新鮮蓮子不同組織澀味成分與關鍵酶基因差異表達分析

楊銀愛，韓延超，劉瑞玲，陳慧芝，牛 犇，郜海燕，陳杭君

（浙江省農業科學院食品科學研究所，農業農村部果品采后處理重點實驗室，農業農村部蔬菜采后保鮮與加工重點實驗室（部省共建），浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，中國輕工業果蔬保鮮與加工重點實驗室，浙江 杭州 310021）

蓮子（Semen nelumbinis）是蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）的主要食用部分，在我國已有7 000多年的栽培歷史[1]。新鮮蓮子作為水果銷售已日漸流行，研究表明低成熟度蓮子如乳熟期和蠟熟期蓮子適合鮮食[2]。澀味是鮮食蓮子的不良滋味。鮮食蓮子可食用部分可細分為蓮子種皮、去種皮后蓮肉和蓮心三部分，其澀味強度存在差異。

澀味是由多酚類物質與唾液蛋白結合，使其沉淀和聚集，在口腔中產生的干燥不愉快感。在大部分水果如柿子、葡萄、石榴和香蕉中，引起澀味的主要物質是單寧[3]。單寧是類黃酮類次生代謝產物，分子質量為500～3 000 u，可沉淀生物堿、明膠和蛋白質[4-5]。0.03%～0.1%的單寧不僅能強化果實酸味，還能賦予果實清涼口感，但高于1%的單寧則使果實具有強烈的澀味[6-7]。根據化學結構，可將單寧分為縮合單寧和水解單寧[8]。縮合單寧又稱原花青素，由黃烷-3-醇類單體縮合而成，包括兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素等，是水果中澀味的主要來源。Gonzalo-Diago等[9]認為絲質滑順感和干燥感受原花青素單位物質的影響。水解單寧由單糖與沒食子酸及其衍生物形成，在酸性、堿性或酶溶液作用下容易被水解[10]，常見于少數漿果和石榴中[11-12]。根據在甲醇中的溶解性，可將單寧分為不溶性單寧和可溶性單寧。不溶性單寧是單寧的高聚物，可通過調節酸堿度及溫度等環境因素使其變為可溶性單寧[13]。研究表明，可溶性單寧是植物的主要呈澀物質[14-16]。花青素還原酶（anthocyanin reductase，ANR）和無色花青素還原酶（leucocyanidin reductase，LAR）是植物單寧生物合成途徑后期的關鍵酶[17-18]。目前關于澀味的報道主要停留在物質層面，較少從分子層面對澀味進行研究，研究澀味形成相關基因的表達對于探討其調控機制具有重要意義。

本實驗研究新鮮蓮子種皮、去種皮后蓮肉和蓮心中可溶性單寧、不溶性單寧和原花青素含量，同時對ANR和LAR活性進行測定，并結合感官評價和電子舌檢測，通過相關性分析、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等確定引起蓮子澀味的主要物質及其合成途徑關鍵酶基因，旨在為蓮子去澀機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘西湖果蓮’由杭州蓮誼農業開發有限公司提供。于2022年9月21日采收蠟熟期[19]鮮蓮30 個，采后約5 h送至實驗室。從每個蓮蓬里挑選10 顆飽滿且成熟度一致的蓮子，共300 顆蓮子。將去殼后蓮子分為蓮子種皮、去種皮后蓮肉、蓮心三部分。

甲醇、兒茶素、沒食子酸、原花青素標準品（均為色譜級）上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸、濃硫酸（純度95%～98%）、磷酸二氫鈉（均為分析純）上海凌峰化學試劑有限公司；佛丹二氏試劑（分析純）上海雅吉生物科技有限公司；N,N-二甲基乙酰胺（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；OminiPlant RNA Kit(DNase I)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒 南京諾維贊醫療科技有限公司；無水碳酸鈉、無水磷酸氫二鈉（均為分析純）生工生物工程（上海）股份有限公司；單寧酸（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；植物ANR酶聯免疫分析試劑盒、植物LAR酶聯免疫分析試劑盒 上海源桔生物科技中心。

