過表達SlCCD1A基因調控番茄風味品質

婁茜棋，孟良哲，張清花，程寶慧，程國亭，梁 燕,*

（1.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100；2.延安大學生命科學學院，陜西 延安 716000）

番茄（Solanum lycopersicum）俗稱西紅柿、洋柿子等，起源于南美洲[1]。因其豐富的營養品質、多汁鮮美的風味品質深受消費者喜愛。然而，商品番茄育種長期追求高產和高抗定向育種，導致果實品質性狀多樣化程度降低[2]，特別是番茄的氣味和滋味已不能夠滿足消費者需求[3]，因此，提升番茄風味品質是當前研究的熱點[4-5]。

在蔬菜中有3 種主要的揮發物合成途徑，分別是脂肪酸途徑、氨基酸途徑和類胡蘿卜素途徑[6-7]。已有大量的研究發現合成途徑中存在關鍵有利基因[8-10]，如在類胡蘿卜素途徑中的類胡蘿卜素雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCD1）裂解類胡蘿卜素產生花香、果香等異戊二稀揮發性物質[11-12]。這些揮發物雖然濃度低，但易被感知到，與消費者喜愛程度呈正相關[11-13]。Simkin[14]和Ilg[15]等研究發現番茄LeCCD1A與CCD1株系有83%同源性，能在體外裂解多種環狀類胡蘿卜素，生成多種C13脫輔基類胡蘿卜素類化合物，如香葉基丙酮、假紫羅蘭酮和β-紫羅酮，顯著增加果實風味[16]。另外，八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、z-胡蘿卜素均能夠被LeCCD1A氧化裂解產生香葉基丙酮，番茄紅素也能被氧化裂解產生6-甲基-5-庚烯-2-酮[17]。Cheng Guoting等[16]的研究表明SlCCD1A與類胡蘿卜素代謝關系更為密切，SlCCD1A有望成為番茄香味提升的關鍵靶基因。

本實驗以櫻桃番茄CI1005和大果番茄AC的SlCCD1AOE株系為研究對象，利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（headspace solid phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGS-MS）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）等方法，比較轉基因T1代與野生型（wild type，WT）株系果實品質間差異，研究SlCCD1A對番茄果實風味和營養品質的影響，以期為SlCCD1A在番茄品質改良中的應用奠定基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗室獲得了SlCCD1A-OE的T0代番茄植株[16]，在此基礎上自交獲得CI1005（Solanum lycopersicumvar.cerasiforme）和AC番茄材料（Solanum lycopersicumvar.lycopersicum）過表達T1代轉基因材料。CI1005為風味較好的紅色櫻桃番茄，植株編號為OE-2、OE-3、OE-8和OE-9；AC為風味較差的紅色大果番茄植株，編號為OE-7、OE-15和OE-16，均由西北農林科技大學園藝學院番茄種質資源課題組提供。

3-壬酮（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、無水NaCl、正己烷、丙酮、無水乙醇、乙酸乙酯、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 上海麥克林生化科技有限公司；Omega RNA提取試劑盒 美國Omega BioTek公司；Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒、SYBR?Green ProTaqHS預混型qPCR試劑盒 湖南艾科瑞生物工程有限公司；VC試劑盒、總糖試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平、勻漿機、恒溫磁力攪拌器 美國Troemner公司；ISQ GS-MS儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；SPME手動進樣手柄、PDMS（100 μm）萃取頭 美國Supelco公司；LC-2010A HT HPLC儀 日本島津公司；離心機、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 德國艾本德股份公司；電泳儀北京君意公司；凝膠成像系統 北京賽智公司；熒光定量儀 美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取及PCR鑒定

待幼苗長至四葉一心時，取新鮮葉片采用十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）提取DNA。檢測濃度，以提取的DNA為模板，PCR鑒定陽性株系。過表達SLCCD1A基因表達載體質粒為陽性對照，WT植株DNA作為陰性對照。

PCR體系（20 μL）：Taqmix（2×）10 μL；正、反向引物各1 μL；DNA模板1 μL；ddH2O補齊至20 μL，加7 μL。

PCR程序：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s（30 個循環）；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。

