紅毛藻血管緊張素轉化酶抑制肽的篩選及其穩定性評價

吳靖娜，洪喬茜，廖榕榕，蔡水淋，陳曉婷，蘇海燕，蘇 筱，許 莉，潘 南，卓詩晴

（1.廈門醫學院 海洋生物醫藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；2.廈門醫學院 廈門市海洋藥用天然產物資源重點實驗室，福建 廈門 361023；3.福建省水產研究所，福建 廈門 361013）

高血壓是我國乃至全世界最為常見的一種慢性疾病，全世界近10億 人患有高血壓，預計到2025年，全世界將有15.6億 人患有高血壓[1]。目前，藥物仍是治療高血壓的主要手段，其中血管緊張素轉化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）抑制劑是最常用的抗高血壓藥物之一，ACE是一種鋅金屬肽酶，是高血壓發病機制中的一個關鍵蛋白靶標[2]，ACE可催化無升壓活性的血管緊張素（angiotensin，ANG）I脫去C末端的兩個氨基酸后轉化為具有較強升壓活性的血管緊張素II（ANG II），還能水解激肽-激肽釋放酶系統中具有舒張血管功能的緩激肽（bradykinin，BK）C末端的Phe-Arg，使其失去活性，導致血壓升高[3]。而ACE抑制劑通過抑制ACE活性來阻斷ANG II的生成，減弱BK的降解，從而達到降低血壓的目的[4]。目前已有多種合成的ACE抑制劑如卡托普利和依那普利等作為抗高血壓藥物被開發和臨床應用，然而，單一使用ACE抑制劑藥物不能有效地降低血壓，還可能引發干咳、瘙癢、皮疹和腎功能衰竭等副作用[5]，因此，安全營養的ACE抑制劑亟待研究。食源性生物活性肽作為天然的功能因子，除了具有ACE抑制活性外，還具有抑制膽堿酯酶[6]、β-分泌酶[7]等多種生理活性，因此，食源性ACE抑制肽作為多功能的抗高血壓物質，具有良好的應用前景。

海洋占地球表面積的71%，是未來的食品基地，海洋產品更是人類攝取蛋白質的主要來源。海洋源降壓肽首次在發酵魚“bekasam”中被發現[8]，此后，在魚類、甲殼類、貝類和藻類中相繼被發現。如Sun Siqi等[9]從滸苔蛋白酶解液中獲得降血壓活性肽Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg和Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg，其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為219.35 μmol/L和236.85 μmol/L；Deng Zhenzhen等[10]從龍須菜中分離得到ACE抑制肽FQIN[M(O)]CILR和TGAPCR，其IC50分別為9.64 μmol/L和23.94 μmol/L，這兩個肽均表現出pH值、溫度、模擬胃腸道消化和ACE水解穩定性；Wang Kai等[11]從鈍頂節螺藻蛋白水解物中篩選出ACE抑制肽PTGNPLSP（IC50＝1.54 mg/mL），其在熱處理（25～100 ℃）和不同pH值條件（pH 3～11）下均具有較強的穩定性。

ACE抑制肽的制備方法主要有水解法、微生物發酵法和化學合成法等[12]。水解法主要有酸水解法、堿水解法和酶解法，其中酶解法是制備ACE抑制肽常用的方法[13]。然而，從酶解產物中分離到的活性肽組分極其復雜，同時在反復分離純化過程中損失嚴重，更重要的是，最終分離純化出的肽有可能錯過了活性最高的肽序列[14]。近年來，隨著質譜技術與肽組學技術的不斷改善，多種基于不同算法的de novo從頭測序軟件（如PEAKS Studio、Novor等）問世[15]，與數據庫搜索鑒定方法不同的是，de novo測序的肽段鑒定方法是根據質譜圖中離子峰的質量分布反映出肽及其片段的質量分布，通過算法算出相鄰離子峰的質量差從而推斷出對應的氨基酸殘基，然后使用模型推斷出譜圖中相對應的肽段序列[16]，能夠有效鑒定沒有包含于數據庫內的肽序列，克服了數據庫搜索的局限性。目前，ACE抑制肽活性評價主要是采用體外活性測定和體內動物實驗兩種方法，在前期活性肽的初篩一般是通過高效液相色譜法檢測反應體系中加入ACE抑制肽前后馬尿酸生成量的變化實現[17]，活性初篩過程耗資較大、耗時較長。近年來，結合計算機輔助設計活性肽的研究越來越多，運用靶標篩選的研究方法已逐漸成為活性肽研究的重要手段，已利用靶標篩選的方法成功地從大黃魚[18]、雞蛋蛋白[19]等食物蛋白中鑒定出新的ACE抑制肽。

