鞣花酸抑制酪氨酸酶的動力學、熒光光譜分析及分子對接

倪 丹，蔣新元 ，唐玉蓮，何思宜，楊迎舟

（1.中南林業科技大學理學院，湖南 長沙 410004；2.中南林業科技大學材料科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

酪氨酸酶又稱多酚氧化酶，是一種廣泛分布于微生物、動物和植物中的含銅氧化酶[1]。作為催化黑色素生成的關鍵限速酶，酪氨酸酶的異常表達會造成黑色素過度堆積[2]，從而導致皮膚色素沉著障礙如雀斑、老年斑、黃褐斑甚至惡性黑色素瘤[3]。此外，酪氨酸酶還參與水果和蔬菜的酶褐變，通常導致這些產品的色澤和感官特性改變，從而顯著降低產品的質量和營養經濟價值[4]。因此，酪氨酸酶抑制劑在食品工業中可用作食品防腐劑，在醫藥和化妝品領域可用作皮膚美白劑[5]。雖然在文獻中已報道了許多天然和合成的酪氨酸酶抑制劑，如熊果苷、對苯二酚、抗壞血酸和曲酸等[6]，但由于其受抑制效率低、耐藥性強和安全性低等限制，目前廣泛應用的僅有熊果苷和抗壞血酸。

近年來，多酚類化合物因其廣泛的生物活性備受關注。鞣花酸（ellagic acid，EA）作為一種天然多酚，具有抗癌[7]、抗炎[8]、抗氧化[9]和美白[10]等多重生理活性，目前廣泛應用于食品、醫藥及化妝品領域。楊笑笑等[11]發現EA對酪氨酸酶具有強抑制作用，可以同時抑制酪氨酸羥化酶和多巴氧化酶的活性。Yang等[12]利用斑馬魚模型進行的體內實驗驗證了EA對酪氨酸酶的抑制活性。Solimine等[13]從玫瑰油蒸餾后的廢水中分離出EA，通過實驗發現其對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用是陽性對照曲酸的10 倍左右，且屬于混合抑制類型。明確抑制劑的抑制機制能夠深入了解酶的結構和功能，驗證抑制劑的選擇性和效力，Garcia-Jimenez等[14]發現脫氧熊果苷、β-熊果苷能明顯地競爭性抑制蘑菇酪氨酸酶活性，并且通過氫鍵和疏水作用力與酶中心的銅離子結合。趙美娟[15]發現L-抗壞血酸棕櫚酸酯對酪氨酸酶顯示出可逆反競爭性抑制，并且與酶活性中心形成氫鍵、范德華力相互作用。曲酸可以與酪氨酸酶活性位點內的銅離子螯合使酶失活，同時可以抑制蘋果切片中的酶促褐變[16]。然而，目前鮮有對EA抑制酪氨酸酶及其機制的系統研究。

在不同的酪氨酸酶來源中，雙孢蘑菇酪氨酸酶與人類酪氨酸酶具有較高的相似性和同源性，是酪氨酸酶的主要廉價來源[17]。然而有報道稱，蘑菇酪氨酸酶和人酪氨酸酶在選擇性和功效上存在顯著差異[18]，以不同來源酪氨酸酶為靶點研究酪氨酸酶抑制劑具有不同的效果和應用價值。因此，尋找高效的酪氨酸酶抑制劑并且明確其抑制機制具有重要意義。因此，本研究以蘑菇酪氨酸酶為靶點，通過動力學分析、熒光光譜法探究EA對酪氨酸酶的抑制與互作機理，同時結合分子對接模擬進行驗證補充，采用實驗結合理論的方法，從分子水平綜合分析EA對蘑菇酪氨酸酶的抑制機理，以期為EA在食品工業中作為保鮮劑的各種應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EA（純度≥98%）西安皓源生物技術有限公司；雙孢蘑菇酪氨酸酶（1 240 U/mg）、L-酪氨酸（分析純）合肥博美生物科技有限責任公司；其他試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

1510酶標儀 美國賽默飛世爾儀器有限公司；PHS-25 pH計 上海雷磁儀器有限公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；BSA124S-CW分析天平 賽多利斯科技儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EA儲備液的配制

稱取一定量EA，溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），定容配制1.00 mg/mL的儲備液，4 ℃冰箱保存，避光，根據需要用DMSO或超純水稀釋，體外抑制酪氨酸酶實驗、抑制反應動力學實驗的EA工作液用DMSO稀釋；其他光譜實驗的EA工作液用超純水稀釋。