1.2 儀器與設備

微量分光光度計 日本Shimadzu公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Applied Biosystems公司；WD9413C凝膠成像分析系統 北京六一生物科技有限公司；5430 R臺式高速離心機 德國Eppendorf生命科學公司；Stratos 64R高速低溫冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋 上海啟前電子科技有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；ReadMax1900型光吸收全波長酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司；CTongue電子舌 上海保圣實業發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將蓮子種皮、去種皮后蓮肉、蓮心分別用液氮充分研磨，貯于－80 ℃冰箱，用于可溶性單寧、不溶性單寧、原花青素含量的測定。

1.3.2 可溶性單寧含量的測定

參考已有研究方法[20-21]，稱取1 g蓮子組織粉末，加入40 mL 80%甲醇溶液，均質10 min后于3 200×g離心7 min，重復提取3 次，過濾，合并提取液，旋蒸至15 mL。取0.1 mL提取液，依次加入9.3 mL蒸餾水、300 μL佛丹二氏試劑。反應3 min后，加入300 μL飽和Na2CO3溶液。室溫條件下，混合物置于暗處1 h，760 nm波長處測定吸光度。使用沒食子酸制作的標準曲線（0、40、80、120、160、200 μg/mL）對可溶性單寧含量進行定量，單位為mg/g。

1.3.3 不溶性單寧含量的測定

參考已有研究方法[22-23]，可溶性單寧提取后剩下的固體用于不溶性單寧含量的測定。向固體中加入40 mL酸性甲醇（含1% HCl），60 ℃條件下攪拌30 min，然后3 200×g離心7 min，收集上清液。提取3 次，合并上清液并旋蒸至15 mL。使用沒食子酸制作的標準曲線（0、40、80、120、160、200 μg/mL）對不溶性單寧含量進行定量，單位為mg/g。

1.3.4 原花青素含量的測定

參考Prior等[24]的方法，稱取1 g蓮子組織粉末，加入20 mL 100%甲醇，室溫條件下超聲30 min，攪拌1 h后于3 200×g離心10 min，收集上清液。取20 μL樣液，加入2 380 μL甲醇、100 μL現配的二甲基乙酰胺（dimethylacetamide，DMAC）試劑（3 mol/L H2SO4溶液和甲醇配制的2% DMAC等體積混合），平衡20 min，于640 nm波長處測定吸光度。使用兒茶素制作的標準曲線（0、40、80、120、160、200 μg/mL）對原花青素含量進行定量，單位為mg/g。

1.3.5 電子舌檢測

通過電子舌對新鮮蓮子不同組織澀味強度進行測定。稱取蓮子不同組織粉末各1 g，分別加入50 mL蒸餾水，攪拌均勻，超聲15 min后過濾。取15 mL濾液于進樣燒杯中。所用智舌系統包含6 個傳感器，設置靈敏度為1×10－5，測定總時長為156 s。每個樣品重復測定3 次，得不同樣品的感官信息。

采用多個質量濃度的單寧酸（0.00、0.05、0.10、0.25、0.40、0.80、1.00、1.50、1.60、1.75、2.00、2.50、2.75、3.00、3.25、3.50 g/L）進行判別因子分析（dynamic factor analysis，DFA）建模，通過將樣品感官信息導入模型對樣品的澀味強度進行檢驗。

1.3.6 感官評價

參考王俊魁[25]的方法。由12 名身體健康的評審人員組成感官評審小組，年齡在20～24 歲之間。評分采用7 點制，0～7（0＝沒味道，7＝味道最強），對蓮子種皮、去種皮后蓮肉、蓮心進行澀味感官評定。各感官評審員獨立評定，每評定一個樣品，用清水漱口，間隔6 min后再品評下一個樣品，每個樣品重復3 次，最后收集評分結果進行統計分析。

