噬菌體Pu29特性分析及其在沙門氏菌磁分離富集中的應用

丁一峰，張 宇，劉 茜，黃晨曦，邵彥春，王小紅

（華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

沙門氏菌（Salmonella）是一種定植于人類和動物腸道的病原體，是導致人類食物中毒、傷寒、急性胃腸炎和敗血癥的主要病原體之一[1]，對其進行快速檢測可有效控制沙門氏菌的感染和爆發。在日常生活中引起沙門氏菌感染的食物主要包括受污染的肉品、水果、牛奶和雞蛋等[2]。由于沙門氏菌在食品樣品中的豐度通常比較低且分布不均勻，因而需要通過對樣品中的沙門氏菌進行預富集，例如預增菌培養等，提高檢測的靈敏度和檢出限[3-4]。但預增菌耗費時間長，無法滿足快速檢測的要求[5]，因此，亟待研究開發新型快速樣品前處理方法，提高檢測效率。

磁性納米顆粒因其具有獨特的磁性引起了許多領域的關注與研究，如生物醫學、藥物輸送和診斷學[6]。免疫磁性分離是一種有效的分離技術，它將標記有目標分析物特異性抗體的磁珠與樣品進行孵育；在樣品管附近的磁鐵吸引與分析物結合的磁珠，隨后移除剩余的液體[7]。抗體標記的磁性納米顆粒已被證明能有效地從牛肉、牛奶和水樣品中分離出大腸桿菌O157:H7[8]，以及從雞、魚、牛奶和奶酪樣品中分離出單核細胞性李斯特菌[9]。然而，這一方法在捕獲效率和成本方面還有待改進[5]。其中，作為識別元件的高親和力抗體有著昂貴、難以獲得、不能區分活細胞和死細胞等缺陷，從而限制了免疫標記磁珠使用范圍[10-11]。因此，有待進一步發掘新型的識別元件，用于食源性病原菌的特異性識別。

噬菌體是能特異性感染宿主細菌的病毒，結構簡單，由蛋白質外殼和遺傳物質核酸組成[12]。它們廣泛分布于土壤、地面、水質和食物中，能夠高特異性識別宿主菌，與抗體相比，噬菌體對惡劣環境的耐受性強，還可以區分死細菌和活細菌[13]。由于噬菌體高度特異性的識別能力以及只能結合活細菌宿主，可將其用作快速細菌篩選中的檢測探針。He Yong等[14]將噬菌體PAP1與功能化磁珠偶聯制備生物探針，結合生物發光法在2 h內實現銅綠假單胞菌的快速檢測，檢測限達到2.0×102CFU/mL。Yan Chenghui等[15]利用金黃色葡萄球菌噬菌體與磁珠偶聯形成的生物探針，結合辣根過氧化物酶標記的抗體識別金黃色葡萄球菌，在90 min內實現對食品樣品中金黃色葡萄球菌的快速檢測，檢測限為2.47×103CFU/mL。但是噬菌體在食源性病原菌檢測方面的研究仍顯不足，有待進一步擴展噬菌體的應用范圍。

本研究以篩選得到的1 株雞白痢沙門氏菌噬菌體Pu29（NCBI GenBank登錄號為OQ267695）為研究對象，全面分析其生物學及基因組特性，并將其作為特異性識別沙門氏菌的識別元件，利用酰胺反應與羧基化的磁珠偶聯形成噬菌體-磁珠探針PhagePu29-MBs，同時優化實驗條件，建立一種快速、準確的噬菌體磁分離技術，用于樣品中沙門氏菌的快速分離富集，旨在為快速分離富集食品樣品中的致病微生物提供新方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞白痢沙門氏菌C519以及其他測定噬菌體宿主譜的細菌菌株均為實驗室保存菌種。本實驗所用污水樣品于2018年采集自湖北武漢市家庭小區周邊的某下水道。

LB培養基、LB瓊脂（LA）培養基、瓊脂 青島高科園海博生物技術有限公司；0.22 μm微孔濾膜 美國Millipore公司；雙層瓊脂培養基平板：下層培養基為LA培養基、上層培養基為含0.7%瓊脂粉的LB半固體培養基。

