人源分離長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種的體外益生特性分析

王明芳，陳麗瀾，張雪玲，田豐偉，倪永清,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

人體腸道菌群在整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程處于動(dòng)態(tài)變化，但是在生命早期最關(guān)鍵的2～3 歲嬰幼兒階段，腸道微生物逐漸趨于成人化，之后處于相對(duì)穩(wěn)定階段[1]。其中，隨著宿主年齡的變化，雙歧桿菌（Bifidobacterium）種群結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化[2]。在正常順產(chǎn)健康的母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道內(nèi)，由于母乳寡糖特殊的益生元功能[3]，以專性代謝各種母乳寡糖的兩歧雙歧桿菌（B.bifidum）、長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種（B.longumsubsp.longum）、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種（B.longumsubsp.infantis）和短雙歧桿菌（B.breve）為優(yōu)勢(shì)雙歧桿菌種，被定義為“嬰兒型雙歧桿菌”[4]。而在成年化人腸道中，占主導(dǎo)地位的是B.longumsubsp.longum、青春雙歧桿菌（B.adolescentis）、假小鏈雙歧桿菌（B.pseudocatenulatum）和鏈狀雙歧桿菌（B.catenulatum），被定義為“成人型雙歧桿菌”[5]。其中，B.longumsubsp.longum在嬰幼兒、成人甚至百歲老人腸道中普遍存在[6]。因此，就發(fā)生和母嬰間垂直傳遞來(lái)說(shuō)，嬰兒和成人腸道雙歧桿菌的種類并沒有明確的界限[4]。實(shí)際上B.longumsubsp.longum在更寬泛年齡段人群的發(fā)生取決于其高度的遺傳多樣性和靈活的聚糖代謝能力，以及對(duì)宿主腸道多樣的飲食適應(yīng)性[7-8]。

數(shù)百萬(wàn)年來(lái)，由于人類與以雙歧桿菌為代表的腸道專性共棲菌群的共生，這些腸道微生物譜系和人類相互適應(yīng)并形成了緊密的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，被稱為共生體[9]。在人類的生產(chǎn)實(shí)踐中，人口大規(guī)模遷移往往伴隨著生活方式的周期性變化，主要反映在各個(gè)民族群體生存環(huán)境和飲食習(xí)慣的差異上[10]。腸道微生物的共生是建立在人類長(zhǎng)期特色飲食中聚糖類化合物營(yíng)養(yǎng)代謝的互惠關(guān)系[11]。此外，宿主的遺傳決定了母乳寡糖和腸道腸上皮黏液層糖蛋白的合成，從而使人類遺傳也會(huì)影響腸道重要共生細(xì)菌的多樣性和組成[12]。因此，人類飲食和遺傳差異將會(huì)對(duì)腸道微生物組成、物種組成甚至是菌株水平產(chǎn)生宿主的選擇性[13]。可以預(yù)期不同民族來(lái)源的腸道菌群蘊(yùn)含豐富的益生菌菌株資源。

目前報(bào)道顯示，B.longumsubsp.longum在治療胃腸道相關(guān)疾病、維持腸道微生物平衡、調(diào)節(jié)宿主免疫、緩解過(guò)敏癥狀以及抗感染等方面展現(xiàn)出卓越的益生特性，在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域作為潛在益生菌資源受到普遍關(guān)注[14]。本研究基于新疆地域?qū)拸V、各民族之間很少通婚的區(qū)域特點(diǎn)，針對(duì)新疆伊寧縣哈薩克族學(xué)齡兒童，對(duì)其糞便中雙歧桿菌進(jìn)行分離鑒定，重點(diǎn)開展占優(yōu)勢(shì)的B.longumsubsp.longum菌株的耐酸、耐膽鹽能力、抑菌活性、抗生素耐藥性、體外抗氧化能力、碳水化合物代謝等體外益生特征實(shí)驗(yàn)。從中篩選具有潛在益生特性的菌株，以期為后期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)開發(fā)適應(yīng)特定區(qū)域人群的高活性益生雙歧桿菌及產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

19 份哈薩克族學(xué)齡兒童糞便樣品采集自新疆維吾爾自治區(qū)伊寧縣某小學(xué)。提前聯(lián)系好志愿者，簽訂知情同意書，記錄志愿者年齡、性別、身高、體質(zhì)量和飲食習(xí)慣等基本信息。糞便采集前3 個(gè)月內(nèi)，兒童均未使用過(guò)抗生素，無(wú)益生菌攝入，無(wú)胃腸道疾病。采樣時(shí)，取樣人員戴無(wú)菌手套，用取樣勺采集糞便約5～10 g，糞便自采集后立即放入已滅菌的取樣管，貼標(biāo)簽后置于車載冰箱－10 ℃冷藏，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種分離。