因此，本研究以紅毛藻（Bangia fusco-purpurea）為原料，采用酶解法及超濾法制備ACE抑制活性肽，結合計算機輔助技術篩選獲得ACE抑制肽，并對其活性及穩定性進行評價，以期為海洋來源的降血壓肽的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅毛藻 福建省莆田市匯龍海產有限公司提供。

中性蛋白酶（200 U/m g、食品級）、牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硼砂（均為分析純），胃蛋白酶、胰蛋白酶（均為食品級）西隴科學股份有限公司；乙腈（色譜級）國藥集團化學試劑有限公司；馬尿酰組胺酰亮氨酸（Hippuryl-His-Leu，HHL）（色譜級）、ACE（1U）、馬尿酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Me204E分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科技儀器有限公司；5910R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；RE212-B旋轉蒸發儀 日本Yamato公司；Alpha 1-2冷凍干燥機 德國Christ公司；FlexStation 3鈣流檢測工作站 美國Molecular Device公司；FlowMen-0021-HP三聯高壓平板膜設備 廈門世達膜科技有限公司；E2695高效液相色譜儀 美國沃特世科技有限公司；Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅毛藻肽的制備

紅毛藻粉碎處理后，配成質量濃度為2.5 g/100 mL的溶液，經2%中性蛋白酶酶解后（56 ℃，4 h），8 000 r/min離心10 min去除殘渣，再經超濾設備分離酶解產物，最終收集＜800、800～2 000、2 000～10 000 Da和＞10 000 Da 4 個超濾組分，冷凍干燥后分別命名為F1、F2、F3、F4，篩選ACE抑制活性高的組分進行下一步分析。

1.3.2 ACE抑制活性的測定

將紅毛藻肽F1、F2、F3、F4分別配成100 μg/mL溶液，按表1的反應體系進行反應（其中樣品組加紅毛藻肽溶液，空白對照組加硼酸鹽緩沖液），反應結束后過0.22 μm微孔濾膜，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測馬尿酸的含量。

表1 ACE抑制活性檢測反應體系Table 1 Reaction systems for ACE inhibition assay

HPLC的檢測條件：Sunfire C18分析用色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：以乙腈-水（32∶68，V/V，含0.1%三氟乙酸）作為流動相，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，在228 nm波長處檢測馬尿酸的含量。

ACE抑制率按下式計算：

式中：A為對照組馬尿酸色譜峰面積；B為樣品組馬尿酸色譜峰面積。

1.3.3 ACE抑制肽的氨基酸序列分析

1.3.3.1 高效液相色譜串聯質譜分析

將篩選得到的ACE抑制活性最強的組分用2%乙腈配制成質量濃度為100 μg/mL的多肽溶液，利用Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀對其進行序列組成鑒定，質譜條件：色譜柱為PepMap RPLC C18（75 μm×150 mm，3 μm，100 ?），陽離子模式，掃描范圍為m/z300～1 500，發射極噴霧電壓2 kV，并記錄對應的二級質譜圖。

1.3.3.2de novo測序

將1.3.3.1節測定的原始數據raw文件導入到PEAKS Studio軟件中，采用de novo手動測序方法進行從頭測序分析，獲得肽序列，并對序列結果的準確性進行打分評估，選取殘差局部置信度（residue local confidence，ALC）＞80%的肽序列。