1.2 儀器與設備

Allegra X-30R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；5417R小型臺式冷凍離心機 德國艾本德公司；M200 PRO酶標儀 瑞士Tecan公司；7000FA100 kV透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）日本日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體分離與純化

參照聶若男等[16]的方法，采用雙層平板法對單一噬菌斑反復純化4～6 次直至噬菌斑大小基本一致，即得到純化的雞白痢沙門氏菌噬菌體。

1.3.2 噬菌體特性分析[17-18]

1.3.2.1 噬菌體宿主譜

采用點樣法測定雞白痢沙門氏菌噬菌體Pu29的宿主范圍。取100 μL培養至對數期的測試菌株加入到溫熱半固體培養基中，混勻后倒入預先準備的LA平板上，待其凝固后，取5 μL效價109PFU/mL噬菌體Pu29滴加至上層平板表面，自然晾干后置于37 ℃培養箱培養5～8 h，觀察其裂解菌株情況。

1.3.2.2 噬菌體形態觀察

使用磷鎢酸負染法，取20 μL噬菌體液和2%磷鎢酸（pH 7）分別滴于封口膜上，輕取銅網置于噬菌體液中，浸泡10 min之后用濾紙吸去多余液體，再將銅網置于磷鎢酸染料中染色10 min后，用濾紙從銅網邊緣緩慢吸去多余液體，自然晾干至完全干燥，制備好的銅網在TEM下觀察噬菌體形態，并用軟件Digital Micrograph Demo 3.9.1測量其大小。

1.3.2.3 生物學特性

采用雙層平板法測定噬菌體Pu29的最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI）、吸附速率、一步生長曲線。各實驗重復3 次，每次設2 個平行。吸附速率及裂解量分別按式（1）、（2）計算：

1.3.2.4 噬菌體穩定性評估

將109PFU/mL噬菌體置于恒溫水浴鍋中，分別于30～90 ℃保溫0、30 min和60 min，采用雙層平板法測定噬菌體的效價。每個溫度設3 個重復，每次設2 個平行。

取109PFU/mL噬菌體懸液分別加入到不同pH值（2～13）的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，放于37 ℃恒溫水浴鍋中2 h。采用雙層平板法測定噬菌體效價。實驗重復3 次，每次設2 個平行。

1.3.2.5 噬菌體基因組測序及分析

取1 mL高效價的噬菌體樣品（1010PFU/mL），參考Czajkowski等[19]的氯化鋅沉淀法提取DNA，利用超微量分光光度計定量濃度。采用Illumina MiSeq測序平臺進行噬菌體全基因組測序。應用軟件SPAdes v3.9.0對原始測序數據進行從頭拼裝，構建scaffold和conting。使用GeneMarkS（http://exon.gatech.edu/GeneMark/）和RAST（https://rast.nmpdr.org/rast.cgi）網站對全基因組序列進行基因預測。使用在線BLASTp工具進行蛋白編碼基因的功能注釋。將基因組上傳至NCBI獲得序列號。基因組圖用軟件BRIG（0.95）生成。分別在毒力因子數據庫（The Virulence Factor Database，VFDB）（http://www.mgc.ac.cn/VFs/）和耐藥基因數據庫（Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB）（https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi）中查找可能的毒力基因和耐藥基因。依據國際病毒分類委員會（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的病毒分類和NCBI數據庫的BLASTn（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），選擇末端酶大亞基相似度較高的噬菌體。利用MEGA 7.0軟件分別建立基于末端酶大亞基的進化樹，分析噬菌體Pu29的親緣關系。