1.1.2 指示菌

抑菌實(shí)驗(yàn)選用6 種常見致腹瀉的病原菌，分別為致瀉大腸埃希氏菌CICC 10411、出血性大腸埃希氏菌CICC 21530、鼠傷寒血清型腸沙門氏菌腸亞種CICC 10420、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌CICC 10421、單核細(xì)胞性李斯特菌CGMCC 1.9136、血清型腸炎沙門氏菌腸亞種CGMCC 1.10754，均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

TaqPlus Master Mix（2×）南京諾唯贊生物科技股份有限公司；0.22 μm微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；Wilkins-Chalgren厭氧瓊脂培養(yǎng)基 山東拓普生物工程有限公司；改良MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蛋白胨酵母浸膏葡萄糖（peptone yeast extract glucose，PYG）培養(yǎng)基、胰胨大豆瓊脂（trypcasein soy agar，TSA）培養(yǎng)基北京博奧拓達(dá)科技有限公司；18 種碳源（純度≥90%）上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG520厭氧培養(yǎng)箱 英國(guó)DS公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；TC-512聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 英國(guó)Techne公司；PoerPac Universal水平電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 雙歧桿菌的分離鑒定

將l g新鮮糞便用9 mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，涂布于Wilkins-Chalgren固體培養(yǎng)基[15]，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h，每個(gè)樣品選取30 個(gè)菌落，劃線培養(yǎng)3 次，鏡檢至純。菌株DNA的提取依據(jù)苯酚-氯仿-玻璃珠擊打的方法進(jìn)行[16]。提取好的DNA進(jìn)行g(shù)roEL基因（表1）擴(kuò)增[17]，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到500 bp左右的清晰單一條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物送至江蘇金唯智生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)（BLAST），比對(duì)相似值大于99%初步確定菌種物種。采用MEGA v7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.2B.longum亞種鑒定

對(duì)B.longum進(jìn)行4 種母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）代謝基因（表1）擴(kuò)增[18]，PCR條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性30 s，58 ℃（59 ℃）退火60 s，72 ℃延伸60 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后68 ℃終延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀拍照并記錄結(jié)果。

1.3.3 rep-PCR指紋圖譜分析

采用通用引物BOXAIR、m13和(GTG)5（表1）對(duì)菌株進(jìn)行重復(fù)性外源性回文聚合酶鏈反應(yīng)（repetitive exogenous palindrome polymerase chain reaction，rep-PCR）指紋圖譜分析[19-20]。PCR條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s（(GTG)5為50 ℃），72 ℃延伸4 min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀拍照并記錄結(jié)果。指紋圖譜使用GelCompar II v6.0軟件進(jìn)行聚類。

1.3.4 雙歧桿菌益生特性分析

1.3.4.1 耐酸、耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

參照Tang Wei等[21]的方法并作適當(dāng)改進(jìn)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定雙歧桿菌對(duì)酸和膽鹽的耐受性。分別配制普通MRS培養(yǎng)基和不同pH值（3.5和4.0）的MRS培養(yǎng)基，按照2%接種量將活化好的菌懸液分別接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中振蕩混勻，于厭氧工作站內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。分別在0 h和4 h測(cè)定接種于普通MRS培養(yǎng)基和不同pH值的MRS培養(yǎng)基中雙歧桿菌活菌數(shù)，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。以相同的方法分別配制普通MRS培養(yǎng)基和不同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.1%和0.2%）的MRS培養(yǎng)基，接菌后厭氧培養(yǎng)，分別在0 h和2.5 h測(cè)定活菌數(shù)，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果，按式（1）計(jì)算存活率：

式中：N1為不同pH值或膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理后平板上的活菌數(shù)/（CFU/mL）；N為對(duì)照樣品中的活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.4.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