1.3.2 酪氨酸酶抑制作用測定

參照??hreto?lu等[19]的方法，稍作修改。分別用pH 6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制200 U/mL酪氨酸酶溶液、2 mmol/LL-酪氨酸溶液。反應在96 孔細胞板上進行，每組8 孔，對照溶液和試樣溶液分別設3 孔、對照空白溶液和試樣空白溶液分別設1 孔。加樣步驟見表1，細胞板上依次加入酪氨酸酶、pH 6.8 PBS、DMSO和樣品溶液，37 ℃恒溫10 min；然后將底物溶液加入各孔，隨即放入酶標儀內，反應5 min，測定在475 nm波長處的吸光度，抑制率計算如式（1）所示。熊果苷作為陽性對照，設3 組平行。

表1 反應液組成與體積Table 1 Compositions and volumes of reaction solutions

式中：A1為對照溶液的吸光度；A2為對照空白溶液的吸光度；A3為試樣溶液的吸光度；A4為試樣空白溶液的吸光度。

1.3.3 酪氨酸酶抑制動力學分析

按照上述步驟，固定底物L-酪氨酸質量濃度為2.0 mg/mL，改變EA質量濃度為0、0.02、0.05、0.10 mg/mL，分別與50、100、150、200 U/mL酪氨酸酶進行反應，以酪氨酸酶濃度（U/mL）為橫坐標，反應初速率V（ΔOD475nm/min）為縱坐標作圖，分析EA對酪氨酸酶的抑制作用是否可逆。同樣固定酪氨酸酶濃度為200 U/mL，改變EA質量濃度為0、0.02、0.05、0.10 mg/mL，分別與0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mLL-酪氨酸進行反應。根據Lineweaver-Burk雙倒數法，以底物L-酪氨酸質量濃度的倒數（1/[S])為橫坐標，反應初速率倒數（1/[V]）為縱坐標作圖，以確定EA對酪氨酸酶抑制類型[20]。EA抑制酪氨酸酶的動力學參數通過Lineweaver-Burk方程（式（2））計算：

式中：V為在不同質量濃度底物L-酪氨酸下的初始反應速率/（ΔOD475nm/min）；Vmax為最大反應速率/（ΔOD475nm/min）；Km為米氏常數/（mg/mL）；[S]為底物L-酪氨酸質量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 熒光光譜猝滅分析

參照Li Xiangrong等[21]的方法進行，略有修改。用pH 7.4 PBS配制50 U/mL酪氨酸酶溶液。在10 mL PE管中分別添加50 U/mL酪氨酸酶溶液2.00 mL、不同濃度EA稀釋液2.00 mL和pH 7.4 PBS 1.00 mL，搖勻，將混合液分別在25、31、37 ℃下保溫1 h，待測。設定激發波長為280 nm，激發狹縫和發射狹縫均為5.0 nm，掃描速率為1 200 nm/min，記錄待測液在300～450 nm范圍內的熒光光譜。

EA溶液有很弱的熒光發射信號，基本不會對酪氨酸酶熒光信號造成干擾。因此，本實驗可忽略“內部濾波效應”的干擾。熒光猝滅率（η）用式（3）計算：

式中：F0和F分別為添加不同濃度EA稀釋液前后酪氨酸酶的熒光強度。

1.3.5 同步熒光光譜分析

溶液配制方法同1.3.4節，將混合液在37 ℃下保溫1 h，設置實驗激發和發射波長的差值Δλ為15 nm，測定反應體系在270～350 nm的同步熒光光譜；同時，設置Δλ為60 nm，測定反應體系在260～320 nm的同步熒光光譜，EA終濃度與熒光猝滅實驗終濃度一致。用式（4）計算同步熒光猝滅率：

1.3.6 三維熒光光譜分析

酪氨酸酶溶液（2.00 mL、50 U/mL）、EA溶液（2.00 mL、10.00 mg/L）和pH 7.4 PBS 1 mL充分混合，在37 ℃下保溫1 h，空白溶液代表純酪氨酸酶溶液。在激發波長和發射波長范圍分別為200～340 nm和250～420 nm、增量5 nm的條件下測定三維熒光光譜。

