基于表達元件優化提高脫氧雪腐鐮刀菌烯醇解毒酶DepB在枯草芽孢桿菌中的表達水平

嚴茹雪，李 越，牛家峰，陸兆新，孟凡強，朱 萍，呂鳳霞

（南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又名嘔吐毒素，是主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、粉色鐮刀菌和黃色鐮刀菌等真菌侵染谷物后所產生的一種有毒次級代謝產物，廣泛存在于小麥、玉米等糧谷類原料及其制品中，對人類和動物的健康造成巨大威脅[1-2]。當DON進入食物鏈時，會威脅食品安全并危害人類健康，引起急性和慢性毒性，如食欲不振、惡心、嘔吐、胃腸炎腹瀉、免疫抑制和體質量下降等[1,3-5]。因此，迫切需要制定有效的措施預防和控制食品及飼料工業中的DON污染。

近年來，DON生物降解方法倍受關注，對DON生物降解的研究主要包括微生物降解法和酶解毒法。研究已證實微生物降解法的有效性，但由于微生物及其代謝產物的分解能力較弱，影響了實際的降解效果，而微生物降解的本質也是一種通過酶對毒素進行解毒的方法。相比傳統的物理、化學脫毒方法存在效果不穩定、飼料營養成分損失大、影響飼料適口性等缺點，酶解毒法具有解毒效率高、特異性強、對糧食、飼料和環境無污染等優勢，因而在食品加工和食品安全領域中顯示出巨大的應用價值[6-7]。研究報道，DON的C3位上羥基和C12/13環氧基團是DON的主要毒性基團，也是生物降解的主要研究位點[8-10]。其中C3位上羥基的氧化和異構化是目前報道最多、研究最為透徹的解毒方式，且許多DON解毒酶已被挖掘[8,10-13]。例如，醌依賴性醇脫氫酶DepA/QDDH/DDH能夠將DON氧化為毒性較小的3-酮基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-keto-DON）[8,11,13]，再經過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴性醛酮還原酶DepB/AKR13B2/AKR6D1將3-keto-DON還原，生成無毒的3-異構-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-epi-DON），即C3位的異構化[12-13]，這也是目前闡述的最為詳細的DON生物轉化途徑，解毒效果專一。其中，DepB作為DON生物轉化途徑中第二步關鍵酶，可將中間產物3-keto-DON完全降解為無毒的3-epi-DON，且單向不可逆。盡管目前所挖掘出的DON解毒酶基因均實現了在大腸桿菌中的異源表達，但表達水平不高[12]，且DON解毒酶基因在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）安全級表達系統中異源表達的研究鮮見報道。

枯草芽孢桿菌作為研究最為透徹的革蘭氏陽性菌，具有無致病性、易于遺傳操作、發酵周期短等特點，已被食品藥品監督管理局認證為GRAS（generally recognized as safe）菌株[14]。枯草芽孢桿菌表達系統廣泛用于各種工業酶制劑的生產，如普魯蘭酶[15]、L-天冬酰胺酶[16]、酰胺酶[17]和α-淀粉酶[18]等。研究表明，表達元件中的不同啟動子具有不同的轉錄強度，通過控制酶基因的轉錄水平進而影響重組酶的表達水平，單個啟動子的替換和串聯啟動子被用來提高重組酶在枯草芽孢桿菌中的表達水平[17,19-21]。此外，核糖體結合位點（ribosomal binding site，RBS）是影響重組酶表達水平的另一個因素，不同RBS具有不同翻譯起始速率，它可以在翻譯水平上調控酶基因的表達水平[22-24]。因此，采用轉錄和翻譯相結合的策略可以實現重組酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達。

本研究實現DON解毒酶DepB在枯草芽孢桿菌RIK1285中的異源表達，并通過表達元件的優化，包括信號肽篩選、單個啟動子替換、雙啟動子系統構建、啟動子核心區域（-35和-10區）優化和RBS工程相結合的系統策略，以提高DepB在枯草芽孢桿菌中的表達水平，旨在為DON解毒酶工業化應用和酶制劑開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌168、克隆宿主大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、表達宿主枯草芽孢桿菌RIK1285和表達載體pP43NMK均由本實驗室保存。編碼DepB的DNA序列（GenBank：KFL28068.1）由南京金斯瑞生物科技股份有限公司進行密碼子優化和合成。本研究所用引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

