乳酸菌消除不同特點酵母抽提物中酵母味分析

仇 帥，利佳煒，馬春蕾,，李 沛，陳 雄，李 欣,*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，工業發酵省部共建協同創新中心，發酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業微生物重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司 酵母功能湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443000）

酵母抽提物是在酵母酶或附加食品級酶的共同作用下，通過酶水解和自溶得到的產物[1]，它含有豐富的氨基酸、肽、多肽等可溶性成分[2]。酵母抽提物也是一種天然的營養鮮味劑和增味劑，被廣泛用作調味劑[3-4]。然而酵母提取物中的酵母風味并沒有得到普遍接受，這在一定程度上影響了酵母提取物的廣泛應用[5]。許多研究表明，酵母抽提物中的酵母風味主要由揮發性風味化合物引起，如甲酚、吲哚、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、正辛醛、苯乙烯、鄰二甲苯、糠醇、3-甲基吡啶[6-12]等。酵母抽提物中酵母風味的強弱與微生物種類、水解程度和產品形態有關[13]，復雜的水解過程和粉末狀會導致酵母浸膏的酵母風味更強[14]。在過去，除了對工藝進行適當的調整和優化（如熱處理、高壓均質化、添加氨基酸和銨鹽）[15-18]，以減少酵母風味的形成，還可以添加一些有機溶劑（乙酸乙酯、氯仿和石油醚）掩蓋氣味，并使用熱處理（100～140 ℃高壓處理1 h）除臭[19]，但效果并不大，且操作復雜、不經濟、不衛生。作為一種新的探索，基于乳酸菌和酵母的混合發酵體系被建立，并有效地應用于酵母提取物FG10[20]。

乳酸菌作為一種益生菌，被廣泛應用于各種發酵食品的生產中[21-23]。不同的產品使用不同的乳酸菌，如植物乳桿菌主要用于乳制品，乳酸鏈球菌和乳酸乳球菌主要用于奶酪[24-27]。可見乳酸菌的特性需要與原料相匹配才能發揮其功能，此外乳酸菌還可以作為食品發酵劑[28]，因此可應用于去除酵母味。

本研究將乳酸乳球菌和乳酸鏈球菌混合生物轉化體系（LactococcuslactisandStreptococcuslactisbiotransformation system，LSBT）應用于不同類型的酵母抽提物（FG10、FM88、FA31、KU012、FIG12LS、F58、FGI03和KA02），并對其風味、感官和代謝成分進行分析比較。評價LSBT對多種型號酵母抽提物去除酵母風味和提高品質的效果及差異，旨在為后期開發更多無酵母風味的酵母抽提物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株為乳酸鏈球菌AL03和乳酸乳球菌CICC 23609分別來自功能酵母與釀造實驗室和中國工業微生物菌種保藏管理中心；8 種酵母抽提物的型號分別是FG10、FM88、FA31、KU012、FIG12LS、F58、FGI03和KA02，均來自安琪酵母股份有限公司。

蛋白胨、牛肉浸膏、吐溫-80、三水磷酸氫二鉀、乙酸鈉、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、蔗糖、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫銨 國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、檸檬酸三銨、鄰二氯苯、乙酸苯乙酯 上海麥克林生化科技有限公司；瓊脂粉 武漢市華順生物科技有限公司；甲醇 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；輕質碳酸鈣 福建浦城綠康生化有限公司；氯仿 北京蘭杰柯科技有限公司；酵母粉 安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-150D型恒溫生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；CJ-2D型無菌操作臺 天津市泰斯特儀器有限公司；HNY-211B恒溫培養振蕩器天津市歐諾儀器儀表有限公司；7890B氣相色譜-氫火焰電離檢測器、DB-5毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、HP-INNOWAX柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、HP6890/5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀、Adalink C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美國賽默飛世爾科技公司；Purelab Option-Q超純水系統 威立雅水處理技術（上海）有限公司；S-10生物傳感分析儀 深圳市希爾曼科技有限公司；Delta320 pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器公司；57330-U Supelco固相微萃取手動手柄 廣州市錦卓儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及培養條件

首先，從冰箱－80 ℃保存的甘油管中分別取出1 mL乳酸乳球菌和乳酸鏈球菌菌液接種到裝有50 mL MRS培養基[29]的三角瓶中，在37 ℃、150 r/min恒溫培養振蕩器中培養24 h，然后再取2.5 mL培養后的菌液轉移到新的種液培養基中進行二級活化，得到種子液。

