金屬抗菌肽SIF4對大腸桿菌拓撲異構酶活性及胞內核酸合成的影響

李玉珍，肖懷秋, ，周慧恒，李 籃，匡 燕，劉 淼，趙謀明

（1.湖南化工職業技術學院制藥與生物工程學院，湖南 株洲 412000；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510000）

大腸桿菌（Escherichia coli）是引起食品公共安全事故與食物中毒的重要致病菌，已成為當前食品公共衛生主要威脅之一[1]，特別是多重交叉耐藥菌株的出現使食源性致病菌防控變得復雜。姜曉冰等[2]分析河南新鄉超市和農貿市場鮮肉來源的E.coli質粒介導喹諾酮耐藥基因（PMQR）分布及耐藥決定區靶基因（QRDR）突變情況發現，PMQR基因陽性菌株檢出率高達7.8%，QRDR靶位突變普遍存在；徐旭等[3]采集陜西寶雞地區冷凍食品樣本360 份，E.coli檢出率為13.6%，毒力基因以腸外致病性相關基因FyuA和iss檢出率最高，部分菌株對13 種抗生素耐藥；楊承霖等[4]對從四川不同養殖場患病動物樣本分離的444 株E.coli分析發現，雞源和豬源樣本超廣譜β-內酰胺酶菌株檢出率分別為42.2%和12.8%，耐藥基因以blaTEM-1、blaTEM-52、blaCTX-M-55、blaCTX-M-65和blaCTX-M-14為主要流行亞型并以水平傳播為主。

拓撲異構酶是所有細菌DNA復制轉錄、染色體分離、基因表達調控及細胞分裂等過程的關鍵代謝調控酶，且結構相對保守，人基因組沒有編碼該基因，已成為當前抗菌藥物研究重要且理想的新效應靶點[5-6]，分為I和II兩個亞型[7]。I型拓撲異構酶最早在E.coli中被發現，最初稱為ω蛋白，由topA基因編碼，分為N端催化片段（67 kDa）和C端鋅指結構域（30 kDa），對負超螺旋DNA解鏈是必需的[8]。II型拓撲異構酶含GyrA（105 kDa）和GyrB（95 kDa）兩個亞基，GyrA亞基與DNA鏈斷裂和重連有關，參與DNA結合、裂解和連接反應，GyrB亞基有合成ATP功能，為GyrA亞基參與的DNA切割/連接反應供能[9]。氟喹諾酮類抗生素和氨基香豆素可分別靶向作用于GyrA亞基和GyrB亞基發揮抗菌效應[10-11]。山蒼子精油對拓撲異構酶I和II有抑制作用且呈良好量效正相關[12]，喜樹堿可靶向拓撲異構酶I從而阻斷胞內核酸合成，香豆霉素可靶向拓撲異構酶并干擾酶DNA復合物形成[13]，三唑鄰苯二甲酸衍生物可抑制拓撲異構酶II活性并能嵌入DNA與拓撲異構酶形成復合物[14]；Polydatin僅對拓撲異構酶II有抑制作用，可優先與DNA輕微凹槽結合[15]。課題組研究發現，金屬抗菌肽（簡稱金抗肽）SIF4對E.coli有較好抑制活性，可破壞菌體細胞質膜結構并誘導胞內物質泄漏和造成細胞聚沉[16]，也可調控糖酵解途徑和影響呼吸代謝等發揮非細胞質膜靶向抑菌活性[17-18]，但對拓撲異構酶和胞內核酸生物合成的影響尚不明確。為闡明基于胞內拓撲異構酶效應靶點的非細胞質膜抑菌機理，實驗研究金抗肽SIF4對拓撲異構酶I/II以及胞內核酸合成的影響，以期為金抗肽SIF4在食源性E.coli的生物防控中提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金抗肽SIF4為課題組制備，對E.coli最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為0.4 mg/L[16]；E.coliATCC25922 上海保藏生物技術中心；ATP、pBR322DNA、蛋白酶K、溶菌酶、RNase、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）生工生物工程（上海）股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、NaCl 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外分光光度計 日本島津公司；H1850R高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Infinite F200 pro多功能酶標儀 瑞士帝肯公司；DanoDrop超微量分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；YXQ-LS-70A立式高壓滅菌鍋 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；瓊脂糖凝膠電泳裝置 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

