褐藻膠的酶法降解及其產物的體外免疫活性

章 倩，戚慧敏，卞 斌，馬俊美，賴晨歡，黃曹興，凌 喆，勇 強

（南京林業大學 江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京 210037）

褐藻膠低聚糖（alginate oligosaccharides，AOS）是由α-L-古羅糖醛酸與β-D-甘露糖醛酸通過β-1,4糖苷鍵連接而成的聚合度為2～20的嵌段化合物[1]。AOS由于具有安全無毒、分子質量小和水溶性好等優點[2]，越來越受到人們的關注。AOS的制備方法主要有氧化降解法、酸降解法和褐藻膠裂解酶降解法等，其中酶法降解因條件溫和、產物聚合度可控性較強和褐藻膠降解效率高等優點，逐漸成為制備AOS的主要方法[3]。目前，酶法制備AOS是利用褐藻膠裂解酶的β-(1,4)-消除反應對褐藻膠進行降解[4]，并在非還原端產生不飽和雙鍵[5]；同時，不飽和褐藻膠降解產物在非酶作用下繼續轉化為4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸[6]。由于褐藻膠裂解酶對褐藻膠主鏈的降解作用是隨機的，因而同時產生分子質量不等的褐藻膠降解產物，但酶法降解過程中不同分子質量降解產物的得率變化目前鮮有文獻報道。

AOS具有豐富的生理活性，如免疫調節、抗腫瘤[7]和抗氧化[8]等，將海藻多糖轉化為高活性的海藻低聚糖是海藻資源精深加工的重要研究方向之一。有研究表明，AOS的生理活性與其制備方式、β-D-甘露糖醛酸與α-L-古羅糖醛酸比例[9]等相關，且AOS分子質量可能是影響其活性的重要因素。AOS被證實可通過促進RAW264.7巨噬細胞中誘導型一氧化氮合酶的表達從而誘導NO的生成，并促進多種免疫細胞因子的分泌，進而提高宿主免疫水平[10]。研究證明AOS分子構象和分子質量可能是影響其誘導細胞因子活性的重要因素，然而，關于不同分子質量褐藻膠降解產物的免疫活性鮮見系統研究[11]。

本研究采用商品褐藻膠裂解酶對褐藻膠進行降解，利用乙醇沉淀法對其不同分子質量的酶解產物進行分級分離，并通過單因素試驗優化酶法制備AOS的工藝參數。同時，分析酶解過程中不同分子質量降解產物得率的變化情況。最后，在巨噬細胞體外模型上進行不同分子質量酶降解產物的免疫活性評價，以期為酶法降解褐藻膠的工藝研究以及褐藻膠降解產物的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商品褐藻膠、商品褐藻膠裂解酶（酶活力10 000 units/g）上海麥克林生化科技有限公司。

小鼠巨噬細胞RAW264.7 中國科學院上海生物科學研究所；DMEM培養基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、胰酶 美國Hyclone公司；細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、鏈霉素、青霉素、二甲基亞砜 美國Sigma-Aldrich公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）、一氧化氮檢測試劑盒 上海碧云天生物公司；小鼠白介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒浙江聯科生物公司；小鼠Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）ELISA試劑盒 江蘇酶標生物科技有限公司；TAK-242 美國MedChemExpress LLC公司；乙酸銨、氫氧化鈉、鹽酸、四硼酸鈉、咔唑等其他常規試劑（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

DMEM完全培養基：向基礎培養基中添加胎牛血清（10%，V/V）、鏈霉素（100 units/mL）和青霉素（100 units/mL），配成完全培養基；DMEM基礎培養基：將褐藻膠酶解產物固體粉末溶解于DMEM基礎培養基中，配制成40 g/L的母液，并利用0.22 μm孔徑的無菌濾膜過濾除菌，保存于無菌離心管。并在開始實驗前用完全培養基將40 mg/mL的母液稀釋至所需質量濃度。

1.2 儀器與設備

ICS 5000高效液相離子交換色譜 美國Dionex公司；1100凝膠滲透色譜 美國沃特世公司；UV-1800紫外分光光度計 德國Agilent公司；多功能酶標儀美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 褐藻膠酶解

