枯草芽孢桿菌SNBS-3全基因組測(cè)序及其抑菌物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

紀(jì)帥奇，烏日娜,3，張?zhí)葬耍瑠鋲?mèng)雪，丁瑞雪，馬 穎，武俊瑞,3,*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，遼寧 沈陽(yáng) 110866；3.沈陽(yáng)市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類(lèi)細(xì)長(zhǎng)桿狀、內(nèi)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，本身可產(chǎn)生多種具有良好廣譜抑菌性、穩(wěn)定性和安全性的抑菌物質(zhì)，例如，對(duì)金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌等多種食源性致病菌有良好抑制作用的細(xì)菌素Subtilosin A，其已被認(rèn)為是未來(lái)可替代傳統(tǒng)抗生素的重要物質(zhì)[1-3]。此外，由于枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，在發(fā)酵黃豆醬中能夠抑制有害菌的生長(zhǎng)，提高發(fā)酵豆醬的品質(zhì)，因此，枯草芽孢桿菌在食品防腐保鮮方面發(fā)揮著重要作用[4]。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)在微生物基因組中得到廣泛應(yīng)用，使人們能準(zhǔn)確、高效解析微生物基因組信息，進(jìn)而更好挖掘微生物功能及其作用機(jī)制[5-8]。近年來(lái)，研究者利用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)不同芽孢桿菌開(kāi)展菌株生物學(xué)特性研究，挖掘菌株基因組信息，預(yù)測(cè)菌株功能，這對(duì)深入挖掘細(xì)菌素合成基因簇、鑒定細(xì)菌素特定基因以及細(xì)菌素功能基因組學(xué)等方面具有重要的意義[9-13]。

為了詳細(xì)解析枯草芽孢桿菌基因組信息，本研究對(duì)從豆醬中分離的1 株具有優(yōu)良抑菌特性的枯草芽孢桿菌SNBS-3進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得基因組信息的同時(shí)，結(jié)合直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）、基因本體論（Gene Ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZyme）、抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫(kù)（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD）和致病毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)（Virulence Factor Database，VFDB）等，詳細(xì)地解析基因組和菌株次級(jí)產(chǎn)物信息，應(yīng)用AntiSMASH和Bagel4軟件發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌SNBS-3具有完整合成細(xì)菌素的基因簇，結(jié)合抑菌實(shí)驗(yàn)和蛋白酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證該菌具有合成細(xì)菌素的能力。旨在更好地為開(kāi)發(fā)枯草芽孢桿菌SNBS-3提供生物信息基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌SNBS-3分離于遼寧省沈陽(yáng)市傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬，保存于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院菌庫(kù)，沙門(mén)氏菌（Salmonella）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）同為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

LB培養(yǎng)基 上海源葉生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、TDE超低溫冰箱 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；TGL-168高速臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

枯草芽孢桿菌SNBS-3培養(yǎng)24 h收集上清液。指示菌制成活菌數(shù)為106CFU/mL的菌懸液，采用打孔法測(cè)定上清液抑菌特性，菌懸液涂布后在孔內(nèi)滴加50 μL上清液，培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑[14]。

1.3.2 蛋白酶實(shí)驗(yàn)

蛋白酶K酶液（20 mg/mL）與離心后的上清液按1∶20比例混合，45 ℃水浴30 min后取出，對(duì)照組為不加蛋白酶K、45 ℃水浴30 min的上清液，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑[15]。

1.3.3 菌株DNA提取

將枯草芽孢桿菌SNBS-3培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取后的DNA純度和濃度[16-17]。

1.3.4 全基因組測(cè)序

本次測(cè)序委托上海美吉生物科技有限公司完成。樣本質(zhì)檢合格后，采用二代測(cè)序技術(shù)和第三代高通量測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序分析，原始數(shù)據(jù)的接頭去除及低質(zhì)量序列等工作使用質(zhì)量統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 基因組組裝

基于三代測(cè)序數(shù)據(jù)，使用軟件Unicycler v 0.4.8進(jìn)行組裝，組裝過(guò)程中會(huì)借助Pilonjin v1.22軟件進(jìn)行序列校正，得到初步組裝結(jié)果，使用SOAPdenovo2軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)一步校正，得最終組裝結(jié)果[18-19]。

1.3.6 基因預(yù)測(cè)

通過(guò)GeneMarkS軟件對(duì)基因組中的編碼序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用tRNAscan-SE v2.0和Barrnap軟件分別對(duì)基因組中tRNA和rRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得基因組中tRNA和rRNA序列信息[20-22]。