將菌體接種至LB培養基，37 ℃、120 r/min培養過夜。取10 mL菌液5 000 r/min離心10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌菌體2 次，5 000 r/min離心10 min，菌體沉淀重懸于4 mL TE緩沖液，加入8 μL溶菌酶（50 mg/mL）37 ℃溫育30 min；加入10 μL RNAase（10 mg/mL）和0.5 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（10 g/100 mL）溶液，37 ℃溫育30 min；加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），37 ℃溫育90 min，加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）混勻，8 000 r/min離心5 min。上清液轉入離心管，加入1.8 mL乙酸鈉（3 mol/L）、18 mL冰無水乙醇，12 000 r/min離心2 min，重復抽提2 次，沉淀即基因組DNA。沉淀用70%乙醇溶液洗滌一次，室溫干燥。加入0.5 mL TE緩沖液溶解并測定OD260nm和OD280nm，－20 ℃保藏備用[19]。

1.3.2 金抗肽SIF4對基因組DNA的影響

將基因組DNA溶于TE緩沖液，加入金抗肽SIF4使終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以不加SIF4為對照組，混勻后室溫放置60 min。取混合液9 μL與1 μL 10×上樣緩沖液混勻，用0.8%瓊脂糖凝膠（EB，5 μg/L）電泳檢測（100 V，30 min）DNA遷移情況，初步判定SIF4與基因組DNA結合方式[20]。

1.3.3 金抗肽SIF4對DNA拓撲異構酶的影響

對數生長期菌液于6 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS清洗3 次，于TMN溶液（NaCl 0.295 g、MgCl20.072 5 g，溶于1.0 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），并定容至200 mL）中洗滌1 次，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，沉淀重懸于1 mL粗酶提取緩沖液中，冰浴30 min。超聲破碎菌體（750 W，5 s，間隔30 s，循環10 次），破碎液于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液為粗酶提取液（含拓撲異構酶I和II），4 ℃冰箱保存備用。1）拓撲異構酶I活性測定：在含0.50 μg pBR322 DNA的離心管中加入2.5 μL拓撲異構酶解旋緩沖液I，用三蒸水定容至20 μL，37 ℃溫育30 min，加入2 μL SDS（10%）及1 μL蛋白酶K（10 mg/mL）終止反應，37 ℃孵育30 min，取8 μL樣品加入2 μL 5×上樣緩沖液于1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察；2）拓撲異構酶II活性測定：在含0.50 μg pBR322 DNA的離心管中加入2.5 μL 拓撲異構酶解旋緩沖液II，用三蒸水定容至20 μL，37 ℃孵育30 min，加入2 μL SDS（10%）和1 μL蛋白酶K（10 mg/mL）終止反應，37 ℃孵育30 min，取8 μL樣品加入2 μL 5×上樣緩沖液于1%瓊脂糖凝膠中電泳，染色后觀察；3）SIF4對拓撲異構酶I和II活性影響的測定：拓撲異構酶I反應體系為0.5 μg pBR322 DNA、2.5 μL DNA解旋緩沖液I、2.5 μL粗酶提取液（拓撲異構酶I活性約1.0 U），三蒸水定容至20 μL；拓撲異構酶II反應體系為0.5 μg pBR322 DNA、2.5 μL DNA解旋緩沖液II、2.5 μL粗酶提取液（拓撲異構酶II活性約1.0 U）、4 mmol/L ATP，三蒸水定容至20 μL，電泳后染色觀察。