將活化后的雙歧桿菌按2%的接種量接種于添加0.5%L-半胱氨酸的改良MRS液體培養(yǎng)基[22]中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后將菌株發(fā)酵液離心（12 000×g，10 min，4 ℃），通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾得到無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將指示菌株致瀉大腸埃希氏菌CICC 10411、出血性大腸埃希氏菌CICC 21530、鼠傷寒血清型腸沙門氏菌腸亞種CICC 10420、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌CICC 10421分別接種于L B 液體培養(yǎng)基，單核細(xì)胞性李斯特菌CGMCC 1.9136接種于PYG液體培養(yǎng)基，血清型腸炎沙門氏菌腸亞種CGMCC 1.10754接種于TSA液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，取1 mL指示菌懸液于無(wú)菌生理鹽水中梯度稀釋至濃度約為106～107CFU/mL。將稀釋液涂布于對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基，向牛津杯中加入200 μL發(fā)酵上清液，同時(shí)以不接菌的MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照。在4 ℃冰箱預(yù)擴(kuò)散6 h后，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.3.4.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行，吸取100 μL活化后濃度在107～108CFU/mL的雙歧桿菌菌懸液，使用無(wú)菌棉簽將其均勻涂布于MRS瓊脂平板表面，將藥片貼于其上，37 ℃倒置厭氧培養(yǎng)48 h，檢測(cè)抑菌圈直徑，每種抗生素做3 個(gè)平行。16 種常用抗生素藥敏紙片中抗生素的含量分別為：青霉素（10 μg/片）、氨芐西林（10 μg/片）、苯唑西林（1 μg/片）、頭孢噻啶（30 μg/片）、利福平（5 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、四環(huán)素（30 μg/片）、萬(wàn)古霉素（30 μg/片）、米洛環(huán)素（30 μg/片）、阿卡米星（30 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、鏈霉素（300 μg/片）、氨曲南（30 μg/片）、諾氟沙星（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、安西林（100 μg/片）。

1.3.4.4 體外抗氧化能力測(cè)定

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定：參照Kim等[23]的方法，將7 mmol/L ABTS工作液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀水溶液按照1∶1（V/V）混合均勻后避光放置12～16 h（室溫）。加入無(wú)水乙醇溶液調(diào)節(jié)ABTS工作液濃度，使得工作液在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度約為0.700±0.005。取待測(cè)樣品0.5 mL與調(diào)整好濃度的ABTS工作液3.0 mL混合均勻，室溫放置30 min后在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。空白組以等體積蒸餾水代替待測(cè)樣品，測(cè)其吸光度，計(jì)算方法如式（2）所示：

式中：A為樣品吸光度；Ac為空白組吸光度。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定：參照Z(yǔ)hao Li等[24]的方法并略作改進(jìn)，取0.1 mmol/L DPPH自由基溶液4.0 mL于試管中，加入待測(cè)樣品2.0 mL和50%乙醇溶液1.0 mL，混勻后暗處避光反應(yīng)60 min，12 000 r/min離心20 min，取上清液在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。空白組以等體積蒸餾水代替待測(cè)樣品，測(cè)其吸光度，計(jì)算公式同式（2）。

1.3.4.5 碳水化合物代謝實(shí)驗(yàn)

將活化后的雙歧桿菌按2%接種量接種于添加0.5%L-半胱氨酸鹽酸鹽的改良MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，無(wú)菌條件下離心（10 000×g，5 min，4 ℃）棄上清液，用無(wú)菌生理鹽水將菌體洗滌2 次后，重懸于1 mL生理鹽水中[25]。以2%的接種量將菌懸液接種到含有不同碳源（抗性淀粉、低聚木糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖、D-(＋)-海藻糖、大豆低聚糖、低聚半乳糖、菊粉、果膠、麥芽糊精、D-(＋)-綿子糖、水蘇糖、木糖醇、甘露醇、聚葡萄糖、殼寡糖、L-山梨醇）的改良MRS液體培養(yǎng)基中，以葡萄糖為陽(yáng)性對(duì)照，不添加碳源為陰性對(duì)照，測(cè)定0 h的OD600nm并記為OD1。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，測(cè)定OD600nm并記為OD2，最終OD600nm＝OD1－OD2。定義OD600nm＜0.15為不生長(zhǎng)，OD600nm＝0.15～0.35為有限生長(zhǎng)，OD600nm＞0.35為生長(zhǎng)良好。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Gel Compar II v6.0凝膠分析軟件進(jìn)行指紋圖譜聚類分析，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用MEGA v7.0軟件，熱圖的繪制采用TBtools軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌的分離與鑒定

