪圖。不同處理組微生物相對豐度差異較大，說明不同的香辛料精油對鯰魚肉風干腸中微生物菌群的抑制作用不同。

圖8 鯰魚肉風干腸基于屬水平的微生物群落結構組成及相對豐度Fig.8 Composition and relative abundance of microbial community at the genus level in air-dried catfish sausages

腸球菌屬（Enterococcus）是幾組樣品中最豐富的菌屬，是食品中正常菌群的組成部分，可作為發酵劑使用[39]，其中CP組中的相對豐度達到40.88%。與CA組、CP組、AP組相比，CAP組的檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）相對豐度更高，克雷伯氏菌屬（Klebsiella）的相對豐度更低。此外，CA組和AP組中明串球菌屬（Leuconostoc）的相對豐度均高于CK組，說明含有八角精油的風干腸更容易促進明串球菌屬生長，其是否為可用于食品的菌種有待進一步分析。

據報道，檸檬酸桿菌屬是人和動物的胃腸道共生菌，衛生處理不當則有感染人畜共患病的風險[40]。克雷伯氏菌屬也是一類致病菌，其中肺炎克雷伯氏菌是重要的食源性病原體，近年來不斷在食品中檢測到[40]。同為食源性條件致病菌的還有變形桿菌屬（Proteus），它對生長環境要求低，污染后的食品感官性狀變化不明顯，因此容易忽視它的繁殖[41-42]。哈夫尼菌屬-肥桿菌屬（Hafnia-Obesumbacterium）的豐度較高，其主要分布在人和動物的糞便中，也存在于土壤、污水和乳制品中，哈夫尼菌可產生組胺，還會引起低溫儲藏肉制品的腐敗變質[43]。

總體來看風干腸中還是存在多種致病菌，這是由于制作時采用自然發酵法，未能在發酵初期使乳酸菌成為優勢菌種。添加了八角和紫蘇精油的AP組風干腸群落組成多樣性低，與對照組相比，降低了其中檸檬酸桿菌屬、變形桿菌屬和哈夫尼菌屬-肥桿菌屬的相對豐度，且圖5A中AP組菌落總數最顯著低于對照組，一定程度上提升了風干腸的安全性。

3 結論

添加復配香辛料精油促進了風干腸水分的散失，其中AP組的水分含量和aw適中，CA組產品外觀更好。各處理組pH值由高到低依次為CAP＞AP＞CA＞CP。精油復配組合使鯰魚肉風干腸TBARS值均低于0.5 mg/kg，但精油組合方式對結果影響的差異較小。不同香辛料精油復配組合均能有效降低生物胺的生成，其中AP組鯰魚肉風干腸對生物胺和N-亞硝胺的抑制效果較好。AP組能顯著降低風干腸的菌落總數，對腸桿菌科和氣單胞菌的抑制效果也優于其他處理組。所有添加精油的處理組均能促進乳酸菌的生長，有利于風干腸發酵產酸，產生特有的風味。微生物菌群結構分析結果顯示，腸球菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、哈夫尼菌屬-肥桿菌屬是鯰魚肉風干腸中主要的細菌群落，香辛料精油的添加可以降低其中微生物的相對豐度。AP組促進了鯰魚肉風干腸中芽孢桿菌屬和魏斯氏菌屬的生長。綜上所述，八角精油和紫蘇精油的復配組合在提升產品安全性方面作用效果較好。