于100 mL酶解瓶中，采用0.05 mol/L醋酸銨緩沖液配制50 mL 10 g/L褐藻膠分散液，并加入適量固體的褐藻膠裂解酶粉末后，置于45 ℃、150 r/min搖床中酶解。分別研究pH值（5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）、酶用量（10、15、20、25 U/g和30 U/g（以底物質量計））和酶解時間（3、6、12、24 h和48 h）對AOS得率的影響。

1.3.2 褐藻膠酶解產物的分級分離

對褐藻膠酶解液采用分級醇沉法進行處理，其操作如下：將無水乙醇添加至商品褐藻膠酶解液中直至其終體積分數為50%，均勻混合后靜置10 000 r/min離心5 min，得到的沉淀標記為SA50組分；向上清液中繼續添加無水乙醇直至其終體積分數為75%，均勻混合后靜置離心，得到的沉淀標記為SA75組分。AOS仍溶解于上清液中，采用真空蒸發除去乙醇，冷凍干燥后稱質量，得到AOS組分。將上述所得的褐藻膠酶解產物（SA50、SA75和AOS）用去離子水復溶，并進行透析處理（截留分子質量為200 Da），每4 h更換新鮮的去離子水。透析后所得樣品溶液于冷凍干燥后密封保存。

1.3.3 細胞培養與傳代

細胞復蘇：將凍存有細胞的凍存管置于37 ℃下輕輕搖晃使其迅速融化，于無菌環境將細胞懸液轉移至15 mL離心管中，加入10 mL DMEM基礎培養基使其混勻后于1 000 r/min離心5 min，去除上清液，并于離心管中加入2 mL DMEM完全培養基將細胞沉淀復懸，最終將其轉移至含有8 mL完全培養基的細胞培養皿中，于飽和濕度、5% CO2、37 ℃的培養箱中靜置培養。第2天更換新配制的完全培養基繼續培養。

細胞傳代：當細胞生長約占培養皿底面積80%時進行傳代培養。首先去除舊培養液，用磷酸鹽緩沖液沖洗細胞表面2 次；然后加入1 mL的胰酶消化液，并搖晃使其完全浸潤貼壁細胞，在培養箱中消化1 min；隨后加入5 mL新配制的DMEM基礎培養基終止消化，并輕輕吹打培養皿底部的貼壁細胞，使其混勻成細胞懸液。將其轉移至離心管中1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，并輕輕拍打離心沉淀后加入3 mL新鮮的DMEM完全培養基，并使其形成細胞懸液，然后取1 mL至含有9 mL新鮮的DMEM完全培養基的細胞培養皿中，置于培養箱中培養。

1.3.4 褐藻膠酶解產物處理后RAW264.7細胞增殖能力測定

采用CCK-8試劑盒測定[12]。首先通過血球計數器計算細胞液的細胞密度，并調節細胞液的細胞密度為1×105個/mL，并以100 μL/孔添加到96 孔板中，培養24 h后吸去細胞液，并加入100 μL用新鮮培養基配成不同質量濃度（25、50、100、200、400、800 μg/mL）待測樣品繼續培養24 h，同時設置1 μg/mL LPS作為陽性對照，以完全培養基培養的細胞為陰性對照。最后，吸取培養基后在每個孔中添加100 μL稀釋10 倍的CCK-8試劑，并在37 ℃和5% CO2環境下孵育1 h。用酶標儀檢測在450 nm波長處的吸光度（A），用以定量細胞存活的程度。細胞活力按式（1）計算：

1.3.5 褐藻膠酶解產物處理后RAW264.7細胞NO分泌量測定

根據Griess反應中亞硝酸鹽的含量[13]，研究褐藻膠酶解產物對RAW264.7細胞分泌NO的影響。首先，將100 μL對數生長期的RAW264.7細胞（1×105個/mL）接種至96 孔板并培養24 h。移去培養液后加入含有不同質量濃度（25～800 μg/mL）樣品的新鮮培養基100 μL，同時設置1 μg/mL的LPS作為陽性對照，以完全培養基培養的細胞為陰性對照。繼續培養24 h后，取培養上清液50 μL至新96 孔板，并于避光條件下加入100 μL Griess混合溶液（Griess I試劑與Griess II試劑體積比1∶1混合），反應15 min后用酶標儀測定540 nm波長處的吸光度。NO標準曲線：先用DMEM培養基配制濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的NaNO2標準品溶液，按上述操作測定吸光度并繪制標準曲線，根據標準曲線方程計算細胞上清液中NO濃度。