經(jīng)groEL基因測(cè)序，19 份學(xué)齡兒童糞便樣本中共分離得到416 株雙歧桿菌，其中B.longum336 株、B.bifidum35 株、B.pseudocatenulatum14 株、B.catenulatum19 株、B.breve12 株。選取部分菌株groEL基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。雙歧桿菌分布在3 個(gè)大分支中，其中B.longum、B.bifidum和B.breve位于獨(dú)立的分支，B.pseudocatenulatum和B.catenulatum共同組成一個(gè)分支。

圖1 基于groEL基因序列雙歧桿菌代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of representative Bifidobacterium strains based on the groEL gene sequences

2.2 B.longum subsp.longum遺傳差異性分析

對(duì)B.longum進(jìn)行HMOs基因擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示均為B.longumsubsp.longum。根據(jù)rep-PCR指紋分型技術(shù)，從帶型相同的菌株中挑選2～4 個(gè)典型菌株，共得到27 株代表性菌株（表2），采用Gel Compar II軟件將3 種不同引物對(duì)應(yīng)的指紋圖譜進(jìn)行聚類。由BOXAIRPCR、m13-PCR和(GTG)5-PCR指紋聚類圖（圖2）可見，B.longumsubsp.longum的指紋圖譜帶型豐富，遺傳多樣性較高。

圖2 基于rep-PCR擴(kuò)增的27 株代表性B.longum subsp.longum的聚類圖Fig.2 Cluster map of 27 representative B.longum subsp.longum according to the genetic profiles obtained by rep-PCR

表2 篩選出的B.longum subsp.longum菌株及其宿主信息Table 2 Host information of selected strains of B.longum subsp.longum

2.3 益生特性分析

2.3.1 酸、膽鹽耐受性分析

如表3所示，厭氧培養(yǎng)4 h后，所有菌株在pH 4.0的MRS培養(yǎng)基中均能存活，且菌株2B33-3在pH 4.0的存活率達(dá)到170.83%；但菌株1B11-26、1B62-16、1B62-15和2B130-4在pH 3.5的MRS培養(yǎng)基中存活率低于0.0001%。總體而言，27 株B.longumsubsp.longum代表菌株均具有較強(qiáng)的耐酸能力，其中菌株2B3-21、2B13-5、2B33-3和1B68-16的耐受性最強(qiáng)。

表3 27 株B.longum subsp.longum代表菌株耐酸耐膽鹽存活率Table 3 Acid and bile tolerance of 27 representative strains of B.longum subsp.longum

厭氧培養(yǎng)2.5 h后，實(shí)驗(yàn)中所有B.longumsubsp.longum均能夠在添加0.1%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中存活，菌株1B23-11的存活率最高，為81.81%，菌株2B13-5的存活率最低，為5.31%。當(dāng)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)，菌株2B6-28的存活率低于0.0001%，菌株2B13-28的存活率最高，為64.05%。相對(duì)而言，菌株1B23-11、1B68-16、2B13-28和2B33-3的耐膽鹽能力最優(yōu)。

2.3.2 抑菌活性分析

采用牛津杯法檢測(cè)27 株B.longumsubsp.longum代表菌株對(duì)常見致腹瀉病原菌的抑菌活性，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)菌株中有22 株B.longumsubsp.longum發(fā)酵上清液具有較好的抑菌性能，均可以抑制致瀉大腸埃希氏菌CICC 10411、出血性大腸埃希氏菌CICC 21530、鼠傷寒血清型腸沙門氏菌腸亞種CICC 10420、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌CICC 10421、單核細(xì)胞性李斯特菌CGMCC 1.9136、血清型腸炎沙門氏菌腸亞種CGMCC 1.10754，其中菌株1B68-16、2B13-5、2B33-3和1B39-2的抑菌能力較強(qiáng)。

表4 27 株B.longum subsp.longum代表菌株抑菌活性分析Table 4 Bacteriostatic activities of 27 representative strains of B.longum subsp.longum

2.3.3 耐藥性分析

根據(jù)紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)27 株B.longumsubsp.longum代表菌株進(jìn)行16 種抗生素抗性分析，從圖3可知，所有菌株對(duì)氨芐西林、利福平、米諾環(huán)素敏感，對(duì)安西林、卡那霉素、諾氟沙星、氨曲南、左氧氟沙星表現(xiàn)中敏或耐藥。14 株對(duì)頭孢噻肟敏感，20 株對(duì)青霉素敏感，21 株對(duì)四環(huán)素敏感，14 株對(duì)慶大霉素敏感，24 株對(duì)鏈霉素敏感，7 株對(duì)萬(wàn)古霉素敏感。除菌株1B62-16對(duì)阿卡米星敏感，菌株1B23-11、2B130-3和1B5-4對(duì)苯唑西林敏感，其余菌株對(duì)以上兩種抗生素均表現(xiàn)中敏或耐藥。總體而言，菌株2B13-28、2B6-28、2B102-10對(duì)大多數(shù)抗生素耐藥。