1.3.3 噬菌體-磁珠PhagePu29-MBs的制備及富集沙門氏菌分離

1.3.3.1 PhagePu29-MBs的制備

取10 mg/mL經超聲分散充分混勻的羧基化磁珠（MBs），利用磁性分離架進行磁分離，待固液分離后去除上清液，保留MBs。加入嗎啉乙磺酸溶液（50 mmol/L，pH 5.0）清洗磁珠。隨后，迅速加入N-羥基琥珀酰亞胺溶液（終質量濃度為10 mg/mL）和碳化二亞胺溶液（終質量濃度為10 mg/mL），混勻，37 ℃活化30 min?；罨Y束后用PBS清洗磁珠3 次。加入噬菌體Pu29（109PFU/mL）到磁珠中，在37 ℃振蕩混勻30 min。使用PBS清洗3 次以去除未偶聯的噬菌體。用含0.5 g/100 mL BSA的PBS封閉剩余結合位點，于37 ℃振蕩混勻30 min，得到PhagePu29-MBs。該探針保存于含0.25 g/100 mL BSA的PBS（pH 7.4）中，4 ℃存放待用。

1.3.3.2 PhagePu29-MBs分離富集沙門氏菌的條件優化

將100 μL的106CFU/mL沙門氏菌與制備的PhagePu29-MBs在37 ℃孵育20 min。使用磁性分離器分離細菌磁性復合物，用PBS洗滌3 次。然后，通過平板計數法確定上清液中細菌細胞的數量（Na/（CFU/mL））。為了確定未用噬菌體PhagePu29-MBs（N0/（CFU/mL））處理的沙門氏菌細胞總數，將細菌樣品直接涂布在LA板上。使用式（3）計算PhagePu29-MBs的捕獲效率：

為了進一步提高PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的效率，對噬菌體磁分離的應用參數進行改進。

參照1.3.3.1節的方法，選取粒徑為200 nm的磁珠作為對象，將其與噬菌體偶聯，分別在4 ℃過夜，37 ℃偶聯0.5、2、4、6 h。采用點樣法測定PhagePu29-MBs上偶聯的噬菌體效價。選取噬菌體效價高的制備條件作為最優條件制備PhagePu29-MBs。

依據上述探針分離富集沙門氏菌的步驟，分別優化下述條件：1）分別將不同量的PhagePu29-MBs（10～200 μg）與沙門氏菌混合；2）PhagePu29-MBs與沙門氏菌混合液在37 ℃振蕩分別孵育5～30 min；3）PhagePu29-MBs與沙門氏菌混合液分別在4、25、37 ℃振蕩孵育20 min。測定PhagePu29-MBs對沙門氏菌的捕獲效率，以最高捕獲效率對應的參數作為最佳探針使用量、最佳捕獲時間和最佳孵育溫度。

1.3.4 PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的能力評估

1.3.4.1 PhagePu29-MBs的靈敏度

參考1.3.3節步驟，PhagePu29-MBs與不同濃度的雞白痢沙門氏菌C519（100～108CFU/mL）混合，測定PhagePu29-MBs對不同濃度沙門氏菌的捕獲效率。

1.3.4.2 PhagePu29-MBs的特異性

依據1.3.3節步驟，PhagePu29-MBs分別與106CFU/mL不同種屬細菌（雞白痢沙門氏菌C519、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、腸炎沙門氏菌ATCC 13076、豬霍亂沙門氏菌ATCC 10708、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21、單核細胞性李斯特菌ATCC 19114、單核細胞性李斯特菌ATCC 19115、副溶血性弧菌ATCC 33846、副溶血性弧菌ATCC 17802）混合，測定PhagePu29-MBs對不同種屬細菌的捕獲效率。

1.3.4.3 PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的透射電鏡觀察

按照1.3.3.2節步驟，獲得PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的復合物，加入2.5%戊二醛固定液。采用負染法，銅網碳面扣在樣品上，吸附樣品5 min。用濾紙垂直吸掉多余液體直至看不到殘留液體。將銅網碳面扣在磷鎢酸液滴上染色20～30 s，用濾紙吸干，放在濾紙上，在陰涼處自然干燥，隨即進行TEM觀察。同時采用TEM觀察200 nm的羧基磁珠。