1.3.4 基于分子對接的ACE抑制肽的虛擬篩選

從PDB數據庫（www.rcsb.org）下載ACE的晶體結構（PDB ID：1O86），利用殷賦科技平臺（www.yinfotek.com）中【處理PDB結構】板塊對該蛋白進行以下處理：剔除水分子、溶劑分子和雜原子基團，添加氫原子和電勢，保留Zn2＋和Cl－。

將1.3.3節所獲得肽序列文件轉化為pdb格式文件，上傳至殷賦科技平臺中【準備多肽結構】板塊，生成配體的三維結構，對其進行能量優化，保存為MDL SDfile（sdf）格式。

通過殷賦科技平臺中【小分子虛擬篩選】程序對優化后的配體和受體進行半柔性對接，對接口袋中心大小為40.372、33.820、48.088 ?，對接盒子大小為35.025、40.810、37.633 ?，生成多個不同的構象取向。通過聚類分析（均方根誤差（root mean square deviation，RMSD）閾值為2.0 ?），得到對接打分和相互作用，分析結合模式。

1.3.5 虛擬篩選結果驗證

選取1.3.4節虛擬篩選對接打分最低的前6 個肽委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行固相化學合成，分別命名為L1、L2、L3、L4、L5和L6，然后分別配成100 μg/mL的溶液，按照1.3.2節的方法進行ACE抑制率的比較。并將ACE抑制活性前3的肽配制成不同質量濃度，以肽質量濃度為橫坐標，ACE抑制率為縱坐標，進行曲線擬合，計算IC50。

1.3.6 不同加熱溫度下ACE抑制肽穩定性分析

將1.3.5節獲得的抑制活性最強的ACE抑制肽配制成100 μg/mL的溶液，分別吸取500 μL置于20、40、60、80 ℃和100 ℃的水浴中加熱2 h，冷卻至室溫后，按照1.3.2節的方法測定ACE抑制率，以未處理的100 μg/mL肽溶液作對照組。

1.3.7 不同pH值下ACE抑制肽穩定性分析

用1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液，分別調節溶液pH值為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，在不同pH值溶液中等體積加入2 mg/mL肽溶液，反應2 h，將處理后的肽溶液用硼酸鹽緩沖液稀釋到100 μg/mL，測定ACE抑制率，以未處理的100 μg/mL肽溶液作對照組。

1.3.8 抗消化性能分析

1.3.8.1 人工胃腸液的配制

人工胃液的配制：取濃度為1 mol/L稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋至1 000 mL，置于4 ℃冰箱備用。

人工腸液的配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加500 mL水，用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH值至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加水適量使其溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL。

1.3.8.2 人工胃液單獨作用下ACE抑制肽穩定性分析

參照鄭志強等[20]的方法略作修改。用人工胃液將肽配制成1 mg/mL的溶液，37 ℃、200 r/min水浴2 h。100 ℃恒溫水浴10 min滅酶，冷卻后3 000 r/min離心20 min，將處理后的肽溶液用硼酸鹽緩沖液稀釋為100 μg/mL，測定ACE抑制率。以未處理的100 μg/mL肽溶液作對照組。

1.3.8.3 人工腸液單獨作用下ACE抑制肽穩定性分析

參照鄭志強等[20]的方法略作修改。用人工腸液將肽配制成1 mg/mL的溶液，37 ℃、200 r/min水浴2 h。100 ℃恒溫水浴10 min滅酶，冷卻后3 000 r/min離心20 min，將處理后的肽溶液用硼酸鹽緩沖液稀釋為100 μg/mL，測定ACE抑制率。以未處理的100 μg/mL肽溶液作對照組。

1.3.8.4 模擬人體胃腸消化下ACE抑制肽穩定性分析

用人工胃液將肽配制成2 mg/mL的溶液，37 ℃、200 r/min水浴2 h后調pH值至6.8，添加同體積的人工腸液，37 ℃、200 r/min水浴2 h。100 ℃恒溫水浴10 min滅酶，冷卻后3 000 r/min離心20 min，將處理后的肽溶液用硼酸鹽緩沖液稀釋至100 μg/mL，測定ACE抑制率。以未處理的100 μg/mL肽溶液作對照組。