1.3.7 基因組圈圖繪制

將測(cè)序得到的基因組序列、編碼基因預(yù)測(cè)及非編碼RNA等信息文件組裝成GBK文件，通過(guò)CGView軟件繪制單個(gè)樣本基因組圈圖，全面展示測(cè)序基因組特征[23]。

1.3.8 基因功能分析

預(yù)測(cè)的編碼蛋白序列分別與COG、GO、KEGG、CAZyme數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白序列進(jìn)行BLAST比對(duì)和注釋。預(yù)測(cè)的基因組序列分別與CARD進(jìn)行序列比對(duì)，完成耐藥基因分析。預(yù)測(cè)的氨基酸序列與VFDB進(jìn)行比對(duì)，完成毒力基因注釋結(jié)果[24-29]。

1.3.9 抑菌物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

應(yīng)用在線軟件AntiSMASH和Bagel4對(duì)菌株SNBS-3全基因組中抑菌物質(zhì)合成基因簇進(jìn)行挖掘，參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)[30-31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的體外抑菌效果

由圖1可知，枯草芽孢桿菌上清液中的抑菌物質(zhì)對(duì)6 種指示菌均有影響，其中對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果比革蘭氏陰性菌效果更好，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最好。

圖1 枯草芽孢桿菌SNBS-3體外抑菌實(shí)驗(yàn)Fig.1 In vitro antimicrobial activity of B.subtilis SNBS-3

2.2 蛋白酶對(duì)枯草芽孢桿菌上清液抑菌能力的影響

由表1可知，枯草芽孢桿菌SNBS-3上清液經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理前后對(duì)6 種指示菌的抑制能力下降較大，均超過(guò)50%，說(shuō)明上清液含有的抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)或肽類(lèi)。

表1 蛋白酶對(duì)上清液抑菌能力的影響Table 1 Effect of protease on the antibacterial activity of the fermentation supernatant of B.subtilis SNBS-3

2.3 基因組組成與信息

由圖2可知，枯草芽孢桿菌SNBS-3的基因組為一條環(huán)狀閉合DNA，大小為4 076 387 bp，共預(yù)測(cè)到4 000 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、86 個(gè)tRNA基因、30 個(gè)rRNA基因、91 個(gè)sRNA。由圖3可知，基因平均長(zhǎng)度為897.02 bp，最短基因長(zhǎng)度為90 bp，最長(zhǎng)基因長(zhǎng)度為16 545 bp，長(zhǎng)度大于等于500 bp的基因有2 815 個(gè)，長(zhǎng)度大于等于1 000 bp的基因有1 328 個(gè)；串聯(lián)重復(fù)序列為34 個(gè)，重復(fù)比例為0.8%；散在重復(fù)序列為35 個(gè)，重復(fù)比例為0.07%。

圖2 枯草芽孢桿菌SNBS-3基因組圖Fig.2 Genome map of B.subtilis SNBS-3

圖3 枯草芽孢桿菌SNBS-3基因長(zhǎng)度圖Fig.3 Lengths of genes from B.subtilis SNBS-3

2.4 基因功能注釋

2.4.1 COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

將菌株SNBS-3基因組中的蛋白編碼基因在COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)灿? 209 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因得到注釋?zhuān)Y(jié)果如圖4所示。

圖4 枯草芽孢桿菌SNBS-3 COG注釋分類(lèi)Fig.4 Classification of COG annotations of B.subtilis SNBS-3

由圖4可知，注釋結(jié)果共有20 類(lèi)，分別有1、172、34、302、80、255、103、97、159、260、124、196、39、103、196、67、859、127、32、54 個(gè)基因注釋分類(lèi)到B～V。其中未知功能基因最多，共859 個(gè)，占注釋基因總數(shù)的26.77%，接下來(lái)注釋基因數(shù)量較多的功能分類(lèi)依次：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（E）302 個(gè)（占比9.41%）、轉(zhuǎn)錄（K）260 個(gè)（占比8.1%）、碳水化合物運(yùn)輸和代謝（G）255 個(gè)（占比7.95%）、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/細(xì)胞被膜（M）和無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（P）各占196 個(gè)（占比6.11%）。

2.4.2 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

將菌株SNBS-3基因組中的氨基酸序列與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，共有2 824 個(gè)功能基因得到注釋?zhuān)Y(jié)果如圖5所示。

圖5 枯草芽孢桿菌SNBS-3 GO注釋分類(lèi)Fig.5 Classification of GO annotations of B.subtilis SNBS-3