1.3.7 ANR活性的測定

使用植物ANR酶聯免疫分析試劑盒對蓮子不同組織中ANR活性進行測定。稱取0.1 g蓮子組織粉末，加入1 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液，混勻，3 000 r/min離心20 min，收集上清液用于測定。

1.3.8 LAR活性的測定

使用植物LAR酶聯免疫分析試劑盒對蓮子不同組織中LAR活性進行測定。樣品處理與1.3.7節相同。

1.3.9 總RNA提取及RNA檢測

從－80 ℃冰箱中取出樣品，用液氮研磨成粉末后，稱取0.2 g于1.5 mL離心管中，然后按OminiPlant RNA Kit(DNase I)試劑盒說明書提取樣品RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量及完整性，同時使用微量分光光度計檢測RNA純度。

1.3.10 cDNA第一鏈的合成

反轉錄具體操作流程參考HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (＋gDNA wiper)試劑盒說明書。

1.3.11 引物設計與適合性檢驗

ANR和LAR候選基因的序列分別從不同成熟度蓮子轉錄組數據庫和NCBI網站上獲得，然后使用NCBI進行Primer-BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），以上游引物和下游引物DNA溶解溫度在70～90 ℃之間、GC比例55%、自身互補值不高于4、3’互補值不高于2為原則篩選引物，符合要求的引物委托杭州有康生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 候選基因引物設計序列信息Table 1 Information of gene primers used for qRT-PCR

將蓮子不同組織的cDNA 混合，按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書對引物進行驗證，選擇擴增曲線上升，溶解曲線單峰的引物進行下步實驗。

1.3.12 實時PCR（real-time PCR）擴增

real-time PCR擴增具體操作流程參考ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書。

1.4 數據處理及分析

上述實驗所得數據除特殊說明外，均重復3 次。數據處理采用Excel軟件，作圖采用Excel、GraphPad Prism 8.0和SIMCA 14.1軟件。采用SPSS Statistics 19軟件進行單因素方差分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）及Pearson相關性分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蓮子不同組織可溶性單寧、不溶性單寧、總單寧和原花青素含量分析

由圖1可知，蓮子種皮、蓮肉和蓮心中可溶性單寧含量均較低，其中蓮心中可溶性單寧含量最低，約2 mg/100 g，而蓮肉中可溶性單寧含量較蓮子種皮高。蓮子種皮中不溶性單寧和總單寧的含量均最高，超過30 mg/100 g，顯著高于蓮肉和蓮心（P＜0.05）。原花青素含量在蓮心中最高，超過80 mg/g，顯著高于蓮子種皮和蓮肉（P＜0.05）。

圖1 蓮子不同組織可溶性單寧、不溶性單寧、總單寧和原花青素含量Fig.1 Contents of soluble tannins,insoluble tannins,total tannins and proanthocyanidins in different tissues of lotus seeds

2.2 電子舌檢測蓮子不同組織澀味強度

由圖2A可知，t[1]＝0.511，t[2]＝0.162，t[3]＝0.106，前3 個PC的累計貢獻率為77.9%（介于75%～85%），區分程度（discrimination index，DI）＝97.51，表明電子舌可以有效區分不同質量濃度的單寧酸，該組數據可用于DFA建模。圖2B中不同顏色的區域通過建模得到，未知樣品的點落在哪個區域說明該樣品的總體性質接近于所建模型樣品。選擇質量濃度分別為1.75 g/L和0.05 g/L的單寧溶液進行模型檢驗，發現兩種質量濃度單寧溶液均位于對應區域，表明該模型的準確性較高。由圖2C可知，蓮子不同組織澀味強度較集中，且均位于3.50 g/L單寧標準溶液區域內，表明蓮子不同組織總體性質接近3.50 g/L單寧標準溶液。如圖2D所示，PC1和PC2的貢獻率分別為72.0%和12.1%，累計貢獻率為84.05%（介于75%～85%），DI＝95.29（大于80），因此蓮子種皮、蓮肉、蓮心的滋味具有明顯差異，且蓮子種皮和蓮心的滋味相近，而蓮肉滋味與其差異較大。