1.3.6 褐藻膠酶解產物處理后RAW264.7細胞細胞因子分泌量測定

使用ELISA試劑盒研究褐藻膠酶解產物對RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-6和TLR4含量的影響。首先，將100 μL對數生長期的RAW264.7細胞（1×105個/mL）接種至96 孔板培養24 h。吸去細胞液后加入含有不同質量濃度（200、400、800 μg/mL）樣品的新鮮培養基100 μL，以1 μg/mL的LPS和完全培養基培養的細胞作為陽性對照和陰性對照。培養箱培養24 h后，培養液離心收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定細胞因子TNF-α、IL-6和TLR4的含量。

1.3.7 TAK-242處理后RAW264.7細胞活力測定

將100 μL 對數生長期的RAW 264.7 細胞（1×105個/mL）接種至96 孔板，培養24 h。除去培養液后，加入100 μL含有不同濃度TAK-242（0.5～64 μmol/L）的新鮮基礎培養基。并用無TAK-242的基礎培養基作為對照。培養4 h后使用CCK-8試劑盒分析細胞存活率以確定不同濃度TAK-242對細胞的毒性，所有實驗均為3 個平行。

1.3.8 TAK-242處理后褐藻膠酶解產物刺激RAW264.7細胞分泌NO和細胞因子水平測定

將100 μL對數生長期的RAW264.7細胞（1×105個/mL）接種至96 孔板，培養24 h。除去培養基后，將添加和不添加TAK-242（8 μmol/L）的新鮮完全培養基添加至孔板中，培養4 h；再用褐藻膠酶解產物不同組分（800 μg/mL）和陽性對照LPS（1 μg/mL）培養24 h。根據1.3.5節和1.3.6節方法測定NO、TNF-α、IL-6和TLR4的含量。

1.3.9 理化指標分析

1.3.9.1 單糖的定量分析

β-D-甘露糖醛酸與α-L-古羅糖醛酸采用 DINOX ICS-5000 型高效液相陰離子交換色譜分析，外標法測定。色譜條件：Carbo Pac PA10色譜柱（孔徑×長＝2 mm×250 mm），進樣量10 μL，以100 mmol/L氫氧化鈉（A）和500 mmol/L醋酸鈉（B）為流動相進行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流速為0.3 mL/min，脈沖安培檢測器檢測[14]。

1.3.9.2 褐藻膠酶解產物的定量分析

在褐藻膠酶解產物分級分離的基礎上，將上述所得的褐藻膠酶解產物（SA50、SA75和AOS）配成5 g/L溶液，利用咔唑-硫酸法[15]測定其中糖醛酸含量。在冰浴條件下先后向具塞試管中加入0.5 mL樣品溶液和2.5 mL四硼酸鈉-硫酸溶液，充分混勻后，煮沸15 min。冰浴冷卻后，加入100 μL咔唑煮沸15 min。反應結束后，用紫外分光光度計檢測530 nm波長處的吸光度。標準曲線繪制：準確配制不同質量濃度（0、0.02、0.04、0.06、0.08 g/L和0.10 g/L）的標準甘露糖醛酸和古羅糖醛酸溶液0.5 mL，冰浴條件下按上述操作測量吸光度，以醛酸質量濃度（g/L）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。并根據1.3.9.1節方法測定樣品中單糖含量。褐藻膠降解產物得率和單糖得率（游離的糖醛酸）按式（2）計算：

式中：ρa為褐藻膠酶解產物的糖醛酸質量濃度/（g/L）；ρb為褐藻膠酶解產物的單糖質量濃度/（g/L）；ρg為商品SA中的糖醛酸質量濃度/（g/L）。

1.3.9.3 重均分子質量和聚合度分析

采用高效凝膠滲透色譜法檢測并分析3 個褐藻膠酶解產物組分的平均分子質量。其操作條件如下：Agilent 1200型色譜儀（配有示差檢測器）；Ultrahydrogel 120和Ultrahydrogel 250串聯；柱溫55 ℃；流動相NaNO3；進樣量10 μL；流速0.6 mL/min。采用Chemstation色譜工作站和GPC軟件計算分子質量；在此基礎上，采用數均分子質量除以褐藻膠單糖組成的摩爾質量，用于計算其平均聚合度。