1.3.2 發酵培養基及發酵條件

以酵母抽提物為主要營養成分，轉化發酵培養基成分為酵母抽提物50 g/L、蔗糖30 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L。用0.1 mol/L NaOH溶液將pH值調至7.00±0.05后于115 ℃高壓滅菌20 min。

發酵體系為LSBT，活化培養基為MRS。兩種菌接種方式為同步接種，且接種比為1∶1。接種量控制為二級活化種子菌液OD600nm在0.2左右接入發酵培養基中。

發酵條件參數為：裝液量50 mL/250 mL、發酵溫度30 ℃、發酵轉速200 r/min、發酵周期24 h，取樣點0、6、12、24 h。

1.3.3 感官評價

感官評價由湖北工業大學功能酵母與釀酒微生物團隊10 名感官評價員完成（其中男5 名、女5 名，年齡均在20～30 歲之間），均在感官室（室溫（25±2）℃）[30]中接受過培訓，并在酵母提取物的感官評價方面有1 a以上的經驗。經過鍛煉后感官評價員共同提出了對酵母提取物的特性描述[31]，感官評定結果主要為異味、酸味、酵母味、發酵醬味。根據GB 10221.4—2012《感官分析詞匯》[32]建立了一套評價標準，評價員采用10 分制（0～3 分：弱；4～6 分：中；7～10 分：強）通用強度量表表征嗅覺等級的強度。所有的樣品都由10 名評估員打分，一式3 份，并將其平均值作為風味感官評估的最終結果。

1.3.4 風味物質測定

樣品處理方法：在頂空瓶中加入轉子和1.5 g氯化鈉，吸取發酵液5 mL，最后加入1 μL內標鄰二氯苯，密封后將頂空瓶置于50 ℃的恒溫磁力攪拌器中旋轉加熱孵化30 min后，再將萃取纖維頭（Supelco 57330-U、Supelco 57348-U SPEM Fiber Assembly 50/30 μm；Stableflex 2 cm；24 ga）插入頂空瓶中，萃取30 min。萃取完后，將萃取纖維頭插入氣相色譜儀進樣口解吸5 min[33]，然后進行氣相色譜-質譜分析。

氣相色譜條件：色譜柱采用HP-INNOWAX 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），以高純度He（99.999%）為載氣，柱流速為15 mL/min。初始溫度為40 ℃，保持2 min。然后以2 ℃/min速率升到150 ℃，再以10 ℃/min速率升到250 ℃，保持2 min。氣化室溫度為250 ℃。

質譜條件：質譜的離子源溫度為230 ℃，電子電離模式，四極桿溫度為150 ℃，電子能量為70.007 eV，激活電壓為1.6 V，質譜掃描模式為49～500 Da[34]。

1.3.5 pH值、乳酸、谷氨酸、核苷酸測定

pH值用pH計測定；乳酸和谷氨酸的測定采用S-10生物傳感分析儀；核苷酸（肌苷酸＋鳥苷酸）的測定參照GB/T 23530—2009《酵母抽提物》[35]。采用高效液相色譜、254 nm二極管陣列檢測器和Adalink C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以95% 0.1 mol/L NH4H2PO4溶液和5%甲醇溶液為流動相，流速0.5 mL/min進行30 min等速洗脫。樣品用0.45 μm微孔水膜過濾稀釋。

1.3.6 氨基酸的測定

樣品處理方法：500 μL發酵上清液中加入45 μL 7 mol/L的NaOH溶液，再加入500 μL無水乙醇與吡啶的混合液（4∶1，V/V），振蕩均勻；加入100 μL氯甲酸乙酯（ethyl chloroformate，ECF），超聲波處理1 min后，再加入100 μL ECF，超聲波處理1 min；加入500 μL含5 μL氯甲酸乙酯和50 μL內標（0.2%乙酸苯乙酯）的氯仿溶液及200 μL飽和NaHCO3溶液，劇烈振蕩1 min，3 000 r/min離心5 min；取下層溶液至已添加無水Na2SO4的2 mL離心管中，3 000 r/min離心1 min[36]。

采用氣相色譜-氫火焰電離檢測器和DB-5毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）測定氨基酸含量。柱溫箱設置為70 ℃，持續5 min，然后以5 ℃/min速率上升至280 ℃，持續5 min，進樣口溫度設置為280 ℃，探測器溫度設置為300 ℃，采用高純度He（99.999%）作為載氣。