圖2 電子舌檢測蓮子不同組織澀味的PCAFig.2 PCA of astringency in different tissues of lotus seeds detected by electronic tongue

2.3 蓮子不同組織澀味強度的感官評價

如表2所示，蓮子種皮、蓮肉和蓮心的澀味感官評分均低于2.50，表明蓮子種皮、蓮肉和蓮心的澀味強度均較弱。其中蓮肉的感官評分為2.06±0.31，蓮子種皮的評分為1.61±0.19，蓮心的評分則小于1.00，表明蓮肉的澀味強度較大，其次為蓮子種皮和蓮心。

表2 不同蓮子組織感官評分Table 2 Sensory scores for astringency in different tissues of lotus seeds

2.4 蓮子不同組織澀味關鍵貢獻化合物篩選

以可溶性單寧、不溶性單寧、總單寧、原花青素含量為自變量X，以澀味感官評分為因變量Y，進行OPLS-DA。本次分析中自變量擬合指數（）為1，因變量擬合指數（）為0.993，模型預測指數（Q2）為0.981，R2和Q2超過0.5表示模型擬合結果可接受。如圖3A所示，經過200 次置換檢驗，Q2回歸線與縱軸的相交點小于零，說明模型不存在過擬合，模型檢驗有效，該結果可用于篩選對蓮子澀味有貢獻的化合物。一般認為VIP值＞1的化合物對澀味具有貢獻，且值越大貢獻越大，圖3B顯示，可溶性單寧、不溶性單寧、總單寧均對蓮子澀味有貢獻，其中可溶性單寧的貢獻大于不溶性單寧和總單寧。由圖3C可知，兩個PC累積貢獻率為98.8%（大于75%～85%），可以解釋樣品絕大部分信息，根據可溶性單寧、不溶性單寧、總單寧和原花青素含量，可將蓮子種皮、蓮肉和蓮心區分開。

圖3 蓮子不同組織澀味物質和澀味強度的OPLS-DAFig.3 OPLS-DA of astringent substances and astringent intensity in different tissues of lotus seeds

2.5 蓮子不同組織澀味物質合成關鍵酶活性分析

ANR和LAR能將無色花青素、花青色素、花色苷、飛燕草素、無色飛燕草素催化形成原花青素。由圖4可知，蓮心ANR和LAR活性最高，分別為173.50 ng/mL和24.70 ng/mL，其次為蓮肉和蓮子種皮，因此蓮心中單寧的合成可能最旺盛，而蓮肉和蓮子種皮中單寧合成能力次之。

圖4 蓮子不同組織單寧合成關鍵酶活性Fig.4 Key enzyme activities involved in tannin synthesis in different tissues of lotus seeds

2.6 蓮子不同組織澀味物質合成關鍵酶基因表達分析

如圖5 所示，SnANR1、SnANR2、SnANR3、SnANR4、SnANR5、SnANR6、SnANR7、SnANR8、SnANR9為ANR相關基因，SnLAR1、SnLAR2、SnLAR3為LAR相關基因。SnANR3、SnANR8和SnANR9相對表達量變化趨勢與ANR活性變化趨勢一致，均為蓮心最高，其次為蓮肉和蓮子種皮，表明SnANR3、SnANR8和SnANR9可能調控ANR合成。SnLAR2相對表達量與LAR活性變化趨勢一致，為蓮子種皮最高，其次為蓮肉和蓮心，表明SnLAR2可能調控LAR合成。

圖5 蓮子不同組織ANR和LAR相關基因相對表達量Fig.5 Relative expression of ANR and LAR genes in different tissues of lotus seeds