由圖5可知，2 258、1 645 個(gè)和1 638 個(gè)功能基因分別注釋到分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組分。在分子功能中，分類(lèi)到ATP結(jié)合和DNA結(jié)合功能基因占比最多，分別為324 個(gè)（占比8.1%）和283 個(gè)（占比7.08%）。在生物過(guò)程中，分類(lèi)到細(xì)胞孢子的產(chǎn)生與形成和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板化功能基因占比最多，分別為172 個(gè)（占比4.3%）和108 個(gè)（占比2.7%）。在細(xì)胞組分中，分類(lèi)到膜整體組件和質(zhì)膜功能基因占比最多，分別為809 個(gè)（占比20.73%）和587 個(gè)（占比14.68%）。

2.4.3 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

由圖6可知，注釋結(jié)果顯示共有2 560 個(gè)基因在KEGG途徑中富集到細(xì)胞過(guò)程、新陳代謝、人類(lèi)疾病、遺傳信息處理、有機(jī)系統(tǒng)和環(huán)境信息處理五大功能中，共計(jì)42 條代謝通路。其中注釋到新陳代謝的相關(guān)基因最多，共計(jì)1 780 個(gè)，其次依次為環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程、人類(lèi)疾病和有機(jī)系統(tǒng)，相關(guān)基因依次為300、191、150、93 個(gè)和46 個(gè)。

圖6 枯草芽孢桿菌SNBS-3 KEGG注釋分類(lèi)Fig.6 Classification of KEGG annotations of B.subtilis SNBS-3

2.4.4 CAZyme數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

將菌株SNBS-3中基因組數(shù)據(jù)與CAZyme數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)基因組中共有147 個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)儆贑AZyme家族，注釋結(jié)果如表2所示。

表2 枯草芽孢桿菌SNBS-3 CAZyme注釋結(jié)果Table 2 Results of CAZyme annotations of B.subtilis SNBS-3

由表2可知，糖苷水解酶最多，其次分別為糖基轉(zhuǎn)移酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶、氧化還原酶和碳水化合物結(jié)合域。在糖苷水解酶中，纖維素酶基因（GH5家族基因）共有1 個(gè)，淀粉酶基因（GH13家族基因）有8 個(gè)。

2.4.5 CARD注釋

CARD是目前使用最為廣泛、包含最為全面的細(xì)菌耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)CARD數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)詉dentity≥80%為條件，CARD注釋結(jié)果如表3所示。菌株SNBS-3的基因組有耐藥基因12 個(gè)，其中ykkC、blt、bmr、ykkD、vmlR基因具有多重耐藥性，含有多個(gè)耐藥受體，推測(cè)SNBS-3可能具有一定耐藥性。

表3 枯草芽孢桿菌SNBS-3 CARD注釋結(jié)果Table 3 Results of CARD annotations of B.subtilis SNBS-3

2.4.6 VFDB注釋

將菌株SNBS-3中基因組數(shù)據(jù)與VFDB進(jìn)行比對(duì)分析，以identity≥70%作為篩選條件，結(jié)果如表4所示。基因組中共發(fā)現(xiàn)有4 個(gè)毒力因子。其中clpC毒力基因與細(xì)菌黏附相關(guān)[32]，clpP毒力基因與菌株生長(zhǎng)代謝相關(guān)[33]，bslA和capsule兩個(gè)毒力基因的功能注釋未知，還有待研究。

表4 枯草芽孢桿菌SNBS-3 VFDB注釋結(jié)果Table 4 Results of VFDB annotations of B.subtilis SNBS-3

2.5 抑菌物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

通過(guò)在線軟件AntiSMASH和Bagel4挖掘發(fā)現(xiàn)SNBS-3產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)信息如表5所示，其細(xì)菌素合成基因簇如圖7所示。由表5可看出，枯草芽孢桿菌SNBS-3可能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)Subtilosin A、Surfactin、Plipastatin、Mycosubtilosin、Bacilysin、Bacillaene。由圖7可知，SNBS-3具有完整合成Subtilosin A基因簇。其中sboA是編碼細(xì)菌素Subtilosin A結(jié)構(gòu)基因，翻譯后的前體結(jié)構(gòu)沒(méi)有抑菌活性，需經(jīng)切割加工為成熟蛋白才有活性[34]。albA對(duì)Subtilosin A前體翻譯后進(jìn)行修飾，起到結(jié)合金屬離子和酶輔因子的作用。albB、albC和albD對(duì)菌株起到保護(hù)作用，抵御自身分泌的細(xì)菌素和環(huán)境中的抗菌劑的作用[35-36]。albE、albF和albG負(fù)責(zé)調(diào)控Subtilosin A的合成，與Subtilosin A產(chǎn)量有關(guān)[37]。通過(guò)前期抑菌實(shí)驗(yàn)和蛋白酶K實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，上清液抑菌能力下降原因可能是Subtilosin A或其他多肽類(lèi)抑菌物質(zhì)被蛋白酶K分解失去活性，而剩下的抑菌活性為不受蛋白酶K影響的其他抑菌物質(zhì)保留的，因此枯草芽孢桿菌SNBS-3具有合成包括細(xì)菌素在內(nèi)的多種抑菌物質(zhì)的能力，具有生防菌的潛力。