1.3.9 不同金屬離子作用下ACE抑制肽穩定性分析

參照朱薪等[21]的方法略作修改。將肽配制成200 μg/mL的溶液，分別加入等體積的NaCl、KCl和MgCl2溶液使不同金屬離子溶液的終濃度分別為10、15 g/100 mL和30 g/100 mL，2 h后測定ACE抑制率，以不加金屬離子的100 μg/mL肽溶液作對照組。

1.3.10 不同光照類型作用下ACE抑制肽穩定性分析

參照相歡等[22]的方法略作修改。將肽配制成100 μg/mL的質量濃度，室溫條件下，分別置于日光燈、紫外燈和黑暗環境中30 min后，測定ACE抑制率。以未處理肽溶液作對照。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 紅毛藻肽的超濾分級及ACE抑制活性比較

如表2所示，F2（800～2000 Da）和F4（＞10 000 Da）組分的得率相對較高，分別為25.86%和27.83%，然而F2組分的ACE抑制率明顯高于F4，為（75.44±0.81）%。因此選擇F2組分進行下一步研究。

表2 超濾分級得率及ACE抑制活性比較Table 2 Comparison of yields and ACE inhibitory activities of fractions obtained by ultrafiltration

2.2 紅毛藻肽序列預測及虛擬篩選

根據串聯質譜數據進行的從頭測序是蛋白質組學中進行蛋白質特性分析的關鍵技術[23]，從頭測序的任務是基于給定質譜譜圖和肽段質量分布的情況下，通過算法從譜圖離子峰推斷出肽的氨基酸序列，并對序列結果的準確性進行打分評估。作為de novo結果的置信度，當ALC＞80%表示結果較為可信。本研究通過de novo測序，獲得ALC＞80%的紅毛藻肽39 條。

以所預測的39 條肽作為配體，優化后的ACE晶體結構（PDB code：1O86）為受體，采用殷賦科技云計算平臺的半柔性對接進行分子對接，得到對接打分和相互作用，對接打分的數值越?。ń^對值越大）說明肽與ACE的結合能力越強，ACE的抑制活性也可能越強。對接結束后，選取對接打分排名前6的紅毛藻肽（表3），進行后續ACE抑制活性的驗證。

表3 對接打分結果Table 3 Molecular docking results

2.3 紅毛藻ACE抑制肽活性驗證

將L1、L2、L3、L4、L5、L6共6 條ACE抑制肽分別配成100 μg/mL的溶液，檢測各成分的ACE抑制活性，結果如表4所示，L1的抑制率最佳，L5和L3次之，L2對ACE的抑制效果最弱，各組間抑制率差異顯著（P＜0.05）。

表4 紅毛藻ACE抑制肽活性驗證Table 4 Amino acid sequence and activity of ACE inhibitory peptides from Bangia fusco-purpurea

挑選抑制活性前3的紅毛藻ACE抑制肽，將L1配制成6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 5 個質量濃度梯度，L3配制成62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL 7 個質量濃度梯度，L5配制成62.5、125、250、500、1 000 μg/mL 5 個質量濃度梯度后，測定其ACE抑制活性并計算IC50，結果顯示L1、L3和L5的ACE抑制率的IC50分別為14.22、183.4 和152.8 μg/mL。因此選擇L1進行進一步的研究。