1.4 數據分析

每個實驗進行3 次平行重復。通過比較標準品和樣品中物質的保留時間，完成代謝物的定性測定。定量分析中，風味物質和氨基酸采用內標法，核苷酸采用外標法。圖像制作使用Origin軟件，使用SPSS Statistics 23.0軟件確定差異顯著性，進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 感官評價

8 種酵母抽提物在LSBT轉化過程中，根據酵母味的輕重其感官評價可大致分為3 類。第一類是在去除酵母味的同時還能形成良好風味的酵母抽提物（簡稱SE-I），包括FG10和FM88兩種（圖1a、b）。FG10發酵結束后具有良好的發酵醬風味的同時還具有微弱的酸味，但FM88發酵結束后酸味明顯高于發酵醬風味；第2類是能去除酵母味但未形成良好風味的酵母抽提物（簡稱SE-II），包括FA31、KU012和FIG12LS 3 種（圖1c、d、e）；第3類的感官評價最差（圖1f、g、h），包括F58、FIG03和KA02 3 種酵母抽提物（簡稱SE-III），酵母味依然存在。KA02型號酵母抽提物中酵母味并未除，甚至發酵結束后酵母味加重，而FM58和FIG03兩種型號酵母抽提物會產生異味。由此可見，在同一種發酵體系條件下，不同型號酵母抽提物中酵母味的去除效果與原料有關。此外，不同型號酵母抽提物去除酵母味所需時間存在差異。FG10、FM88、KU012、FIG12LS、F58這5 種型號酵母抽提物在24 h轉化效果最好，剩余3 種型號酵母抽提物FA31、FIG03和KA02在12 h轉化效果最好。可見，除原料差異外，轉化時間也是處理酵母抽提物時必須關注的關鍵參數之一。為進一步研究轉化差異的來源，選取8 種型號酵母抽提物感官評價各自最佳的時間點做代謝產物分析，即FG10、FM88、FA31、KU012、FIG12LS、F58、FIG03、KA02的最佳時間點分別為24、24、12、24、24、24、12、12 h。

圖1 8 種酵母抽提物在LSBT轉化過程中的感官評價Fig.1 Sensory evaluation of eight yeast extracts treated with LSBT for different durations

2.2 揮發性風味物質差異分析

圖2為8 種型號酵母抽提物在LSBT發酵最佳時間點的揮發性風味化合物質量濃度。經LSBT處理過的8 種型號酵母抽提物之間揮發性風味化合物具有明顯差異。在酵母味風味物質中，SE-I和SE-II這兩類中均不含有吲哚（糞臭味）。SE-I類只存在兩種酵母味物質，分別是丙酸和異戊酸。SE-II類中的3 種酵母抽提物的酵母味物質種類各不相同。FA31含有4 種酵母味物質，分別為丙酸、丁酸、異丁酸和異戊酸，且異戊酸質量濃度在8 種酵母抽提物中最高，為（11.12±0.14）ng/mL。KU012只含有異戊酸這一種酵母味物質，FIG12LS含有丙酸和異戊酸兩種酵母物質。在SE-III類中，F58和KA02中含有吲哚，同時，KA02在8 種型號酵母抽提物中含酵母味類物質種類最多（丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和吲哚）。

圖2 LSBT下8 種酵母提取物最佳時間點風味熱圖Fig.2 Heatmap of the flavor contents of eight yeast extracts with optimal duration of LSBT treatment

對非酵母味物質而言，SE-I、SE-II類中的含量相對較高，其中乙偶姻的占比很大（KU012除外）。FG10和FM88（SE-I類）均出現6 種新的風味物質，共有的物質是苯乙醇、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和乙偶姻，而2,3-丁二醇為FG10特有。在SE-II類中，KU012的非酵母風味物質種類在8 種酵母抽提物中最少，且含量也不高，FIG12LS中乙偶姻質量濃度在8 種酵母抽提物中最高，為（39.73±0.32）ng/mL。對SE-III類而言，3 種酵母抽提物均形成不少于5 種非酵母味物質，其中，KA02中的吡嗪類物質在8 種酵母抽提物中含量最高。

總體來看，感官評定受到酵母味物質和非酵母味物質含量和種類的雙重影響。感官評價不好的F58和KA02兩種酵母抽提物都存在具有糞臭味的吲哚，其中KA02型號酵母抽提物發酵后吡嗪類物質占比最大，占總風味物質的71.22%，這也可能是導致酵母味加重的主要原因。轉化后的FG10和FM88不含有吲哚，且FG10中乙偶姻（奶油香）占其總風味物質含量的62.87%。沒有吲哚產生和特定風味物質比例增加是LSBT有效轉化的基礎。