1.3.4 金抗肽SIF4對胞內DNA和RNA生物合成的影響

將菌種接種至LB液體培養基中，加入金抗肽SIF4至終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以未添加SIF4為對照組，37 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養12 h。1）總DNA提取：取菌液3 mL于5 000 r/min離心10 min，PBS洗滌3 次，菌體沉淀重懸于567 μL TE緩沖液（含10 g/L溶菌酶），室溫處理5 min；加入30 μL SDS（100 g/L）和3 μL蛋白酶K（20 mg/mL），37 ℃溫育60 min，加入100 μL NaCl（5 mol/L），再加入80 μL十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）溶液（50 g/L CTAB、0.5 mol/L NaCl），65 ℃溫育10 min。加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）抽提，加入60%體積異戊醇混勻并沉淀DNA，用70%乙醇溶液洗沉淀2 次后用TE溶解沉淀，4 ℃備用或－20 ℃保存[21]。用酶標儀測定樣本230、260 nm和280 nm波長處吸光度。2）總RNA提取：取菌液3 mL于5 000 r/min離心10 min，PBS洗滌3 次，將菌體沉淀重懸于200 μL TE緩沖液（含10 g/L溶菌酶），室溫處理5 min。加入1 mL TRIzol試劑并反復抽吸，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，轉移上清液至離心管中，室溫靜置5 min，加入1/5體積的氯仿用力振搖15 s，室溫靜置2～3 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，轉水相至新離心管并加入等體積異丙醇，上下輕輕顛倒混勻，室溫靜置10 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75%預冷乙醇溶液（DEPC水配制），混勻，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清液，室溫倒置于紙巾上5～10 min使乙醇揮發，用30～50 μL RNase-free水重溶，55～60 ℃溫育10 min，加入1 μL RNA酶抑制劑后于4 ℃備用或－20 ℃保存備用[22]。

1.3.5 胞內總DNA和總RNA含量的測定

根據Lambert-Beer定律可知，A＝εcp，因此，c＝1/εp×A，式中，c為樣本濃度，A為樣本吸光度，ε為樣本中物質的摩爾消光系數，p為光程/cm。令1/εp為系數f（ng·cm/μL），則c＝f×A。對于Nanodrop，dsDNA的系數f＝50 ng·cm/μL，ssDNA的系數f＝33 ng·cm/μL，RNA的系數f＝40 ng·cm/μL[23]。核酸最大吸收峰為260 nm，上式中A為260 nm波長處吸光度，根據吸光度A260nm和f可計算出樣本中總DNA和總RNA含量。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 SIF4對基因組DNA的影響

小分子物質與基因組DNA結合后會使DNA在瓊脂糖凝膠上的遷移率出現不同程度的滯后。SIF4與基因組DNA結合凝膠阻滯電泳結果如圖1所示。可以看出，對照組與實驗組DNA電泳圖譜均呈現單一條帶，無明顯彌散現象，各條帶明暗無顯著差異，說明SIF4與基因組DNA結合后并未破壞基因組DNA結構完整性，與brevilaterin作用一致[24]，但與ε-聚賴氨酸作用機制不同，ε-聚賴氨酸與基因組DNA結合后可破壞其雙螺旋結構[25]；研究還發現，SIF4與基因組DNA結合后，出現明顯阻滯現象，阻滯程度與金抗肽SIF4質量濃度呈正相關，2 MIC組的基因組DNA樣本在瓊脂糖凝膠上遷移距離最短，其次為MIC組，1/2 MIC組遷移距離最長，推測抗菌肽SIF4可與基因組DNA以類似EB嵌插方式強力結合并影響基因組DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率[26]。

圖1 SIF4與基因組DNA結合凝膠阻滯圖Fig.1 Gel retardation analysis of SIF4 binding to genomic DNA

2.2 SIF4對DNA拓撲異構酶I的影響

拓撲異構酶I是細菌胞內廣泛存在的非ATP依賴型酶，催化DNA單鏈斷裂和重連，主要參與DNA超螺旋解旋及復制、轉錄和重組等反應。超螺旋狀態（Form I）是pBR322 DNA主要存在形式，在拓撲異構酶的催化作用下可解旋形成線性或缺口形式（Form II）。分析金抗肽SIF4處理后pBR322 DNA狀態的變化可解析SIF4對拓撲異構酶I活性的影響（圖2）。