1.3.2 實時PCR（real-time PCR）鑒定

統一采取第二穗成熟果實，每個樣品設3 個技術重復，提取方法參照Omega試劑盒說明書；提取的RNA用RNA PCR試劑盒逆轉錄為cDNA。參照Evo M-MLV逆轉錄預混型試劑盒說明書；采用SYBR?Green ProTaqHS預混型qPCR試劑盒進行real-time PCR。反應體系為20 μL，其中2×SYBR?Green ProTaqHS Premix 10 μL，cDNA 200 ng，正、反向引物各0.2 μmol/L，ROX Reference Dye 0.4 μmol/L，用RNase free water補齊至20 μL。反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃復性1 min，40 個循環。每個樣品均設置3 個生物學重復，再根據2－ΔΔCT計算基因的表達量。具體操作參照試劑盒說明書，引物序列如表1所示。

1.3.3 揮發物測定

采用HS-SPME-GC-MS聯用技術測定番茄果實揮發物。參照呂潔[10]、Cheng Guoting[16]等和常培培[18]的方法略作改動。

SPME取樣：取成熟期大小均勻的5 個果實，用勻漿機打成勻漿，取約5 g番茄果肉勻漿，并加入3 g無水硫酸鈉，同時加入10 mL 0.025 mg/L的3-壬酮標樣于40 mL頂空瓶中，置于50 ℃恒溫磁力攪拌器上（攪拌速率500 r/min），平衡10 min后于頂空固相微萃取吸附40 min，插入色譜氣化室，解吸3 min后進行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 mm）；進樣口溫度250 ℃；

進樣方式：不分流進樣；升溫程序：40 ℃保持2.5 min，10 ℃/min升至110 ℃，然后以6 ℃/min升溫至230 ℃，維持8 min；載氣為高純He（99.999%）；流速1.0 mL/min。質譜條件：電離方式：電子電離；電離電壓70 eV；離子源溫度250 ℃；采用選擇離子檢測進行掃描，掃描質量范圍35～500 u。

定性及半定量：采用計算機譜庫（NIST 2011）進行檢索及分析，參考與質譜的配匹度以及相關文獻鑒定果實中的揮發性物質組分（正反匹配度在800～1 000范圍內）。果實中揮發性物質的定量采用內標峰面積歸一法。

1.3.4 類胡蘿卜素含量測定

將果實用液氮研成粉末，冷凍干燥，稱取1 g樣品放入10 mL離心管，加入5 mL色素提取液（正己烷∶丙酮∶無水乙醇＝2∶1∶1，V/V），用超聲儀萃取20 min。600 r/min離心10 min，將上清液轉到新離心管；向原來的離心管中加入5 mL色素提取液，萃取后再離心，合并2 次離心后的上清液。將上清液真空濃縮至干燥。用2 mL乙酸乙酯溶解類胡蘿卜素干樣，1 300 r/min離心25 min，取上清液經過0.22 μm濾膜過濾2 次，轉入2 mL棕色色譜進樣瓶。用LC-2010A HT HPLC儀進行檢測。用YMC Carotenoid C30色譜柱對類胡蘿卜素進行分離，用番茄紅素、β-胡蘿卜素、葉黃素標準品確定出峰時間，并作線性回歸校準曲線。

1.3.5 其他品質指標測定

總糖含量采用蒽酮比色法測定[19]；VC質量濃度采用鉬藍比色法測定[20]；可溶性固形物質量分數使用手持式折光儀直接測定[21]；總酸質量濃度采用酸堿滴定法測定[22]。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2007及SPSS 20.0軟件統計與分析數據并進行顯著性分析和標準偏差計算，采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SlCCD1A-OE株系的表達水平分析

經鑒定陽性植株均擴增出986 bp 的目的條帶（圖1），CI1005的T1代陽性株共有17 株，AC的T1代陽性株共有15 株。選取CI1005的OE-2、OE-3、OE-8和OE-9株系和AC的OE-7、OE-15和OE-16株系進行表達量測定。real-time PCR分析結果如圖2所示，與WT相比，SlCCD1A基因相對表達量在OE-3和OE-9株系中極顯著升高（P＜0.01），分別是3.82和3.41。SlCCD1A基因相對表達量在OE-2和OE-8株系中顯著升高（P＜0.05），分別是2.92和2.27。SlCCD1A基因相對表達量在OE-7和OE-15株系中極顯著升高（P＜0.01），分別是2.74和2.09。在OE-16株系中顯著升高為1.68（P＜0.05）。選取表達量增長幅度更大的CI1005的OE-2、OE-3和OE-9，AC的OE-7和OE-15株系進行后續的品質測定和分析。