圖3 27 株B.longum subsp.longum代表菌株抗生素耐藥性分析Fig.3 Antibiotic resistance of 27 representative strains of B.longum subsp.longum

2.3.4 體外抗氧化能力分析

2.3.4.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

由圖4a可知，待測(cè)B.longumsubsp.longum無(wú)細(xì)胞提取物組對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率最高，13 株菌株的清除率高于80%，其中菌株2B25-16清除率最高，達(dá)到89.49%；菌株2B3-21清除率最低，為24.21%。發(fā)酵上清液組的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率略低于無(wú)細(xì)胞提取物組，其中菌株2B3-21的清除率最高，為84.4%；菌株1B63-15的清除率最低，為23.29%。而菌體細(xì)胞組對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除水平最低，其中菌株2B33-3的清除率最高，為74.95%；菌株1B23-1清除率最低，為39.26%。綜上，待測(cè)菌株對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除作用的代謝物可能主要存在于無(wú)細(xì)胞提取物中，菌株2B13-28、2B6-28、2B33-3和1B68-16對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基總體清除效果較好。

2.3.4.2 DPPH自由基清除能力

由圖4b可知，待測(cè)B.longumsubsp.longum發(fā)酵上清液組對(duì)DPPH自由基清除率最高，除菌株1B63-15和2B3-6外，其余菌株的清除率均高于50%，其中菌株1B38-1清除率最高，達(dá)到91.81%。待測(cè)菌株無(wú)細(xì)胞提取物組的DPPH自由基清除率介于30%～80%之間，其中菌株2B13-28的清除率最高，為76.69%；菌株1B11-26的清除率最低，為30.79%。菌體細(xì)胞組對(duì)DPPH自由基清除水平體現(xiàn)了較大的菌株差異性，其中菌株1B38-1的清除率最高，為77.6%，其次是菌株1B68-16，其余菌株的清除率均低于70%。菌株1B13-11的清除率最低，為20.9%。綜上，待測(cè)菌株對(duì)DPPH自由基清除作用的代謝物可能主要存在于發(fā)酵上清液中，菌株1B38-1、2B33-3、1B68-16和2B13-28對(duì)DPPH自由基總體清除效果較好。

2.3.5 碳水化合物代謝分析

B.longumsubsp.longum能利用多種宿主與飲食來(lái)源的聚糖是其在不同年齡段人群腸道內(nèi)均能定植的主要因素之一。本研究選取18 種植物源聚糖對(duì)27 株B.longumsubsp.longum進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，碳源代謝結(jié)果使用TBtools軟件繪制熱圖并聚類（圖5）。受試菌株中，15 株能有效利用低聚果糖，16 株能有效利用低聚異麥芽糖，17 株能有效利用大豆低聚糖，8 株能很好地利用菊粉，10 株能有效利用蘋果果膠，17 株能有效利用棉子糖，18 株有效利用麥芽糊精，17 株有效利用水蘇糖，9 株有效利用聚葡萄糖，10 株有效利用殼寡糖。除菌株1B3-21外，其余菌株都不能有效利用木糖醇。相反，除菌株1B11-26外，其余26 株菌株都能很好地利用低聚半乳糖。菌株1B38-1和2B130-3能有效利用抗性淀粉，菌株1B5-4、1B39-2、1B63-15和2B102-10能有效利用低聚木糖，菌株1B38-1、2B130-3、2B130-4、1B13-11和1B3-21能有效利用D-海藻糖，菌株2B102-3、1B23-11、1B13-11、2B6-28和2B17-16能很好地利用甘露糖醇和L-山梨糖。

圖5 27 株代表性B.longum subsp.longum碳水化合物代謝譜的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of carbohydrate utilization profiles of 27 representative strains of B.longum subsp.longum