2.4 紅毛藻ACE抑制肽L1與ACE的結合位點分析

采用分子對接的方法對L1（LVLLFLFGE）與ACE對接構象進行分析。ACE中有3 種主要的活性位點殘基，分別是S1（Ala354、Glu384和Tyr523）、S2（Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520）和S’1（Glu162）[24]。由圖1可知，L1與ACE之間共有6 個氫鍵相互作用，與L1產生氫鍵作用的氨基酸殘基包括Glu123、Tyr135、Trp220、Met223、Ala356、Glu384，二者之間形成的氫鍵網絡是L1與ACE穩定結合的關鍵；L1還與ACE中的氨基酸殘基His353、His513形成鹽橋作用，這些作用為化合物的結合提供了－6.117 3 kcal/mol的靜電力貢獻。此外，結合口袋中具有多個疏水殘基，可與L1形成較強的疏水作用，提供范德華力貢獻，這些疏水性較強的氨基酸殘基包括Arg124、Ile201、Asp358、Phe391、Tyr523等。

圖1 L1（LVLLFLFGE）與ACE結合模式圖Fig.1 Binding mode of L1 (LVLLFLFGE) to ACE

2.5 紅毛藻ACE抑制肽L1的穩定性分析

2.5.1 不同溫度處理對L1穩定性的影響

由于多肽自身的不穩定性以及在高溫下容易降解等原因，往往限制了多肽類功能因子的使用，同時給多肽的生產、運輸和保存造成了困難。為了確保ACE抑制肽L1在實際情況中的正常應用，本實驗研究了不同溫度條件下抑制肽L1的ACE抑制活性變化。

由圖2可知，L1經不同溫度加熱處理后，ACE抑制率均在96%以上，表明L1在20～100 ℃內均能保持較好的ACE抑制活性。邵燕秋[25]從鰻魚骨膠原蛋白中提取多肽GPAGPAGPR和GPPGPPGL并將其在不同溫度（20～100 ℃）進行處理，結果表明處理后ACE抑制活性沒有明顯的變化（P＞0.05）。楊晨[26]以南瓜籽蛋白為原料制備ACE抑制肽，當溫度為20～80 ℃時，南瓜籽ACE抑制肽的活性抑制率基本沒有顯著變化（P＞0.05）?？傮w看來，L1受溫度的影響較小，能夠耐受長時間高溫，這對于利用活性成分制備功能性食品具有一定的實用意義。

圖2 加熱溫度對L1的ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of heating temperatures on the ACE inhibitory activity of L1

2.5.2 不同pH值處理對L1穩定性的影響

L1溶解于甲酸，故L1肽溶液呈酸性（pH＜2）。L1在不同pH值下分別處理2 h后，其ACE抑制率的變化情況如圖3所示，對照組L1的ACE抑制率最高，為（98.32±0.07）%，隨著pH值的升高，L1的ACE抑制率呈顯著下降趨勢（P＜0.05）；pH值為10和12時，L1的ACE抑制率顯著低于pH值為2、4、6和8（P＜0.05），這可能是由于在堿性條件下，多肽易發生外消旋或脫酰胺反應，導致活性減弱[27]。因此推測L1對pH值處理較敏感，在酸性條件下ACE抑制率相對較強。

圖3 pH值對L1穩定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of L1

2.5.3 體外模擬胃腸消化對L1穩定性的影響

L1對胃腸道消化酶系的穩定性研究結果如圖4所示。胃液的pH值為1～2，且存在胃蛋白酶，食物在胃里被排空的時間一般為1～2 h，單獨模擬胃消化反應2 h后L1的ACE抑制率下降顯著（P＜0.05），但ACE抑制率仍達到（93.54±0.13）%；單獨模擬腸消化反應2 h后，L1的ACE抑制率顯著下降（P＜0.05），但ACE抑制率仍達到（93.99±0.27）%；當同時模擬胃腸消化時，L1的ACE抑制率亦顯著下降（P＜0.05），但是其抑制率比單獨處理時高，為（97.64±0.51）%，這與羅鵬等[28]用葵花籽粕制備的ACE抑制肽在模擬胃液和腸液中活性的變化規律類似，而王樂[29]對桃仁分離蛋白酶解物AN4、BA6和CN6進行模擬胃消化后，ACE抑制率呈上升趨勢，但經過模擬腸消化后的ACE抑制率卻顯著降低。多肽的生物活性主要依靠肽鏈中氨基酸分子間的協同作用，因此，氨基酸與多肽相比活性較弱[30]，多肽在胃腸消化過程中，經胃蛋白酶、胰蛋白酶的作用進一步水解成分子質量更小的短肽或氨基酸，部分具有ACE抑制活性的多肽被破壞[31]，從而導致ACE抑制活性降低，單獨或者同時模擬胃腸消化所生成的短肽不一樣，亦會使其抑制率變化規律不一致。