2.3 乳酸和pH值分析

經LSBT轉化過的不同型號酵母抽提物中乳酸含量具有差異，從圖3a可知，FM88、FA31、KU012和FIG12LS 4 種型號酵母抽提物發酵后乳酸生成量較高，為12.00 g/L左右。FG10、FIG03和KA02 3 種型號酵母抽提物發酵后乳酸生成量中等，為10.00 g/L左右；F58型號酵母抽提物發酵后的乳酸生成量最低，為（7.47±0.10）g/L。結合感官評價結果，SE-I和SE-II類中的乳酸質量濃度都高于10.00 g/L，而SE-III類中的質量濃度低于10.00 g/L。可見，經LSBT轉化后的酵母抽提物中的乳酸質量濃度的閾值有可能在10.00 g/L左右。

圖3 8 種酵母提取物在LSBT條件下最佳時間點的乳酸含量（a）和pH值（b）Fig.3 Lactic acid contents (a) and pH (b) of eight yeast extracts with optimal duration of LSBT treatment

從圖3b可知，F58酵母抽提物（SE-III類）pH值最低，為3.94±0.01，且乳酸含量最低；FIG03型號酵母抽提物的pH值最高，為4.38±0.02，但乳酸含量并不是最高。因此，pH值并不是單一由乳酸的含量決定，還受發酵體系中各種成分的綜合影響。

綜上可知，不同型號酵母抽提物在同一發酵體系中，乳酸的生成能力不同，其中F58型號酵母抽提物生成能力最弱，FM88型號酵母抽提物生成能力最強。乳酸含量不足可能無法達到消除酵母味的效果，因此一定量的乳酸含量有助于消除酵母味。

2.4 谷氨酸、核苷酸分析

谷氨酸、肌苷酸和鳥苷酸是重要的呈味物質[37]。如圖4所示，經LSBT發酵后，最佳時間點下的8 種酵母抽提物之間的谷氨酸和核苷酸含量差異均較大。FM88（SE-I）和KU012（SE-II）中的谷氨酸質量濃度最高，為4.00 g/L左右，而FA31（SE-II）中的谷氨酸質量濃度最低，為（0.35±0.07）g/L。從圖4b可知，FIG12LS（SE-II）的核苷酸含量最高，肌苷酸和鳥苷酸的總質量濃度達（3.59±0.11）g/L，其次為KU012（（2.69±0.09）g/L）。剩余6 種酵母抽提物（FG10、FM88、FA31、F58、FIG03和KA02）的核苷酸質量濃度均低于1.00 g/L，其中F58型號酵母抽提物核苷酸總含量最低，為0.02 g/L。需要注意的是，谷氨酸和核苷酸含量與LSBT消除酵母味的效果并沒有直接關聯。SE-I（FG10和FM88）的谷氨酸和核苷酸含量并不是最高，而SE-III（F58、FIG03、KA02）中的兩者含量也不是最低。

圖4 8 種酵母提取物在LSBT條件下最佳時間點的谷氨酸（a）和核苷酸（b）含量Fig.4 Glutamic acid (a) and nucleotide (b) contents in eight yeast extracts with optimal duration of LSBT treatment

2.5 風味前體氨基酸變化分析

如圖5所示，LSBT體系對不同酵母抽提物不同氨基酸的影響差異巨大。對苯丙氨酸而言，LSBT體系對FM88的消耗最多（（866.72±5.79）mg/L），但會導致FIG03積累最多（（279.43±3.84）mg/L）。對天冬氨酸而言，LSBT的處理導致KU012消耗了（54.62±2.39）mg/L，而FG10積累了（238.48±3.47）mg/L。LSBT使KA02中的亮氨酸被大量消耗（（285.88±1.68）mg/L），但在FA 31 中被積累（（66.56±2.69）mg/L）。FM 88 是LSBT 所消耗異亮氨酸最多的酵母抽提物（（552.72±4.70）mg/L），而積累最多的酵母抽提物是F58（（80.42±2.00）mg/L）。LSBT處理會導致FA31積累最多的纈氨酸（（54.23±2.00）mg/L）和蘇氨酸（（25.57±3.02）mg/L），而消耗纈氨酸和蘇氨酸最多的酵母抽提物分別是KA02（（206.78±3.56）mg/L）和FIG03（（167.70±2.27）mg/L）。