1.3.7 分子對接模擬

從RSCB PDB數據庫中獲取雙孢蘑菇酪氨酸酶（PDB編號：2Y9X；分辨率：2.78 ?）的X射線結構[22]，EA、L-酪氨酸結構來自PubChem數據庫（EA編號：5 281855；L-酪氨酸編號：6057）。根據酪氨酸酶特殊的四聚體結構，保留A鏈進行對接模擬[23]。用AutoDockTools（Ver 1.5.7）軟件將酪氨酸酶進行除水、加氫、加Kollman電荷、并去除原有配體小分子OTR；同時將EA進行加氫操作。以A鏈作為對接鏈，設置網格框（x＝84、y＝88和z＝126，格點數為1.000），以覆蓋所有位點。以最低能量確定最優對接構型，用Pymol軟件[24-25]呈現分子對接三維圖，并用Ligplot＋軟件[26]分析相互作用力。按相同方法進行底物L-酪氨酸與酪氨酸酶、EA與底物-酪氨酸酶復合物的對接。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均3 次平行，利用SPSS 22軟件進行顯著性分析和IC50計算，P＜0.05，差異顯著。采用Microsoft Excel 2016、Origin 2022軟件進行統計分析和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 EA對酪氨酸酶的抑制作用

EA對酪氨酸酶的抑制可以通過IC50體現，以EA質量濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制抑制曲線[27]。由圖1可知，在相同溶劑下，EA和熊果苷在一定質量濃度范圍內對酪氨酸酶有明顯的抑制效果，且抑制率和質量濃度呈正相關關系。通過計算，EA的IC50為0.05 mg/mL，明顯強于陽性對照熊果苷（IC50＝13.13 mg/mL），說明EA能夠明顯抑制酪氨酸酶活性。

圖1 EA（A）和熊果苷（B）對酪氨酸酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of EA (A) and arbutin (B) on tyrosinase

2.2 EA對酪氨酸酶的抑制動力學

2.2.1 EA對酪氨酸酶抑制可逆性分析

為了分析EA對酪氨酸酶抑制作用的可逆性，分別構建了不同質量濃度EA的反應初速率（V）與酪氨酸酶濃度的曲線圖。由圖2可知，4 條擬合曲線均交于原點，隨著EA質量濃度的升高，曲線斜率越來越小，說明EA能夠降低酪氨酸酶催化底物生成多巴色素的速率，但不能使酪氨酸酶完全失活，因此推測EA對酪氨酸酶是可逆抑制[28]。

圖2 不同質量濃度EA抑制酪氨酸酶活性可逆性判斷圖Fig.2 Determination of the reversibility of tyrosinase activity inhibition by EA at different concentrations

2.2.2 EA對酪氨酸酶抑制類型分析

由圖3和表2可知，通過Lineweaver-Burk雙倒數曲線方程作圖，得到了一組相交于第2象限的直線，隨著EA質量濃度的增大，Vmax不斷減少，Km不斷增大，所以推測EA對酪氨酸酶的抑制類型屬于混合型抑制[29]，此結果與Solimine等[13]的實驗結果一致。對直線的斜率和垂直截距對EA質量濃度進行二次作圖，KI和KIS分別為0.2 mg/mL和0.32 mg/mL，結合常數KI＜KIS，說明EA與游離酶的結合比與酶-底物復合物的結合更容易且更緊密[30]。EA一方面通過競爭性抑制作用與酪氨酸酶結合，另一方面通過非競爭性抑制作用與底物-酪氨酸酶復合物結合，說明EA對酪氨酸酶抑制類型是一種競爭性-非競爭性混合型抑制。圖3B、C二次圖均是線性擬合，表明EA與酪氨酸酶有1 個或1 類抑制位點[31]。

圖3 不同質量濃度EA對酪氨酸酶抑制的Lineweaver-Burk雙倒數曲線（A）和斜率（B）、垂直截距（C）對EA質量濃度的二次圖Fig.3 Lineweaver-Burk double reciprocal curves of tyrosinase inhibition by EA at different concentrations (A),slope (B) and vertical intercept (C) versus EA concentration plots

表2 EA對酪氨酸酶的抑制動力學和參數Table 2 Inhibitory kinetics and parameters of EA on tyrosinase

2.3 EA對酪氨酸酶的熒光光譜猝滅分析

2.3.1 EA對酪氨酸酶的熒光猝滅效應

由圖4可知，酪氨酸酶溶液的最大熒光峰發射波長為347 nm，EA對酪氨酸酶的熒光具有特異性猝滅作用。在酪氨酸酶濃度一定的情況下，熒光強度隨EA濃度增加呈現規律性降低，并且峰形不變，最大吸收峰沒有明顯的紅移或藍移。生理條件下（pH 7.4），當EA濃度為13.33 μmol/L時，其在25、31、37 ℃對酪氨酸酶的熒光猝滅率分別為62.18%、58.66%、58.13%，表明EA與酪氨酸酶熒光發色團結合，有效猝滅酶的內源熒光。