表5 抑菌物質(zhì)相關(guān)基因及其功能注釋匯總Table 5 Summary of genes related to bacteriostatic substances and their function annotations

圖7 細(xì)菌素合成基因簇Fig.7 Gene cluster for bacteriocin synthesis

3 討論與結(jié)論

目前，作為一項(xiàng)高效檢測(cè)技術(shù)，全基因組測(cè)序已廣泛應(yīng)用于芽孢桿菌抑菌物質(zhì)預(yù)測(cè)與挖掘。Johny等[38]對(duì)從海洋中分離的貝萊斯芽孢桿菌FTL7進(jìn)行全基因組測(cè)序，證明了其具有產(chǎn)生細(xì)菌素的能力并闡明了其抑菌機(jī)制。Dindhoria等[39]對(duì)地衣芽孢桿菌MCC 2514進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該菌株具有多種脂肽和細(xì)菌素的基因簇，具有一定防腐的能力。Iqbal等[40]對(duì)從土壤中分離得到具有抗菌活性的矮芽孢桿菌SF-4進(jìn)行測(cè)序和分析，獲得與功能多樣性、進(jìn)化和生物合成潛力相關(guān)基因組的同時(shí)，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)到菌株基因組內(nèi)多種抑菌物質(zhì)合成基因簇。

本研究通過(guò)全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)S N B S-3 含有Surfactin、Mycosubtilosin、Plipastatin、Bacilysin、Bacillaene和Subtilosin A等多種抑菌物質(zhì)的基因簇。這些抑菌物質(zhì)在芽孢桿菌或其他菌株均有相關(guān)報(bào)道，其中Surfactin是目前已知的表面活性最強(qiáng)的生物表面活性劑之一，可有效破壞細(xì)菌的生物膜[41]；Mycosubtilin是一種由非核糖體合成的Iturin家族脂肽，Yu Chenjie等[42]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌ATCC6633中產(chǎn)生的Mycosubtilin對(duì)引起谷物作物疾病的稻谷鐮刀菌和黃萎病鐮刀菌具有良好抑制作用。Plipastatin是Fengycin家族脂肽，參與抑制磷脂酶A2和生物膜的形成，可有效抑制常見(jiàn)食源性致病菌[43]。Bacilysin是一種由芽孢桿菌產(chǎn)生的二肽抑菌物質(zhì)，其可通過(guò)抑制葡萄糖胺6-磷酸合酶而發(fā)揮對(duì)革蘭氏陰性食源性致病菌的抑制效果[44]。Bacillaene是一種多烯抗生素，通過(guò)抑制蛋白合成發(fā)揮作用，本身對(duì)光、溫度、氧氣等因素十分敏感[45]。細(xì)菌素Subtilosin A是一種由核糖體合成的抑菌物質(zhì)，Guo Yaoqi等[46]發(fā)現(xiàn)Subtilosin A對(duì)多種細(xì)菌具有殺菌活性，在食品保鮮方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。以上結(jié)果表明，通過(guò)全基因組測(cè)序推測(cè)SNBS-3產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)較多，種類(lèi)廣泛，具有良好的生防潛力。

綜上，本研究對(duì)具有良好抑菌能力的枯草芽孢桿菌SNBS-3進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過(guò)與多種數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其基因組為一條環(huán)狀閉合DNA，大小為4 076 387 bp，GC含量為43.82%，預(yù)測(cè)共有4 000 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、86 個(gè)tRNA基因、30 個(gè)rRNA基因和91 個(gè)sRNA基因。應(yīng)用AntiSMASH和Bagel4在線分析軟件，快速且準(zhǔn)確地從基因?qū)用骖A(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌SNBS-3產(chǎn)抑菌物質(zhì)及其細(xì)菌素Subtilosin A的合成基因簇。解析SNBS-3基因組的同時(shí)也有助于未來(lái)實(shí)現(xiàn)Subtilosin A的異源表達(dá)，降低細(xì)菌素的生產(chǎn)成本，提高菌株在食品防腐和生物防治方面的應(yīng)用價(jià)值。