圖1 OE植株PCR鑒定結果Fig.1 PCR identification of OE plants

圖2 CI1005及AC果實SlCCD1A相對表達量Fig.2 Relative expression levels of SlCCD1A in CI1005 and AC fruits

2.2 SlCCD1A-OE對色差和類胡蘿卜素的影響

2.2.1 CI1005番茄

如圖3A所示，OE-3和OE-9株系與WT相比果實顏色變淺。進一步進行色差分析（表2），發現OE-3和OE-9的a*值、C*值顯著低于WT，證明OE-3和OE-9變綠、色彩飽和度變低。但OE-2與WT無顯著差異。色差分析中L*值表示果色的明度，值越高越接近亮色，反之則越近暗色。a*值表示紅度，值越高越接近紅色，值越低越接近綠色。b*值表示黃度，值越高越接近黃色，值越低越接近藍色。C*值為色彩飽和度，與番茄紅素含量呈正相關[15]。結合2.1節結果發現，SlCCD1A表達量越高果實顏色越淺，表達量適當提升對果實顏色沒有顯著影響。據此利用HPLC法檢測果實類胡蘿卜素含量，主要鑒定的類胡蘿卜素種類是番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素，其中總類胡蘿卜素是三者之和。過表達SlCCD1A基因使得果實類胡蘿卜素含量降低，如圖3B所示。與WT相比，OE-9總類胡蘿卜素含量、番茄紅素含量極顯著降低（P＜0.01），分別為57.55 mg/g和38.88 mg/g；OE-2、OE-3也顯著低于WT（P＜0.05），分別是60.33、41.83 mg/g和60.36、40.73 mg/g，僅OE-2的β-胡蘿卜素含量極顯著降低為12.73 mg/g（P＜0.01）。另外，SlCCD1A基因對各株系葉黃素含量未體現出顯著影響，可能是因為番茄紅素含量總量遠高于葉黃素含量，相對裂解的量較多。

圖3 SlCCD1A-OE對CI1005和AC果實類胡蘿卜素含量的影響Fig.3 Effect of SlCCD1A-OE on carotenoid contents in CI1005 and AC fruits

表2 SlCCD1A-OE對CI1005果實色差的影響Table 2 Effect of SlCCD1A-OE on color difference of CI1005 fruit

2.2.2 AC番茄

如表3所示，OE-7株系L*值與C*值極顯著低于WT（P＜0.01），分別是32.51和21.79；a*值和b*值顯著低于WT（P＜0.05），分別是16.37和14.39。OE-15的C*值極顯著低于WT（P＜0.01），為21.12，L*、a*、b*值顯著低于WT（P＜0.05），分別是33.17、16.68和14.49，表明過表達株系果實顏色變淺，但在實際樣品觀察中發現僅OE-7顏色變淺，OE-15并無顯著變化。相較于WT，OE-7株系總類胡蘿卜素含量顯著低于WT（P＜0.05），為55.66 mg/g；OE-7的番茄紅素極顯著降低為36.79 mg/g（P＜0.01）；OE-15為38.61 mg/g，無顯著變化（P＞0.05）；OE-7的β-胡蘿卜素含量極顯著降低為13.08 mg/g（P＜0.01）；OE-7和OE-15的葉黃素含量顯著降低（P＜0.05），分別為5.76 mg/g和5.82 mg/g。

表3 SlCCD1A-OE對CI1005果實色差的影響Table 3 Effect of SlCCD1A-OE on color difference of CI1005 fruit

2.3 SlCCD1A-OE對類胡蘿卜素衍生揮發物的影響

2.3.1 CI1005番茄

在CI1005過表達及WT株系中共檢測到11 種類胡蘿卜素衍生揮發物（表4），過表達株系總揮發物含量極顯著高于WT（P＜0.01），分別是WT的4.31、5.68 倍和5.02 倍。其中OE-3和OE-9株系中的6-甲基-5-庚烯-2-酮、香葉醇、橙花醛、法尼基丙酮、β-環檸檬醛、(E)-檸檬醛含量均極顯著高于WT（P＜0.01）；OE-3的β-紫羅酮、(E)-á-紫羅酮、6-甲基-5-庚烯-2-醇和3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇含量極顯著高于WT（P＜0.01）；OE-2的6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-5-庚烯-2-醇、香葉醇、橙花醛、β-紫羅酮、(E)-á-紫羅酮、法尼基丙酮、3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇、β-環檸檬醛、香葉基丙酮和(E)-檸檬醛含量均顯著高于WT（P＜0.05）。