1.4 數據分析

使用SPSS（2008）統計軟件（適用于Windows 16.0版本）通過方差分析（ANOVA）分析數據。使用Tukey多范圍檢驗區分各組之間的差異顯著性。P＜0.05，數據具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 褐藻膠酶解產物的分子質量分析

為分析經裂解酶處理后褐藻膠降解產物的分子質量變化情況，以10 g/L褐藻膠為底物，45 ℃、pH 7.0、酶用量10 U/g條件下反應24 h，并采用乙醇分級分離方法對酶解液進行處理，獲得3 個褐藻膠降解產物組分（SA50、SA75和AOS）。商品褐藻膠和3 種褐藻膠酶解產物組分的凝膠排阻色譜圖、重均分子質量和平均聚合度如圖1所示。褐藻膠原料以及3 種褐藻膠酶解產物組分的信號峰都呈現典型的正態分布，說明褐藻膠和分級醇沉得到的3 種組分的分子質量相對均一且純度較高。根據各個組分的出峰時間可推斷，3 種組分的相對分子質量均遠小于商品褐藻膠。其中，褐藻膠的重均分子質量為292 kDa，與文獻[16]報道相似（219～343 kDa）。SA50、SA75和AOS 3 種組分重均分子質量分別為13.4、5.73 kDa和3.85 kDa；且乙醇體積分數越高，其所分離的組分分子質量越低，這和同為酸性多糖的聚半乳糖醛酸酶解產物的分級醇沉規律相同[17]。此外，根據各組分的數均分子質量折算其平均聚合度可知，酶解處理前褐藻膠的平均聚合度為1 032，經酶解處理后，其平均聚合度顯著降低至16～54。其中，AOS組分的平均聚合度為16，屬于低聚糖。

圖1 褐藻膠及其酶解產物的凝膠排阻色譜圖和平均聚合度Fig.1 Gel exclusion chromatograms and average polymerization degrees of alginate and its enzymatic digestion products

2.2 AOS的酶法制備工藝優化

以10 g/L褐藻膠為底物，于45 ℃、酶用量10 U/g條件下經褐藻膠裂解酶酶解24 h，pH值對AOS得率的影響如圖2a所示。結果表明，褐藻膠酶解產物中同時存在3 種不同分子質量的褐藻膠不完全降解產物（SA50、SA75和AOS）。當pH值從5.0增加至7.0，AOS組分得率從3.20%增加到最高29.13%；而進一步酶解pH值至9.0時，AOS得率降低到0.72%。在pH 7.0的條件下，AOS得率最高可達到29.13%；此時，SA50和SA75得率分別可達38.30%和28.45%。酶解pH值對褐藻膠不完全降解產物各組分得率有顯著影響，這可能與褐藻膠不溶于酸性溶液以及褐藻膠裂解酶的酸堿度耐受性有極大的關系[18]。因此，褐藻膠酶法制備AOS的適宜酶解pH值為7.0。

圖2 酶解參數對AOS制備的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis parameters on the preparation of alginate oligosaccharides

圖2b結果表明，當酶用量從10 U/g增加到30 U/g時，SA50和AOS組分的得率逐漸降低，而SA75組分的得率逐步增高。在酶用量為15 U/g時，酶解所得SA50、SA75和AOS組分的得率分別為26.94%、35.08%和30.32%，此時酶解產物的聚合度低于10 U/g酶用量時酶解產物的聚合度。值得探究的是隨著酶用量的增加，AOS得率從最高30.32%逐步下降至15.58%，總糖得率從96.70%降低至84.48%，這可能是因為褐藻膠裂解酶處理后會產生不飽和單糖，并且隨著酶用量和酶解程度的增加，酶解產物中不飽和單糖含量不斷增加。這一現象和Tang Shou等[19]的研究結果一致：6 U/mL重組褐藻膠裂解酶處理褐藻膠，其不飽和單糖的轉化率高達37.6%。因此，褐藻膠酶法制備AOS的適宜酶用量為15 U/g。