1.3.5 PhagePu29-MBs在加標樣品中富集沙門氏菌的應用

LB培養基采用高壓蒸汽滅菌法滅菌（121 ℃，20 min），5%和15%的全脂牛奶（市售）或脫脂牛奶，通過巴氏殺菌法滅菌。分別將103CFU/mL和106CFU/mL沙門氏菌C519加入到上述樣品中，按照1.3.4節的步驟，測定PhagePu29-MBs對樣品中沙門氏菌的捕獲效率。

1.4 數據統計及圖表繪制

使用平均值和標準差表示數據，并使用Student’st-test確定差異顯著性（P＜0.05，差異顯著），運用GraphPad軟件進行繪圖與分析。

2 結果與分析

2.1 噬菌體Pu29分離純化及形態觀察

如圖1A所示，經過5 次純化后，噬菌體Pu29的噬菌斑形態大小一致，直徑約為3.5～4.2 mm，效價可以達到3.4×109PFU/mL。經過超速離心沉淀噬菌體顆粒后，通過TEM觀察噬菌體形態，如圖1B所示，噬菌體Pu29有一個二十面體的頭部，尾部較長且彎曲，不可收縮。用軟件Digital Micrograph Demo 3.9.1測量其大小可知，Pu29頭部直徑為（68.63±1.68）nm，尾部長度為（179.91±3.50）nm，尾部直徑為（9.23±0.21）nm。根據噬菌體的形態學分類標準，Pu29屬于長尾噬菌體。

圖1 噬菌體Pu29分離純化及形態觀察Fig.1 Plaques and morphological observation of phage Pu29

2.2 噬菌體Pu29宿主譜

如表1所示，噬菌體Pu29可以裂解30 株沙門氏菌（30/36＝83.33%），且出現較清晰透明的噬菌斑，特別是對兩株雞白痢沙門氏菌的裂解效果最佳。噬菌體Pu29還可以裂解5 株大腸桿菌（5/10＝50.00%），對單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌無裂解效果。結果表明噬菌體Pu29是1 株寬譜的烈性噬菌體。

表1 噬菌體Pu29宿主譜Table 1 Host spectrum of phage Pu29

2.3 噬菌體生物學特性

如圖2A所示，當噬菌體Pu29的MOI為0.001時，噬菌體效價最高，達到9.33×108PFU/mL，而當MOI為10時，噬菌體吸附、侵染效果最差，效價為9.00×107PFU/mL。結果表明當噬菌體效價與宿主菌菌量以MOI為0.001侵染時，噬菌體宿主菌內能夠增殖更多的子代噬菌體并裂解釋放。后續實驗均采用最佳MOI培養噬菌體。圖2B為噬菌體Pu29對宿主菌C519的吸附速率，噬菌體Pu29的吸附速率在0～15 min呈上升趨勢，15 min時達到峰值，最佳吸附速率可達88.67%，表明噬菌體Pu29在15 min能夠最大量地吸附在宿主細菌上。在15 min后，吸附速率逐步下降，直到33 min后完成吸附過程。如圖2C所示，噬菌體Pu29的潛伏期為30 min，裂解期為180 min，裂解量大約為115.74 PFU/cell。

圖2 噬菌體Pu29生物學特性分析Fig.2 Biological characteristic analysis of phage Pu29

2.4 噬菌體穩定性

噬菌體Pu29的原始效價為3.65×109PFU/mL，其熱穩定性結果如圖3A所示，噬菌體Pu29溫度耐受力較強，在30～50 ℃溫度范圍內，Pu29與原始效價幾乎一致，在60 ℃的環境下孵育1 h之后，其效價下降到3.25×108PFU/mL。在70～90 ℃之間，隨著溫度的升高，噬菌體的效價急劇降低。

圖3 噬菌體Pu29穩定性Fig.3 Stability of phage Pu29

如圖3B所示，當pH值為4～11時，對噬菌體Pu29的活性幾乎無影響，并且在此范圍內其效價波動較小。而處于pH 3或12的環境下對Pu29進行2 h孵育后，其效價明顯降低。當Pu29經過pH值為2或13的條件處理后，其活性完全喪失。