硫酸卡那霉素 北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒DC301及質粒小量提取試劑盒DC201、2×Phanta Master Mix、ClonExpression II One Step Cloning Kit南京諾唯贊健康科技有限公司；預染Marker 翌圣生物科技（上海）股份有限公司；蛋白Marker 26610 美國賽默飛世爾科技公司；硝酸纖維素膜 美國通用公司；ECL發光試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

發酵培養基[25]：45 g/L蔗糖、12 g/L玉米淀粉、15 g/L蛋白胨、0.8 g/L尿素、2.612 g/L K2HPO4·3 H2O、2.041 g/L KH2PO4、1.845 g/L MgSO4·7 H2O、3 g/L NaCl，pH 7。

1.2 儀器與設備

PTC-100TM聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、HC164-5052高電流電泳儀 美國Bio-Rad公司；NanoDrop 2000核酸定量儀 美國Thermo公司；UV-2450紫外分光光度計 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 表達載體的構建

利用引物對DepB-F、DepB-R通過PCR擴增C端帶有His標簽的DepB目的基因，通過引物對V1和V2對空質粒pP43NMK進行線性化。后通過同源重組的方法將目的基因和線性化的質粒組裝，得到DepB-His重組表達載體。同時，利用上述方法以枯草芽孢桿菌168及空質粒pHT43為模板擴增出10 條不同類型的信號肽，分別融合到目的基因DepB的N端得到相應的表達載體。此外，為提高重組DepB在枯草芽孢桿菌中的表達水平，8 個組成型啟動子（PaprE、PsecA、Pylbp、Phag、PfusA、PspoVG、PyvyD和PamyE）及一個誘導型啟動子PsacB，16 個雙啟動子用來替換原始啟動子P43（圖1）。為了進一步提高啟動子的轉錄水平，對啟動子的核心區域進行突變。采用同樣的方法，設計了19 個RBS序列替換原始的RBS序列。啟動子和RBS工程的示意圖見圖1。測序正確的載體通過Gryczan等[26]的方法轉化至枯草芽孢桿菌RIK1285感受態細胞中。

圖1 表達元件的優化示意圖Fig.1 Schematic diagram of the optimization of expression elements

1.3.2 重組DepB在枯草芽孢桿菌中的表達情況分析

將重組菌株接種至發酵培養基，在37 ℃、200 r/min條件下發酵培養72 h；含PsacB啟動子介導的菌株在37 ℃、200 r/min條件下培養至OD600nm＝0.8，加入誘導劑（蔗糖溶液）至終質量濃度為3 g/100 mL，于20 ℃、200 r/min條件下培養72 h。發酵結束后，于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集上清液以及菌體，上清液作為胞外蛋白樣品；菌體用5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（200 mmol/L NaCl，pH 7.5）重懸，然后在4 ℃條件下超聲破碎20 min，離心取上清液，上清液為胞內蛋白樣品。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離細胞內和細胞外的蛋白樣品，分析蛋白表達情況。

1.3.3 DepB活力測定

依據Carere等[12]的方法，將20 μL粗酶液加入到含有50 mmol/L Tris-HCl、150 μmol/L NADPH和100 μmol/L 3-keto-DON的300 μL反應體系（pH 7.0）中。然后，將反應體系在30 ℃孵育5 min。使用紫外-可見分光光度計檢測340 nm波長處吸光度的下降。一個酶活力單位（U）定義為每分鐘消耗1 μmol NADPH所需的酶量。

1.3.4 SDS-PAGE和Western blot分析

胞內外蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min，然后通過SDS-PAGE對蛋白進行分離檢測。對于Western blot實驗，將SDS-PAGE分離的蛋白轉膜至硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后將膜置于1∶20 000稀釋的抗His-Tag抗體中，在4 ℃條件下孵育16 h。然后將該膜用TBST緩沖液洗3 次，再用TBS洗一次，每次洗膜15 min。最后用高靈敏的ECL發光試劑盒進行化學發光。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 DepB在枯草芽孢桿菌RIK1285中的異源表達