如圖2c所示，在酶解過程中，SA50組分的得率隨著降解時間的延長而逐步降低；SA75和AOS組分的得率隨著降解時間的延長而逐漸升高。降解時間為24 h時，SA50、SA75和AOS組分得率分別為27.47%、35.93%和28.05%。3 個酶解組分的變化可以說明隨著降解時間的延長，AOS的聚合度逐步降低。并且酶解時間24 h相對于48 h可以減少工藝耗時、提高生產效率。因此，褐藻膠酶法制備AOS的適宜酶解時間為24 h。綜上所述，以10 g/L褐藻膠為底物、45 ℃、pH 7.0、酶用量15 U/g和反應時間24 h是生物酶解法制備AOS的最適條件，此時AOS得率最高為28.05%。黃菊等[20]利用褐藻膠裂解酶酶解褐藻膠制備“褐藻低聚糖”，產率可高達75%，但是其所得到的“褐藻低聚糖”分子質量高達6～8 kDa，并不是聚合度為2～20的AOS。

2.3 褐藻膠酶解產物對巨噬細胞免疫功能的影響

2.3.1 褐藻膠酶解產物對RAW264.7細胞增殖的影響

巨噬細胞可以通過多種信號通路達到免疫調節的目的[21]，因此，采用巨噬細胞評估褐藻膠酶解產物的體外免疫調節能力；而LPS是公認的巨噬細胞促分裂原，通常用于刺激巨噬細胞釋放一氧化氮和細胞因子[22]，用作陽性對照。如圖3所示，褐藻膠及其酶解產物均可以促進小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖，且呈現質量濃度依賴性，當樣品質量濃度為100～800 μg/mL時，經褐藻膠及其酶解產物培養的細胞存活率顯著高于對照組（P＜0.05），表明它們是生物安全的，可應用于生物體內。

圖3 褐藻膠酶解產物對RAW264.7細胞活力的影響Fig.3 Effect of enzymatically hydrolyzed alginate on the viability of RAW264.7 cells

2.3.2 褐藻膠酶解產物對RAW264.7細胞釋放NO的影響

NO被認為是由巨噬細胞產生的重要分子，其參與調節生理或病理過程，包括宿主對抗病原體和血管舒張[23]。如圖4所示，褐藻膠及其酶解產物均可促進RAW264.7細胞的NO產生（P＜0.05），并具有質量濃度依賴性。

圖4 褐藻膠酶解產物對RAW264.7細胞中NO產率的影響Fig.4 Effect of enzymatically hydrolyzed alginate on the production of NO in RAW264.7 cells

2.3.3 褐藻膠酶解產物對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響

TLR4是糖類誘導免疫調節中刺激巨噬細胞和糖類識別的主要受體[24]。并且該受體的級聯激活可以引發免疫細胞內信號分子的級聯催化反應，從而可以同時促進包括TNF-α、IL-6等細胞因子的分泌[25]。這些細胞因子可直接參與胞間相互作用，從而調節機體免疫反應、抑制腫瘤生長。Mami等[26]研究酶解褐藻膠獲得的不同聚合度褐藻寡糖對巨噬細胞分泌IL-1α和IL-1β、IL-6的影響，同樣發現了AOS可以促進細胞因子的分泌，且AOS聚合度與其細胞因子分泌量未見明顯相關性。然而，目前鮮有文獻對比AOS和其他不同分子質量范圍褐藻膠降解產物的體外免疫活性差異。本研究系統對比了褐藻膠和3 種分子質量褐藻膠酶解產物對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響，結果如圖5所示。與對照組相比，褐藻膠酶解產物顯著促進了TLR4、TNF-α和IL-6的分泌（P＜0.001），并具有質量濃度依賴性。SA75組分的免疫調節活性最為顯著，TNF-α和IL-6的分泌量可分別達到16 895.77、69 613.89 pg/mL，甚至高于LPS，這可能是因為隨著酶解程度的提高，酶解產物中不飽和單糖含量不斷增加，AOS組分中的不飽和單糖較多，導致其免疫活性降低。