2.5 噬菌體基因組分析

噬菌體Pu29的基因組長度為45 715 bp，堿基分布情況為A 12 145 個（26.57%）、T 12 506 個（27.36%）、C 10 614 個（23.22%）、G 10 450 個（22.86%），GC平均含量為21 064 個（46.08%）。將噬菌體Pu29全基因組核酸序列提交GenBank，獲取的登錄號為OQ267695。如圖4A所示，使用3 種預測蛋白功能工具（RAST、GeneMarkS和ORF Finder），預測出81 個編碼功能蛋白的基因，其中18 個蛋白通過NCBI的在線工具被注釋為已知功能，其余為假定功能蛋白。按照功能的不同類型，將其分為4大類：DNA包裝與核酸代謝（8 個）、除噬菌體尾部外的結構蛋白（4 個）、有關裂解的蛋白（1 個）、尾部相關的蛋白（3 個）。在功能注釋的過程中沒有發現有關溶原性的基因，如整合酶等。通過VFDB和ARDB在線數據庫對噬菌體Pu29的全基因組序列進行預測，并沒有預測出可能的毒力因子以及抗生素抗性基因。

圖4 噬菌體Pu29功能基因組學分析Fig.4 Functional genomic analysis of phage Pu29

使用BLASTn在NCBI數據庫進行比對，篩選出18 株與噬菌體Pu29基因序列相似度高的噬菌體。以這18 株噬菌體和噬菌體Pu29的末端酶大亞基蛋白序列，構建系統發育樹，如圖4B所示，Pu29的這兩個基因都與Vibriophage pYD38-A和Aeromonasphage pIS4-A形成一簇。因此，根據上述結果以及ICTV公布的病毒分類，表明Pu29屬于輪狀病毒屬（Roufvirus）的一個新物種。

2.6 PhagePu29-MBs條件優化

如圖5A 所示，噬菌體Pu 29 原液的效價為3.4×109PFU/mL，噬菌體Pu29-200 nm磁珠偶聯物在4 ℃過夜，PhagePu29-MBs的效價為1.5×107PFU/mL?？瞻捉M（MBs）沒有出現任何透亮的噬菌斑現象。因此噬菌體Pu29與200 nm粒徑的羧基磁珠在4 ℃過夜偶聯的效果最佳。

圖5 基于噬菌體Pu29磁分離富集沙門氏菌條件優化Fig.5 Optimization of magnetic separation and enrichment of Salmonella based on phage Pu29

如圖5B所示，10 μg PhagePu29-MBs對宿主菌液的捕獲效率最低，當增加用量至25 μg時，捕獲效率最高，達到76.12%。但繼續增加探針的用量時，其捕獲效率有所降低，并且保持較穩定的富集效果。因此25 μg探針對宿主細胞的富集作用能夠達到最佳效率，后續研究將選取25 μg PhagePu29-MBs富集細菌。

如圖5C所示，當孵育5 min時，PhagePu29-MBs對宿主菌液的捕獲效率為62.61%，孵育時間從5 min逐漸延長至20 min時，PhagePu29-MBs富集宿主菌液的效率在不斷上升，孵育20 min時，捕獲效率最高，達到76.09%。但繼續延長孵育時間至30 min時，PhagePu29-MBs的捕獲效率又有所下降。因此選用20 min的孵育時間對細菌進行富集。

如圖5D 所示，在4 ℃環境下孵育20 min 后的PhagePu29-MBs捕獲效率較差，僅為53.96%，當環境溫度上升時，探針對宿主菌的捕獲量也隨之增加，在37 ℃恒溫條件下其能夠達到最佳富集效率，捕獲效率達到74.15%。經過以上條件的優化，選擇使用25 μg PhagePu29-MBs在37 ℃與宿主菌C519孵育振蕩20 min進行富集實驗。