圖5 6 種風味氨基酸在LSBT條件下最佳時間點的含量差Fig.5 Differences in concentrations of six flavor amino acids before and after optimal period of treatment with LSBT

與谷氨酸和核苷酸相似，雖然氨基酸是重要的風味前體物和調味料中的重要組分之一，但氨基酸的變化與LSBT消除酵母味能力沒有直接和緊密的關聯。比如，在SE-I中，除亮氨酸是相同的變化趨勢外，FG10中的氨基酸都被積累，而FM88中氨基酸都被消耗。唯一值得關注的氨基酸是蘇氨酸，在SE-III類中都被大量消耗。鑒于前述分析，原料差異可能在LSBT中具有十分重要的影響。

2.6 8 種型號酵母抽提物的化學成分差異

8 種型號酵母抽提物總共檢測到3 種酵母味風味物質分別為丙酸、異戊酸和正辛醛（表1）。丙酸在8 種酵母抽提物中都存在，異戊酸只有FIG12LS型酵母抽提物中沒有，正辛醛只在KU012、FIG12LS、KA02 3 種型號酵母抽提物中出現。結合感官評價可知，酵母抽提物中丙酸的含量高于3.00 ng/g時，將會呈現出較重的酵母味；低于3.00 ng/g時，呈現出輕的酵母味。FG10（SE-I）和KA02（SE-III）酵母抽提物中酵母味含量較高，分別為（17.70±2.48）ng/g和（12.79±1.54）ng/g，而FIG12LS（SE-II）中只含有（2.12±0.61）ng/g。可見，不同型號酵母抽提物的酵母味物質種類和含量均有差異，且酵母味濃度和酵母味風味物質的種類多少并不是影響LSBT轉化效果的關鍵因素，但低水平的酵母味物質有利于消除酵母味。

表1 不同類型酵母提取物中酵母味風味物質含量Table 1 Contents of yeasty flavor substances in different yeast extracts ng/g

與酵母味物質相似，不同型號酵母抽提物的風味前體氨基酸和呈鮮味物質含量均具有明顯的差異（表2）。氨基酸總含量最高的酵母抽提物是FM 88，為（163.69±6.39）mg/g，其次是KU012，為（112.92±4.56）mg/g；但FA31中只含有（24.93±3.97）mg/g。與各種氨基酸相比，呈味物質谷氨酸在8 種酵母抽提物中的占比都是最高的。FIG12LS中核苷酸總含量最高（（71.83±4.73）mg/g），而FA31中核苷酸總含量僅為FIG12LS的2.66%。結合感官評價結果可知，FA31、KU012和FIG12LS 3 種酵母抽提物的酵母味評分相同，因此酵母味的輕重與6 種風味前體氨基酸總量和核苷酸總量之間沒有直接關聯。重要的是，SE-III類的酵母抽提物（F58、FIG03、KA02）中都不含天冬氨酸，且蘇氨酸含量也相對于其他型號酵母抽提物較高。這表明這兩種氨基酸可能對LSBT轉化有重要的影響。

表2 不同酵母菌提取物中風味前體氨基酸和鮮味物質的含量Table 2 Contents of flavor precursor amino acids and umami substances in different yeast extracts mg/g

3 結論

本實驗評價了乳酸菌復合發酵技術應用于不同型號酵母抽提物中的酵母味去除效果，探究了該技術的適應性和應用規律。8 種酵母抽提物中的5 種經乳酸菌復合發酵處理后不再具有酵母味，而且FG10和FM88還具有發酵醬風味。發酵后不同酵母抽提物之間的風味化合物具有較大的差異。沒有吲哚產生是LSBT轉化消除成功的關鍵之一。作為乳酸菌的典型產物，轉化后的酵母抽提物中乳酸需要達到一定水平（不低于10.00 g/L）。同時，發酵液中谷氨酸、核苷酸和氨基酸的含量與LSBT消除酵母味的效果沒有直接的關聯。然而，原料差異在LSBT轉化中十分重要。雖然原料中酵母味濃度和酵母味風味物質的種類多少并不是影響LSBT轉化效果的關鍵因素，但天冬氨酸的缺失和過高濃度蘇氨酸卻很可能是乳酸菌體系轉化不成功的原因。原料差異所導致的營養不同使得轉化體系中兩種乳酸菌的相互作用和代謝發生改變。總體而言，LSBT適應大多數酵母抽提物，但針對某些特定的酵母抽提物，如F58、FIG03和KA02，還需要探索其他微生物組合技術和/或發酵條件。