圖5 褐藻膠酶解產物對RAW264.7細胞中TNF-α（a）、IL-6（b）和TLR4（c）分泌的影響Fig.5 Effect of enzymatically hydrolyzed alginate on the secretion of TNF-α (a),IL-6 (b) and TLR4 (c) in RAW264.7 cells

2.3.4 TAK-242對褐藻膠酶解產物體外免疫調節活性的影響

為了驗證褐藻膠酶解產物的免疫刺激通路，本研究引入了TLR4的阻斷劑TAK-242以探究TAK-242對褐藻膠酶解產物免疫調節活性的影響。TAK-242是直接選擇性和受體TLR4結合并干擾TLR4和銜接分子之間的相互作用[27]的小分子特異性抑制劑。在研究TLR4和褐藻膠酶解產物介導的免疫調節活性之間的相關性前，先通過CCK-8確定TAK-242對RAW264.7細胞的毒性作用。如圖6a所示，隨著TAK-242濃度的增加，細胞存活率逐漸降低。具體而言，4 μmol/L TAK-242對RAW264.7細胞的存活無影響，而超過該濃度后，TAK-242對細胞的毒性作用逐漸顯現。因此，選擇4 μmol/L的TAK-242培養細胞4 h以測試其是否影響褐藻膠酶解產物誘導NO的產生。圖6b與理論預期一致，與未添加抑制物組相比，引入TAK-242顯著降低了NO的產生（P＜0.05）。在所有使用TAK-242的組中，AOS組分誘導的NO生成量從11.38 mol/L降低至4.82 mol/L。這一結果與TAK-242作用于與其他多糖如桑黃多糖和馬尾松花粉多糖培養的巨噬細胞的結果一致[28-29]。這些結果也表明TLR4信號通路與褐藻膠酶解產物誘導NO分泌的過程有關，同時表明其他受體也可能與褐藻膠酶解產物的免疫調節活性有關。

圖6 不同濃度TAK-242對細胞存活率的影響（a）和褐藻膠酶解產物對有無TAK-242孵育RAW264.7細胞中NO產生的影響（b）Fig.6 Effect of different concentrations of TAK-242 on cell viability (a) and effects of enzymatically hydrolyzed alginate on NO production in RAW264.7 cells incubated with or without TAK-242 (b)

TAK-242對褐藻膠酶解產物免疫調節活性的影響如圖7所示，特異性抑制劑的加入嚴重影響了TNF-α和IL-6的分泌。與NO的減少量相比，TAK-242的添加將SA75組分的IL-6分泌量從51 794.74 pg/mL降低到284.21 pg/mL。當用TAK-242和LPS培養細胞時，獲得了相似的結果。同時TLR4的降低表明褐藻膠酶解產物通過誘導巨噬細胞TLR4的分泌引起級聯反應，可以促進NO、TNF-α和IL-6的分泌，從而調節巨噬細胞免疫活性；但是顯著性不高，說明還有其他的免疫刺激通路。

圖7 褐藻膠酶解產物對有無TAK-242條件下培養的RAW264.7細胞中TNF-α（a）、IL-6（b）和 TLR4（c）分泌的影響Fig.7 Effect of enzymatically hydrolyzed alginate on the secretion of TNF-α (a),IL-6 (b) and TLR4 (c) in RAW264.7 cells cultivated with or without TAK-242

3 結論

通過對褐藻膠酶法降解工藝進行優化，并通過巨噬細胞體外模型系統評價了不同分子質量范圍的褐藻膠酶解產物組分免疫活性差異，得到以下結論：1）褐藻膠在底物質量濃度10 g/L、45 ℃、pH 7.0和酶用量15 U/g最優條件下經褐藻膠裂解酶酶解24 h，此時通過乙醇分級分離獲得了3 種不同分子質量范圍的降解產物SA50、SA75和AOS，其重均分子質量分別為13.4、5.73 kDa和3.85 kDa；得率分別為27.47%、35.93%和28.05%。2）不同分子質量范圍褐藻膠酶解產物的體外免疫增強效果不同，本研究中SA75組分（分子質量為5.73 kDa）促進細胞因子分泌的能力高于其他酶解組分。3）通過TLR4阻斷劑TAK-242的引入，證實了褐藻膠酶解產物通過誘導TLR4的分泌，促進NO和其他細胞因子的分泌。