2.7 相關性分析

對可溶性單寧、不溶性單寧、總單寧和原花青素含量、ANR和LAR活性、SnANR3、SnANR8、SnANR9和SnLAR2的相對表達量進行相關性分析，結果如表3所示，澀味強度與ANR和SnANR9相對表達量相關系數為0.999，且呈顯著相關，表明ANR是影響蓮子澀味強度的關鍵酶，而SnANR9是影響蓮子澀味物質合成的重要基因。

表3 澀味物質含量、單寧合成關鍵酶及基因間Pearson相關系數Table 3 Pearson correlation coefficients among astringent substance contents,key enzymes and genes associated with tannin synthesis

3 討論

以往對果蔬澀味研究較多[14,26-30]，其中大部分與柿子相關，鮮有蓮子澀味的相關報道，澀味是影響消費者對鮮食蓮子嗜好性的關鍵滋味。

本研究中，OPLS-DA表明不溶性單寧、可溶性單寧和總單寧均對蓮子澀味有貢獻，其中可溶性單寧含量對蓮子澀味的貢獻大于不溶性單寧和總單寧含量，這與李雪蕾[16]及章志遠[31]等對麻竹筍的研究結果一致。可溶性單寧是引起澀味的主要物質[13]，其與口腔中的蛋白結合產生沉淀，引起口腔的皺縮和收斂感。蓮子種皮中不溶性單寧和總單寧含量最高，但其澀味強度較小，表明不溶性單寧不呈澀味。Chen Wenxing等[32]發現，不溶性單寧不呈澀味，將可溶性單寧轉化為不溶性單寧（凝固效應），可使柿子實現自然脫澀。羅曉文[6]、張寶善[7]等發現，含量為0.03%～0.1%的單寧不僅能使果實具有清涼口感，還能起到強化酸味的作用，而高于1%的單寧具有強烈澀味。本研究表明，蓮子不同組織中可溶性單寧含量低于0.03%，而蓮子種皮中總單寧含量為0.03%～0.1%，蓮肉和蓮心中總單寧含量低于0.03%，因此蠟熟期蓮子中的單寧對其優良風味具有促進作用。

目前有使用SA402B電子舌檢測不同滋味強度的報道[33]，而CTongue電子舌多用于不同樣品滋味差異程度的測定[34]，鮮見使用CTongue電子舌對蓮子澀味進行定量分析的研究。本研究使用CTongue電子舌對蓮子種皮、去種皮后蓮肉和蓮心的澀味強度進行測定，發現所檢測蓮子組織信號值遠大于不同濃度單寧標準液信號值，檢測結果無法對蓮子不同組織澀味進行區分，這是因為蓮子中其他化學物質的信號值較大，影響蓮子澀味物質的檢測，表明CTongue電子舌不適用于蓮子澀味的測定。

對蓮子不同組織中ANR和LAR活性進行分析，發現蓮心中這兩種酶活性最大，表明蓮心中單寧合成較蓮子種皮和果肉旺盛，但總單寧則是蓮子種皮中含量最高，約占完整蓮子籽粒的60%，可能是因為蓮心中單寧代謝遠旺盛于蓮子種皮。這與蠶豆相似，研究發現完整蠶豆籽粒單寧含量的60%～90%集中于種皮[35]。

4 結論

本研究測定了新鮮蓮子種皮、去種皮后蓮肉和蓮心中可溶性單寧、不溶性單寧和原花青素含量，結合感官評價和電子舌檢測，通過OPLS-DA和相關性分析明確了導致蓮子澀味的主要物質，以及對蓮子澀味有重要影響的酶和基因。結果表明：引起蓮子澀味的主要物質為可溶性單寧；蠟熟期蓮子中的單寧對其優良風味形成具有正向作用；ANR是影響蓮子澀味強度的關鍵酶，SnANR9是影響蓮子澀味物質合成的重要基因。