圖2 SIF4對拓撲異構酶I結構的影響Fig.2 Effect of SIF4 on topoisomerase I structure

由圖2可以看出，對于拓撲異構酶I，空白對照組pBR322 DNA主要以Form I形式存在，電泳條帶明亮。金抗肽SIF4處理后，實驗組在拓撲異構酶I作用下，Form II條帶變亮，Form I條帶變暗，說明pBR322 DNA在拓撲異構酶I作用下，DNA存在形式發生了顯著變化，拓撲異構酶I將超螺旋Form I形式解鏈成線性或缺口的Form II形式[27]。由圖2還可以看出，1/2 MIC、MIC和2 MIC組的pBR322 DNA解旋作用被不同程度抑制，與陰性對照組相比，Form I增多，Form II減少，1/2 MIC、MIC和2 MIC組的Form II條帶漸暗，表明金抗肽SIF4可抑制拓撲異構酶I活性。

2.3 SIF4 對DNA拓撲異構酶II的影響

拓撲異構酶II可斷裂DNA雙鏈并重連，是一種ATP依賴性酶，主要介導DNA解旋、斷裂和重排[28]。分析SIF4處理后pBR332 DNA存在形式的變化可解析其對拓撲異構酶II的影響。

由圖3可以看出，對拓撲異構酶II來說，空白對照組Form I條件較亮，實驗組中Form II條帶比Form I條帶明亮，說明pBR332 DNA存在形式發生改變，超螺旋的Form I形式解鏈成了線性或缺口的Form II形式。由圖3可以看出，在1/2 MIC、MIC和2 MIC組別中，Form I條帶相對較亮，而Form II條帶較暗，說明pBR322 DNA仍以超螺旋的Form I形式為主，線性或缺口的Form II形式較少，據此可推斷金抗肽SIF4對拓撲異構酶II抑制作用相對較弱，主要抑制拓撲異構酶I的活性，借此影響DNA單鏈斷裂和重連，影響超螺旋解鏈，從而調控DNA復制、RNA轉錄以及蛋白質翻譯等生物過程[29]。

圖3 SIF4對DNA拓撲異構酶II結構的影響Fig.3 Effect of SIF4 on DNA topoisomerase II structure

2.4 SIF4對胞內總DNA和總RNA生物合成的影響

質量較好的基因組DNA其OD260nm/OD280nm比值范圍為1.6～1.8，小于1.6可能受蛋白質污染，大于1.8可能含RNA，通常情況下，OD260nm/OD230nm應大于2，若比值小于1.8，可能含有胍鹽等污染物[30]。RNA樣本OD260nm/OD280nm比值范圍一般為1.9～2.1，小于1.9可能有蛋白質殘留，大于2.1時RNA可能發生降解，若OD260nm/OD230nm比值小于2.0，可能殘留異硫氰酸胍和β-巰基乙醇等試劑[22]。實驗數據表明，抽提的各實驗組DNA樣本，其OD260nm/OD280nm比值范圍在1.95～1.97，OD260nm/OD230nm比值均大于2，RNA樣本OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm均大于2.0，說明抽提的DNA和RNA樣本質量較好。經金抗肽SIF4處理12 h后，E.coli各實驗組樣本總DNA和總RNA含量如圖4所示。

圖4 SIF4對總DNA（A）和總RNA（B）的影響Fig.4 Effect of SIF4 on total DNA (A) and RNA (B)

由圖4A可以看出，1/2 MIC組與對照組相比，胞內總DNA含量無顯著差異（P＞0.05），MIC組和2 MIC組間總DNA含量有顯著差異（P＜0.05），且與對照組相比，胞內總DNA含量均顯著降低（P＜0.05），表明經1/2 MIC金抗肽SIF4處理12 h后，胞內總DNA合成量并沒有顯著降低，但經MIC和2 MIC金抗肽SIF4處理后，胞內DNA合成受到明顯抑制，與金抗肽SIF4對拓撲異構酶作用趨勢一致。由圖4B可以看出，1/2 MIC組與對照組胞內RNA含量也無顯著差異（P＞0.05），而相比對照組，MIC組和2 MIC組胞內RNA含量顯著降低（P＜0.05），且MIC組和2 MIC組組間也存在顯著差異（P＜0.05），由此可說明，金抗肽SIF4對E.coli胞內總DNA和總RNA合成的抑制效應與處理劑量存在正相關關系，與拓撲異構酶活性抑制規律基本一致。