2.7 PhagePu29-MBs分離富集沙門氏菌的能力

2.7.1 PhagePu29-MBs分離富集不同濃度的沙門氏菌

如圖6A所示，當菌液濃度為4.5×109CFU/mL時，捕獲效率為67.41%，依次加入梯度稀釋至4.5×103CFU/mL菌液的過程中，隨著菌液濃度梯度的降低，PhagePu29-MBs捕獲效率不斷增長，當加入4.5×103CFU/mL菌液時，其捕獲效率最高，可達83.93%。在PhagePu29-MBs中加入4.5×102CFU/mL的宿主菌液時，捕獲效率為57.78%。在加入最低菌量45 CFU/mL的條件下，PhagePu29-MBs仍能捕獲25 CFU/mL的宿主細菌，因此噬菌體Pu29與200 nm羧基磁珠偶聯物對不同濃度宿主菌C519有良好的前處理分離富集效果。

2.7.2 PhagePu29-MBs的特異性

探究噬菌體Pu29與磁珠偶聯之后對不同種屬細菌富集的特異性，結果如圖6B所示，PhagePu29-MBs對宿主細菌雞白痢沙門氏菌C519、鼠傷寒沙門氏菌14028、腸炎沙門氏菌13076、豬霍亂沙門氏菌10708、大腸桿菌NCTC 12900和大腸桿菌T10的捕獲效率較好，其中對雞白痢沙門氏菌C519的捕獲效率最高，可達75.76%，對豬霍亂沙門氏菌10708的捕獲效率較差，為58.20%。另外，相對于沙門氏菌屬不同血清型的菌株，對大腸桿菌、單核細胞性李斯特菌及副溶血性弧菌的富集效果較差，其中對單核細胞性李斯特菌19114的捕獲效率最低，為24.04%。證明噬菌體Pu29與磁珠的結合物能對不同血清型的沙門氏菌以及大腸桿菌進行富集且捕獲效率較理想。而對其他菌株的捕獲效率均小于36%，說明PhagePu29-MBs具有良好的特異性。

2.7.3 PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌的TEM

通過TEM對200 nm（10 mg/mL）羧基磁珠進行觀察，結果如圖7A所示，在2 μm視野下觀察到大量微球顆粒聚集。PhagePu29-MBs分離富集宿主菌C519，對復合物進行TEM觀察，結果如圖7B所示，視野中觀察到PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌（紅色箭頭）。因此，PhagePu29-MBs能夠對沙門氏菌進行分離富集。

圖7 TEM觀察PhagePu29-MBs捕獲沙門氏菌Fig.7 TEM observation of PhagePu29-MBs-captured Salmonella

2.8 PhagePu29-MBs對樣品中沙門氏菌的分離富集

如圖8所示，PhagePu29-MBs對脫脂牛奶的整體富集效果最佳，當在5%脫脂牛奶中加入3.77×103CFU/mL菌液時，捕獲效率達到最大值，為92.92%。在LB中富集宿主菌的效率較低，當對3.77×103CFU/mL的菌液進行富集后，捕獲效率為75.90%，對3.77×106CFU/mL菌液的捕獲效率相比之下有所下降，為63.98%。然而在全脂奶粉配制成的5%及15%牛奶中，PhagePu29-MBs對宿主菌C519的富集效率明顯降低，在15%全脂牛奶中加入3.77×106CFU/mL的菌液后，經過37 ℃振蕩20 min的富集，PhagePu29-MBs的捕獲效率最低，僅達到51.69%。

圖8 PhagePu29-MBs在不同基質樣品中對雞白痢沙門氏菌的分離富集Fig.8 Isolation and enrichment of PhagePu29-MBs for Salmonella in different sample matrices

3 討論

沙門氏菌病是由沙門氏菌引起的第二大食源性疾病，對公眾健康構成巨大威脅，并給許多國家造成經濟負擔，尤其是食品行業[20-21]。沙門氏菌可以在各種食物中檢測到，如雞蛋、蛋制品、肉類、奶酪、新鮮水果和蔬菜[2,22]。因此，在整個食品供應鏈中快速準確地監測和檢測沙門氏菌對于早期預防食源性疾病爆發至關重要[23]。在食品樣品中沙門氏菌通常規定為不得檢出[24]，但是沙門氏菌在實際樣品中的豐度通常比較低且分布不均勻，這對于檢測技術提出了更高的要求[4,21]。噬菌體作為一種新型的識別元件，在食源性病原菌的預富集以及檢測方面有著廣闊的應用前景[25-27]。例如Zhang Yun等[28]將噬菌體O157-IOV-4與功能化磁珠偶聯制備生物探針，結合比色法在2 h內實現大腸桿菌O157:H7的快速檢測，檢測限達到4.9×104CFU/mL。