圖4 25（A）、31 ℃（B）和37 ℃（C）下EA對酪氨酸酶的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectrum of EA on tyrosinase at 25 (A),31 (B) and 37 ℃ (C)

2.3.2 EA對酪氨酸酶的熒光猝滅機制

為了確定猝滅機制，采用Stern-Volmer方程（式（5））計算熒光發射光譜數據：

式中：Kq為速率常數/（L/（mol·s））；[Q]為EA濃度/（mol/L）；Ksv為猝滅常數/（L/mol）；τ0為EA不存在時酪氨酸酶的平均壽命（τ0＝10－8s）。

由圖5A可知，在實驗濃度范圍內，Stern-Volmer圖呈現良好的線性關系；隨著溫度升高，Ksv降低；同時，Kq遠大于2.0×l010L/（mol·s）（最大動態猝滅常數）[32]，說明猝滅是由EA-酪氨酸酶復合物形成引起的靜態猝滅[33]。

圖5 不同溫度下EA猝滅酪氨酸酶的Stern-Volmer圖（A）和雙對數圖（B）Fig.5 Stern-Volmer plots (A) and double logarithmic plots (B) oftyrosinase quenching by EA at different temperatures

2.3.3 EA與酪氨酸酶的結合常數與結合位點數

EA與酪氨酸酶的結合常數Ka和結合位點數n可根據雙對數方程[34]（式（6））計算：

式中：Ka為結合常數/（L/mol）；n為結合位點數。

通過lg[Q]與lg（（F0－F）/F）求得3 個溫度下的Ka和n值，如圖5B和表3所示，25、31、37 ℃時結合常數Ka分別為3.00×104、3.32×104、3.64×104L/mol，表明EA與酪氨酸酶之間有較強的結合能力。在所研究溫度范圍內，Ka隨溫度的升高而增大，表明復合物隨著溫度升高，穩定性越好。3 個溫度下結合位點數n值都約為1，表明EA在酪氨酸酶只有1 個或者1 類結合位點，此結果與酶抑制動力學實驗結果一致。

表3 不同溫度EA與酪氨酸酶結合常數Ka、結合位點n以及熱力學參數Table 3 Binding constant (Ka),number of binding sites (n) and thermodynamic parameters of interaction between EA and tyrosinase at different temperatures

2.3.4 EA與酪氨酸酶結合的相互作用力

熱力學參數可以根據公式（7）、（8）計算[35]：

式中：ΔG為結合自由能變化/（kJ/mol）；Ka為結合常數/（L/mol）；ΔH為結合焓變/（kJ/mol）；T為反應溫度/K；ΔS為結合熵變/（J/（mol·K））；R為氣體常數（8.314 J/（mol·K））。

由表3可知，ΔG＜0，說明生成EA與酪氨酸酶的結合是自發的；ΔH＞0且ΔS＞0，說明反應吸熱，結合相互作用力主要表現為疏水作用力，但是考慮到酪氨酸酶結構很復雜及EA具有多酚羥基，推測EA與酪氨酸酶結合過程中，可能還存在氫鍵等幾種作用力的協同結果[36]。

2.4 EA對酪氨酸酶的同步熒光光譜分析

通過固定激發波長與發射波長之間的間距（Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm），同時對激發和發射單色器進行掃描所得到的光譜，分別反映蛋白質中親水性氨基酸Tyr殘基和疏水性氨基酸Trp殘基的熒光特性[37]。如圖6A所示，隨著EA的加入，酪氨酸酶在Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm處熒光強度有規律地減弱，說明EA與酪氨酸酶中的兩殘基存在結合作用，導致兩殘基含量降低，與熒光猝滅結果對應。加入EA后，Tyr殘基的最大熒光發射峰沒有發生移動，而Trp殘基的最大熒光發射峰由288.0 nm紅移至290.0 nm，推測EA改變了Trp殘基附近的微環境，使其暴露在親水環境中，微環境極性增強，不利于酪氨酸酶催化反應優勢構象的形成，從而使酪氨酸酶活性受到抑制[38]。如圖6B所示，在同樣的EA濃度下，Trp的猝滅率普遍高于Typ，說明Trp殘基對熒光猝滅過程中的貢獻更大，EA的結合位點更靠近酪氨酸酶的Trp殘基[39]。