3 討論與結論

DNA拓撲異構酶主要通過改變DNA的拓撲結構影響基因復制、表達和調控。拓撲異構酶I近似球形，直徑約65 ?，由4 個結構域組成，酶促活性位點包埋于結構域I和III之間（圖5）。N端67 kDa多肽片段是原核生物幾乎所有該類型酶的同源保守序列，可作為抗菌藥物效應靶點[30]，C端鋅指結構域可結合鐵，結合后表現為拓撲活性減弱或喪失[31]。

圖5 E.coli拓撲異構酶I的結構Fig.5 Topoisomerase I structure from E.coli

金抗肽SIF4結合鋅指結構域后，拓撲異構酶I活性降低可能與亞鐵與鋅指結構域結合而影響其拓撲活性并與影響胞內鐵參與的氧化還原系統有關[32-33]。拓撲異構酶I是一個含有3 個鋅指結構域的經典蛋白，結構中第1個和第2個鋅是維持拓撲異構酶I空間構象和拓撲活性必需的，第3個鋅指結構常不參與鐵結合，對拓撲異構酶活性影響有限[34]，拓撲異構酶I活性與結合金屬類別無關，而與結合金屬數目有關[34]。II型拓撲異構酶含GyrA和GyrB兩個亞基，亞基間以異四聚體（A2B2）形式結合，GyrA亞基包含N末端斷裂-重聚結構域和羧基末端結構域（CTD），GyrB亞基包含ATP酶結構域和Toprim結構域（圖6），其結構中內源依賴DNA的ATP酶是解旋供能主要來源[35]。

圖6 E.coli拓撲異構酶II結構Fig.6 Topoisomerase II structure from E.coli

拓撲異構酶II抑制劑可通過嵌入方式插入到斷裂的DNA鏈，形成抑制劑-DNA-拓撲異構酶穩定復合物，從而阻礙DNA重連并阻止拓撲結構改變，使胞內積累大量斷裂DNA并激發SOS-DNA修復反應，若修復無法完成則誘導菌體細胞進入程序性死亡[36]。研究發現，金抗肽SIF4對拓撲異構酶II活性抑制較弱，主要通過抑制拓撲異構酶I活性影響DNA解鏈等發揮抑菌活性，類似茚異喹啉作用機制[37]，相異于Polydatin[15]作用機制，Polydatin僅對拓撲異構酶II有抑制作用。凝膠阻滯結果表明，金抗肽SIF4可與基因組DNA以嵌插方式強力結合。課題組認為，金抗肽SIF4可能與DNA-拓撲異構酶I二元復合物發生結合并形成拓撲異構酶I-DNA-SIF4三元復合物，該復合物積累會阻止拓撲異構酶I對DNA鏈的解鏈、斷裂DNA重連及DNA切口修復等產生不同程度的影響。前期研究發現，SIF4處理后，E.coli內源ROS得到不同程度增強，可能與斷裂DNA未能得到及時修復和斷裂DNA累積有關[17]。研究還發現，經金抗肽SIF4處理后，胞內總DNA和總RNA生物合成均受到不同程度抑制，抑制效果與處理劑量呈正相關，胞內核酸合成生物量變化趨勢與拓撲異構酶受抑制變化基本同步，可能是由于金抗肽SIF4抑制了DNA拓撲異構酶I活性，對DNA的解鏈和拓撲異構結構改變產生了影響，DNA復制、RNA轉錄和蛋白質翻譯等下游生物活動受到影響，從而表現抑制E.coli增殖的效果[38]。下一步擬將通過分子對接手段研究金抗肽SIF4與DNA拓撲異構酶I的對接靶點，以進一步闡明金抗肽SIF4與DNA拓撲異構酶的互作機制[39]。