3 討論與結(jié)論

針對(duì)新疆少數(shù)民族腸道雙歧桿菌的研究前期主要集中在母嬰群體的差異性方面，課題組從新疆維吾爾族嬰幼兒糞便中分離得到雙歧桿菌B.longumsubsp.infantis、B.longumsubsp.suis、B.bifidum、B.pseudocatenulatum、B.adolescentis[26]；從另一組維吾爾族母嬰腸道中分離到雙歧桿菌B.longumsubsp.longum、B.pseudolongum、B.breve、B.animalsubsp.lactis[27-28]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大部分母乳喂養(yǎng)、順產(chǎn)的嬰幼兒以嬰兒型雙歧桿菌為主，在成人化的學(xué)齡兒童中B.longumsubsp.longum是最常見的種，在一部分兒童中有報(bào)道以B.breve為優(yōu)勢(shì)種[2]；除此之外，學(xué)齡兒童成人型雙歧桿菌的頻繁分離，顯示“嬰兒型雙歧桿菌”與“成人型雙歧桿菌”只有相對(duì)豐度差異，沒有明確的年齡界限[29]，很可能雙歧桿菌菌群結(jié)構(gòu)的演變需要更長(zhǎng)的時(shí)間。同時(shí)，本研究基于BOXAIR、m13和(GTG)53 種rep-PCR指紋分型技術(shù)的遺傳差異研究顯示，所有B.longumsubsp.longum菌株分型聚類共獲得27 種基因型，顯示了高度的遺傳多樣性。不僅揭示了不同個(gè)體腸道內(nèi)B.longumsubsp.longum菌株遺傳差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)來(lái)自同一個(gè)體有多個(gè)菌株基因型現(xiàn)象存在，例如來(lái)自同一個(gè)體的菌株2B3-6和2B3-21，這表明人類個(gè)體在有限的時(shí)間內(nèi)雙歧桿菌同種腸道細(xì)菌群體遺傳結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)進(jìn)化的動(dòng)態(tài)變化特征和遺傳多態(tài)性，這和擬桿菌等其他細(xì)菌的報(bào)道[6-7,30]相一致，但仍需要開展更深入、全面的研究。這對(duì)于揭示以雙歧桿菌為代表的益生菌理論的認(rèn)識(shí)和拓展目前僅認(rèn)為益生特性是菌株特異性的有限認(rèn)知很有必要[9,31-33]。

B.longumsubsp.longum在人體胃腸道定植過(guò)程中會(huì)受到酸、膽鹽、各種消化酶、宿主免疫以及腸道內(nèi)其他微生物和抗生素的影響[34-35]。然而，B.longumsubsp.longum通過(guò)對(duì)宿主源以及植物源多糖的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)成功定植于不同年齡段人群胃腸道中，并保持極高的豐度[8]。Wei Yanxia等[34]對(duì)B.longum進(jìn)行pH 3.5耐受性測(cè)試，結(jié)果顯示存活率在30%～60%。本研究受試菌株的耐酸耐膽鹽能力較強(qiáng)，個(gè)別菌株在低pH值和較高膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)液中的存活率可分別達(dá)到170.83%、81.81%。趙志霞等[28]從母乳中分離得到的所有雙歧桿菌都對(duì)產(chǎn)腸毒大腸埃希氏菌有較強(qiáng)的抑菌能力，50%的菌株對(duì)出血性大腸埃希氏菌抑菌能力較強(qiáng)。本研究抑菌活性分析結(jié)果表明，所有受試菌株都對(duì)出血性大腸埃希氏菌和鼠傷寒血清型腸沙門氏菌表現(xiàn)出抑菌活性。有研究表明，B.longumsubsp.longum對(duì)氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素表現(xiàn)出耐藥[24]。此外，本研究耐藥分析結(jié)果表明受試菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素表現(xiàn)敏感。體外抗氧化能力分析結(jié)果表明，菌株的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最強(qiáng)，發(fā)酵上清液對(duì)DPPH自由基清除率最高，與其他研究結(jié)果[24]一致。B.longumsubsp.longum除了可以有效利用HMOs外，還能代謝多種植物源寡糖和聚糖，例如半纖維素和果膠[3,36-38]。本實(shí)驗(yàn)中除菌株1B62-15外，受試菌株都能有效利用多種植物源聚糖。

本研究對(duì)哈薩克族學(xué)齡兒童腸道雙歧桿菌進(jìn)行分離鑒定，通過(guò)基因型和表型相結(jié)合的方法對(duì)B.longumsubsp.longum代表性菌株進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，菌株1B68-16和2B33-3可作為潛在益生菌菌株進(jìn)行后期體內(nèi)益生特性研究。