圖6 不同濃度EA存在下酪氨酸酶的同步熒光光譜（A）和EA-酪氨酸酶反應體系同步熒光猝滅率對比（B）Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of tyrosinase in the presence of different concentrations of EA (A) and comparison of synchronous fluorescence quenching rates of EA-tyrosinase reaction system at various differences between excitation and emission wavelengths (B)

2.5 EA對酪氨酸酶的三維熒光光譜分析

由圖7可知，加入EA后，酪氨酸酶熒光峰的強度由140.1下降至63.4，激發波長由280.0 nm紅移至285.0 nm，這說明EA的加入改變了酪氨酸酶構象，復合物的形成使得熒光基團的微環境極性增大，疏水能力減弱[40]，這與同步熒光光譜分析結果一致。

2.6 EA與酪氨酸酶相互作用的分子對接模擬分析

根據分析對接模擬結果，EA與酪氨酸酶的最佳構象ΔG為－7.2 kcal/mol（－30.1 kJ/mol），這與37 ℃（ΔG＝－27.08 kJ/mol）熒光結果相近，說明分子對接結果中EA在酪氨酸酶中結合位點可靠。如圖8A、B所示，EA分子鑲嵌于酪氨酸酶的活性中心口袋的催化腔中，并且與周圍的氨基酸形成相互作用。5 個氨基酸殘基Tyr311、Gln307、Trp358、Lys376、Asp357組成的空腔緊密包裹EA小分子，與EA小分子產生疏水作用，減少了水的介入，有利于形成穩定的復合物。由圖8C可知，氨基酸殘基Glu356、Asp312、Thr308、Lys379分別與EA形成6 個氫鍵，鍵長分別為2.91、2.91、2.80、3.32、2.67、3.22 nm，短氫鍵的形成極大地促進EA與酪氨酸酶形成復合物，降低了酪氨酸酶的活性以及酶催化底物的能力[18]。如圖8D和表4所示，L-酪氨酸與酪氨酸酶對接結果中，位于b處的底物與EA在酪氨酸酶活性中心的位置高度重合；底物和EA競爭與酪氨酸酶的Tyr311、Trp358發生疏水相互作用力，同時，底物和EA競爭與酪氨酸酶的Asp312產生氫鍵，說明底物對酪氨酸酶產生競爭抑制特性[41]。如圖8E所示，EA能夠與底物-酪氨酸酶結合形成三元復合物，說明底物對酪氨酸酶也具有非競爭抑制特性。綜上，分子對接形象地表明EA對酪氨酸酶屬于混合型抑制類型，既可以和游離酶結合，又可以與酶-底物復合物結合[42]；EA主要通過疏水作用力和氫鍵與游離酶或酶-底物復合物進行結合，降低了酪氨酸酶銅離子協調酶活性的能力，導致酶活性受到抑制，分子對接驗證并補充了上述光譜實驗結果。

圖8 EA與酪氨酸酶最佳結合姿態的空間結構圖Fig.8 Spatial structure diagram of the optimal binding posture of EA with tyrosinase

表4 酪氨酸酶與EA及其底物的分子對接相互作用數據Table 4 Data of molecular docking interactions of tyrosinase with EA and/or its substrates

3 結論

本實驗探討了EA對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用，并利用抑制動力學、熒光光譜分析結合分子對接模擬技術，系統研究了EA抑制蘑菇酪氨酸酶的分子機制。體外抑制結果顯示，EA對酪氨酸酶有明顯抑制效果，且存在劑量依賴性。抑制動力學結果顯示，EA對酪氨酸酶的抑制作用表現為可逆的混合型抑制類型，EA與游離酶的結合比與酶-底物復合物的結合更緊密。熒光光譜猝滅分析表明，EA對酪氨酸酶存在靜態猝滅作用，兩者主要通過疏水作用力形成EA-酪氨酸酶復合物，只有1 個或1 類結合位點。同步和三維熒光光譜分析表明，EA使酪氨酸酶的微環境極性增大，疏水能力減弱，酪氨酸酶的疏水性氨基酸Trp殘基更靠近結合位點。分子對接模擬分析補充驗證了上述實驗結果，形象地表明EA對酪氨酸酶屬于混合抑制類型，EA主要通過疏水作用力和氫鍵與游離酶或酶-底物復合物進行結合，最終導致酶活性受到抑制。本研究聚焦于EA作為食品保鮮劑對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性及分子機制，但缺乏應用可行性和安全性評估，未來需要對其進行鮮切果蔬抗褐變實驗或南美白對蝦保鮮實驗，以評價其在食品保鮮領域中的作用功效；同時，可進行細胞水平或動物水平的安全性評價，進一步評價其應用前景。