表4 SlCCD1A-OE對CI1005果實類胡蘿卜素衍生揮發物含量的影響Table 4 Effect of SlCCD1A-OE on the contents of carotenoid-derived volatiles in CI1005 fruitμg/kg

CI1005及WT株系的氣味特征得分如圖4所示。提高SlCCD1A表達量主要對CI1005的花香、甜感和果香起重要作用。相較于WT，OE-2、OE-3和OE-9的花香和甜感、果香氣味特征值顯著增加（P＜0.05），OE-2分別為17.28、5.72、6.55 分，OE-3分別為22.03、7.35、8.82 分，OE-9分別為19.62、7.13、8.25 分。總之，CI1005過表達株系果實中揮發物含量顯著高于WT果實，特征氣味得分值顯著提高，風味更加濃郁。

圖4 SlCCD1A-OE對CI1005氣味得分的影響Fig.4 Effect of SlCCD1A-OE on aroma scores of CI1005 fruit

2.3.2 AC番茄

在AC過表達及WT株系中共檢測到9 種類胡蘿卜素衍生揮發物（表5），過表達株系總揮發物含量極顯著高于WT（P＜0.01），OE-7和OE-15分別是WT的1.88 倍和1.73 倍。其中OE-7株系橙花醛、3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇、β-環檸檬醛含量顯著高于WT（P＜0.05），6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-5-庚烯-2-醇、β-紫羅酮、(E)-á-紫羅酮、(E)-檸檬醛含量極顯著高于WT（P＜0.01）；OE-15的6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-5-庚烯-2-醇、橙花醛、β-紫羅酮、香葉基丙酮含量顯著高于WT（P＜0.05），(E)-á-紫羅酮、β-環檸檬醛、(E)-檸檬醛含量極顯著高于WT（P＜0.01），3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇含量與WT無顯著差異（P＞0.05）。總之，提高SlCCD1A基因能夠提升AC果實類胡蘿卜素衍生揮發物含量。

表5 SlCCD1A-OE對AC果實類胡蘿卜素衍生揮發物含量的影響Table 5 Effect of SlCCD1A-OE on the contents of carotenoid-derived volatiles in AC fruitμg/kg

氣味特征得分如圖5所示。相較于WT，OE-7、OE-15的花香、甜感、果香顯著增加，OE-7分別為10.74、7.49、8.40 分，OE-15分別為10.42、5.85、7.64 分。總地來說，SlCCD1A-OE番茄果實中的衍生揮發物含量極顯著提升，且特征氣味得分值顯著提高，風味更佳。

圖5 SlCCD1A-OE對AC氣味得分的影響Fig.5 Effect of SlCCD1A-OE on aroma scores of AC fruit

2.4 果實品質指標

2.4.1 CI1005番茄

如表6所示，OE-3和OE-9的可溶性固形物質量分數極顯著高于WT（P＜0.01），分別是6.2%和6.1%；WT僅4.47%。OE-3和OE-9的總糖含量顯著高于WT（P＜0.05），分別是37.34 mg/g和35.77 mg/g；而總酸質量濃度極顯著低于WT（P＜0.01），分別是0.36 mg/L和0.37 mg/L；糖酸比極顯著高于WT（P＜0.01），分別是10.37和9.67。OE-2株系的可溶性固形物質量分數、總糖含量并無顯著差異（P＞0.05），但是糖酸比增長的趨勢同其他過表達株系基本一致。過表達株系的VC質量濃度較WT均有所下降，分別是44.75、42.10 mg/mL和42.68 mg/mL。提高SlCCD1A表達量可提高CI1005果實的可溶性固形物質量分數、總糖含量和糖酸比。

表6 SlCCD1A-OE對相關品質指標的影響Table 6 Effect of SlCCD1A-OE on quality indexes

2.4.2 AC番茄

AC過表達株系的可溶性固形物質量分數顯著提高。相較于WT，表達量最高的OE-7株系可溶性固形物質量分數顯著提升至4.77%（P＜0.05），總糖含量顯著提高至20.03 mg/g（P＜0.05），糖酸比極顯著提高至5.32（P＜0.01），分別為20.03 mg/g和5.23；總酸質量濃度極顯著降低（P＜0.01）、VC質量濃度顯著降低（P＜0.05），分別是0.38 mg/L和37.10 mg/mL。OE-15的糖酸比極顯著提高為4.60（P＜0.01），總酸質量濃度極顯著降低為0.41 mg/L（P＜0.01）。總糖含量和VC質量濃度沒有顯著差異（P＞0.05）。提高SlCCD1A表達水平顯著提高AC果實的可溶性固形物質量分數、總糖含量和糖酸比，顯著降低果實總酸和VC質量濃度。