N端未融合信號肽的DepB重組菌和10 個融合了不同類型信號肽的DepB重組菌經搖瓶發酵，制備粗酶液，測定DepB活力，并對重組菌進行發酵驗證。結果表明，融合不同類型信號肽的重組DepB未能實現胞內外分泌（圖2），而N端未融合信號肽的重組DepB實現了胞內表達，其酶活力為14.45 U/mL。另外，Western blot分析結果顯示在37 kDa附近具有特異性蛋白條帶，與DepB的理論分子質量（38.5 kDa）一致（圖2B），實現了DepB在枯草芽孢桿菌中的異源表達。

圖2 不同信號肽介導的DepB表達水平Fig.2 Expression levels of DepB mediated by different signal peptides

2.2 單啟動子對重組菌株表達水平的影響

為了在轉錄水平上提高DepB的表達水平，選擇了9 個具有較強轉錄水平的啟動子替代原始啟動子P43。發酵72 h后，不同啟動子介導的DepB表達效果差異較大，啟動子PsacB、PspoVG和PaprE表現出比P43啟動子更好的性能，酶活力分別為28.61、29.59 U/mL和22.44 U/mL（圖3A）。其中啟動子PspoVG所介導的DepB酶活力最高，是原始菌株的2.05 倍，重組菌株胞內樣品SDS-PAGE分析如圖3B所示，在37 kDa附近具有特異性蛋白條帶。研究表明，啟動子PspoVG也是具有強轉錄水平的啟動子，其介導的酰胺酶、α-淀粉酶AmyZ1和普魯蘭酶的表達水平均高于P43所介導的表達水平[17,27-28]，這與本研究結果一致。而在啟動子P43介導下的DepB產量比啟動子PyvyD更高，這與Niu Jiafeng等[29]采用啟動子PyvyD所介導的I型L-天冬酰胺酶（BlAase）表達水平更高的研究結果相反。由此可見，即使是在同一啟動子的啟動下，不同基因的表達水平也各不相同。

圖3 不同啟動子介導的重組DepB表達水平Fig.3 Expression levels of recombinant DepB mediated by different single promoters

2.3 串聯啟動子對重組菌株表達水平的影響

據報道，雙啟動子表達系統是提高重組酶表達水平的有效手段。串聯啟動子系統是通過將不同的單啟動子插入到另一個啟動子的下游構建，其轉錄強度也各不相同[17,30-31]。為了進一步提高重組DepB產量，以單啟動子的表達水平為基礎，進行雙啟動子系統的構建。選擇了4 個具有較高DepB表達水平的啟動子（PsacB、P43、PaprE和PspoVG），構建了16 個雙啟動子系統。如圖4A所示，P43-PaprE、P43-PspoVG、P43-P43、PsacB-PaprE、PsacB-PspoVG、PsacB-P43、PaprE-PaprE、PaprE-PspoVG、PspoVGPaprE和PspoVG-P43較最優單啟動子PspoVG的表達水平更高。其中，啟動子PaprE-PspoVG所介導的DepB活力最高，為48.87 U/mL，是原始菌株的3.38 倍。此外，SDS-PAGE分析如圖4B所示，在37 kDa附近具有特異性蛋白條帶。Guan Chengran等[30]也報道了類似結果，其研究中6 個雙啟動子中只有2 個比單啟動子的轉錄強度高，這是因為雙啟動子的強度并不是單一啟動子啟動強度的簡單相加。

圖4 不同雙啟動子表達載體介導下的重組DepB的表達水平Fig.4 Expression levels of recombinant DepB mediated by various dual-promoter systems

這16 個雙啟動子系統所介導的DepB活力各不相同，與Px-PsacB雙啟動子系統相比，Px-PspoVG的表達水平更高。這一結果可能是因為雙啟動子系統的表達強度主要取決于與報告基因相鄰啟動子的啟動強度[17,31]。結果表明，雙啟動子系統是在轉錄水平上提高重組蛋白產量的有效策略。