噬菌體作為是一類專門吸附細菌的生物，具有特異性識別宿主細菌的特點[29]。利用這一特點已經開發了一些方法用于細菌的特異性檢測，這些方法主要是基于噬菌體尾部中的受體結合蛋白（尾纖蛋白或尾刺蛋白），或者由相關裂解酶的識別區等介導[30]。噬菌體的宿主范圍可以很寬也可以很窄，因此有可能識別出整個屬或物種[13,31]。此外，在溫度、pH值和離子強度等因素方面，噬菌體比抗體表現出更大的穩定性。噬菌體的低成本、大容量制備和高靶向特異性特點使其有望在病原體控制和檢測中應用開發[32]。本研究采用的沙門氏菌噬菌體Pu29能夠在15 min就能實現對沙門氏菌的最大吸附，為88.67%。將其與羧基化的納米磁珠偶聯，得到PhagePu29-MBs，其捕獲效率最高為83.93%，最低捕獲菌量為45 CFU/mL，該方法分離富集沙門氏菌的時間大約為30 min，展現出其特異性捕獲沙門氏菌的特點。噬菌體Pu29的潛伏期為30 min，而PhagePu29-MBs在20 min內即可完成對樣品中沙門氏菌的分離富集，能夠較大程度分離富集沙門氏菌。但長時間的孵育，噬菌體的裂解活性會導致細菌裂解。在后續的研究中，可利用噬菌體受體結合蛋白作為檢測食源性病原菌的識別元件，避免操作過程中時間過長噬菌體導致細菌發生裂解作用。

在加入一定菌量宿主菌的5%和15%脫脂牛奶中，PhagePu29-MBs能夠高效地富集到大量宿主菌C519，捕獲效率達到92.92%左右。而因為全脂牛奶有更多的脂肪和脂溶性維生素等物質，比脫脂牛奶的成分更加復雜，故在5%和15%的全脂牛奶中，PhagePu29-MBs對宿主菌的捕獲效率大大降低，為53.86%左右。黃震等[33]將抗體與磁珠偶聯制備免疫磁分離探針，構建的免疫磁性分離方法能夠在35 min內完成牛奶中大腸桿菌O157:H7的高效富集，捕獲效率在50%～93%之間。Zhou Yan等[34]將噬菌體P100與磁性微粒偶聯制備生物探針，該探針在20 min內即可實現單核細胞性李斯特菌的分離富集，捕獲效率為40%左右。因此，本研究基于噬菌體Pu29建立的快速分離富集沙門氏菌方法具有潛在的應用價值。

4 結論

本研究分離純化得到1 株輪狀病毒屬（Roufvirus）的沙門氏菌噬菌體Pu29，其具有二十面體的頭部和不可收縮、彎曲的長尾部。該噬菌體的生物學特性和基因組分析表明，其具有吸附時間短、溫度和pH值耐受性良好、能夠特異性識別沙門氏菌等特點。Pu29基因組不攜帶編碼毒性或抗性因子的基因。利用酰胺反應將其與羧基化的磁性納米材料偶聯得到探針PhagePu29-MBs。在最優條件下，該探針用于分離富集沙門氏菌，捕獲效率最高可達到83.93%，最低捕獲細菌濃度為45 CFU/mL，孵育時間為20 min，分離富集所需時間為30 min，可有效用于加標樣品中沙門氏菌的分離富集。因此，本研究基于噬菌體Pu29建立了一種快速、特異性強的沙門氏菌磁分離方法，可為開發基于噬菌體快速分離富集食品中的病原菌奠定一定的研究基礎。