3 討論

類胡蘿卜素屬于異戊二烯類次生代謝產物[23]，是提供果實顏色的主要來源[24]。Simkin[14]和Ilg[15]等研究表明，SlCCD1A能夠裂解類胡蘿卜素產生揮發物，但并不會影響類胡蘿卜素總量變化[9,25-26]。而程國亭[25]的研究表明，在紅色櫻桃番茄和綠色大果番茄中提高SlCCD1A基因表達量，使果實番茄紅素和β-胡蘿卜素極顯著降低（P＜0.01），葉黃素含量沒有被影響，在本實驗中也發現類似結果（圖6），提高SlCCD1A基因表達量，會大量裂解果實的番茄紅素和β-胡蘿卜素，葉黃素含量沒有顯著差異（P＞0.05）。所以使得總類胡蘿卜素含量較WT顯著降低（P＜0.05），果實顏色變淺。因此推測SlCCD1A基因表達量提高至一定程度，大量類胡蘿卜素被裂解，引起果實顏色發生變化。

圖6 SlCCD1A在番茄果實作用機制模型Fig.6 Model of the mechanism of SlCCD1A action in tomato fruits

針對SlCCD1A-OE株系中果實葉黃素含量沒有顯著變化的現象（P＞0.05），推測可能有兩點原因：一是在番茄中已經證明CCD1具有強烈地降解玉米黃質、番茄紅素和β-紫羅酮的功能[26-27]，并且番茄果實中番茄紅素含量極顯著高于葉黃素（P＜0.01），能被SlCCD1A裂解的量相對較多；二是SlCCD1A在番茄體內的裂解底物具有靈活性[26-28]，其裂解活性及其底物選擇可能易受品種的影響[28]。

前人研究表明，類胡蘿卜素衍生揮發物對番茄風味有重要貢獻[29-31]，包括具有花香和甜感的6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-紫羅酮和香葉基丙酮等揮發性物質[32-35]。在本實驗中證明SlCCD1A-OE使類胡蘿卜素衍生揮發物組分數和含量增加（圖6），CI1005的OE株系中11 種揮發物含量顯著增加（P＜0.05），其中9 種關鍵揮發物對應著番茄的花香、甜感和果香[33-34]，且表達量越高的株系揮發物含量及氣味特征值提升越多。AC番茄屬于大果番茄，經評價AC番茄風味較差居中等偏下水平。AC的WT番茄果實中萜類揮發物含量較低，只含有少量的單萜類物質。提高SlCCD1A表達水平也能顯著增加AC類胡蘿卜素衍生揮發物含量和氣味特征得分。許多類胡蘿卜素衍生揮發物由于氣味閾值低，只需少量就能影響番茄氣味[3,34]。所以提高SlCCD1A表達量是提高番茄香氣強度的有效途徑[36]，提升CI1005和AC果實類胡蘿卜素衍生揮發物的含量與豐富度，能夠增加消費者對番茄的花香、果香和甜感的感知，提升番茄果實風味品質。

在水果和蔬菜營養及風味品質的評價范疇中，總糖含量、可溶性固形物含量、VC含量也占據重要地位[37]，這些性狀的不同比例不僅決定了它們口感，還能夠和揮發物質混合產生獨特風味[38-39]。因此，為了驗證提高SlCCD1A基因除了提升果實體內揮發物外，是否還會引起其他性狀的變化，本實驗測定了可溶性固形物質量分數和總糖含量等品質指標。過表達株系的可溶性固形物質量分數、總糖含量各糖酸比顯著提高（P＜0.05），總酸和VC質量濃度顯著降低（P＜0.05）。使得轉基因番茄口感上變得高甜低酸，更滿足消費者對于番茄果實滋味的預期。果實的各個品質指標在一定程度上可能存在關聯，但是各個性狀間關系聯結的具體原因還需深入研究[10,40]。因此，利用SlCCD1A基因改良番茄果實品質，仍需尋找風味品質與營養品質的平衡點，利用分子手段結合雜優育種等方法，在生產中利用SlCCD1A創制優質番茄種質材料。