2.4 啟動子核心區域改造對重組菌株表達水平的影響

啟動子的轉錄強度與其保守區域（-35和-10區）密切相關，對這些核心區域的修飾被認為是提高重組蛋白產量的有效方法[32-34]。因此，為了進一步提高串聯啟動子PaprE-PspoVG的轉錄強度，對啟動子PaprE和PspoVG的核心區進行改造。PspoVG和PaprE分別是σH和σA依賴型啟動子，其核心區域的保守序列如圖5A所示[35-36]。然而，PspoVG和PaprE的保守序列與枯草芽孢桿菌中σH和σA依賴型啟動子的-35和-10區的保守序列并不完全匹配，故將啟動子PaprE和PspoVG的-35和-10區分別/組合突變為相應的保守序列，構建了5 個突變體（圖5A）。如圖5B所示，Mutant-1、Mutant-2和Mutant-3（Mutant-1和Mutant-2分別是啟動子PaprE的-35區和-10區突變，Mutant-3是啟動子PaprE的-35和-10區組合突變）的酶活力分別為59.55、58.58 U/mL和62.18 U/mL，分別是原始菌株的4.12、4.05 倍和4.30 倍。Mutant-4（啟動子PspoVG的-35區突變）酶活力為67.19 U/mL，是原始菌株的4.65 倍。這表明在雙啟動子系統中與報告基因相鄰的啟動子是一個更加關鍵的啟動子，對控制重組蛋白的表達水平至關重要。此外，Mutant-5（啟動子PspoVG和PaprE的-35和-10區域的組合突變）酶活力為69.17 U/mL（圖5B），是原始菌株的4.79 倍。另外，SDS-PAGE分析如圖5C所示，在37 kDa附近具有特異性蛋白條帶。Li He等[27]通過啟動子保守區域的改造，成功提高了α-淀粉酶AmyZ1在枯草芽孢桿菌中的表達水平，這與本研究結果一致，說明通過優化啟動子的核心區域提高異源蛋白的生產水平是一種有效方法。

圖5 雙啟動子系統保守區域改造Fig.5 Modification of core region of dual-promoter PaprE-PspoVG

2.5 RBS序列對重組菌株表達水平的影響

據報道，目的蛋白的表達水平不僅與啟動子的轉錄強度有關，還受翻譯起始速率的調控[37-39]。RBS序列是決定翻譯起始速率和蛋白表達水平的關鍵因素，優化該區域被認為是提高重組蛋白產量的有效策略[40]。因此，為了在翻譯水平上進一步提高重組DepB的表達水平，選擇了19 個RBS序列替換Mutant-5的原始RBS序列（RBS 0：AAAGGAGGTGAAATGTACAC）。RBS 1～RBS 14是在枯草芽孢桿菌或大腸桿菌中使用的具有高蛋白表達水平的RBS序列，RBS 15～RBS 19是通過在線軟件RBS Calculator v2.0（https://salislab.net/software/）設計的具有不同翻譯起始速率的RBS序列。如圖6A所示，在不同RBS序列的介導下，DepB的表達水平各不相同。與原始RBS序列相比，RBS 1～5、RBS 8、RBS 11、RBS 13、RBS 15、RBS 16和RBS 18所介導的DepB具有更高的表達水平。與原始菌株相比，通過RBS Calculator v2.0設計的5 個RBS序列中有3 個（RBS 15、RBS 16和RBS 18）具有更高的表達水平，結果表明RBS Calculator v2.0是有效的預測軟件。在RBS 15的介導下，重組DepB的酶活力達到了115.15 U/mL，是Mutant-5的1.66 倍，是原始菌株的7.97 倍。另外，SDS-PAGE分析也證實了這一結果（圖6B），說明基于優化RBS序列是在翻譯水平上提高重組蛋白產量的有效策略。

圖6 不同RBS介導下的重組DepB表達水平Fig.6 Expression levels of recombinant DepB mediated with different RBS sequences

3 結論

本研究實現了DON解毒酶DepB在枯草芽孢桿菌中的異源表達，但其表達水平有限。為了提高其表達水平，通過轉錄和翻譯相結合的方法，包括單啟動子的篩選和替換、雙啟動子系統的構建、啟動子核心區域（-35和-10區）的優化以及RBS序列的替換，提高了重組DepB的產量。優化后，DepB的酶活力由14.45 U/mL提高到了115.15 U/mL，是含有P43啟動子的原始菌株的7.97 倍。上述結果不僅提供了提高枯草芽孢桿菌中重組蛋白表達水平的系統性方法，也為DON解毒酶在谷物原料及飼料中的應用提供了依據。