圖4 體外模擬胃腸消化對L1穩定性的影響Fig.4 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on the stability of L1

2.5.4 不同質量濃度金屬離子對L1穩定性的影響

由圖5可知，隨著金屬離子質量濃度的升高，L1的ACE抑制率總體呈下降趨勢（P＜0.05），但是ACE抑制活性相對較高，抑制率均在96%左右；L1經10 g/100 mL和15 g/100 mL的NaCl/KCl處理后，ACE抑制率差異不顯著（P＞0.05），當金屬離子質量濃度增加到30 g/100 mL時，ACE抑制率顯著降低（P＜0.05）；不同濃度的MgCl2處理后L1的ACE抑制活性差異顯著（P＜0.05）。劉鑫烔等[32]研究發現一定濃度的NaCl對皮氏蛾螺降血壓肽ACE抑制活性的影響很小，但在高濃度NaCl條件下，對皮氏蛾螺降血壓肽ACE抑制活性的影響顯著，但Zhu Qiaonan等[33]研究發現來源于油茶籽餅粕蛋白的ACE抑制肽在Na＋、Mg2＋金屬離子處理過程中，ACE抑制活性無明顯變化。

圖5 不同質量濃度金屬離子對L1穩定性的影響Fig.5 Effect of different concentrations of metal ions on the stability of L1

2.5.5 不同光照類型對ACE抑制肽穩定性的影響

由圖6可知，與對照組相比，黑暗和日光燈照射處理對L1的ACE抑制活性無顯著影響（P＞0.05），而紫外燈照射條件下，L1的ACE抑制率顯著下降（P＜0.05），表明該產品在實際生產中和貯藏過程中應盡量避免暴露于紫外條件下，以減少影響其ACE抑制活性。

圖6 不同光照類型對L1穩定性的影響Fig.6 Effect of different types of light exposure on the stability of L1

3 結論

海藻作為重要的海洋生物資源，因其含有豐富的活性成分，已成為海洋生物制品研究領域的重要發展方向之一。海洋來源降血壓肽的開發極具發展前景，本實驗基于中性蛋白酶法和超濾分離獲得具有ACE抑制活性的紅毛藻肽組分，利用液相色譜-串聯質譜法與PEAKS Studio軟件的de novo模塊相結合，對數據進行從頭測序分析，獲得ALC高于80%的紅毛藻肽39 條。并以此為配體、優化后的ACE晶體結構為受體，采用分子對接高效篩選出與ACE結合最緊密的6 條ACE抑制肽L1（LVLLFLFGE）、L2（LLPPLELYN）、L3（KFGSKAKN）、L4（LADGNKR）、L5（TTMLWFP）和L6（LLSTRN）；通過HPLC法對所獲得肽的ACE抑制活性進行驗證，發現L1（LVLLFLFGE）的抑制活性最強，IC50為14.22 μg/mL；通過分子對接發現，該肽與ACE之間共有6 個氫鍵相互作用，并與ACE中的氨基酸殘基His353、His513形成鹽橋作用，與結合口袋中多個疏水殘基形成較強的疏水作用。

在實際的生產加工和人體胃腸消化過程中，ACE抑制肽的活性可能會發生變化，因此，本實驗還對L1的加工及消化穩定性進行研究。實驗結果表明：20～100 ℃加熱2 h對L1的ACE抑制活性無顯著影響（P＞0.05）；L1對不同pH值處理較敏感，隨著pH值的升高，ACE抑制肽活性顯著下降（P＜0.05）；經體外模擬胃腸液處理后L1的ACE抑制率雖然低于對照組，但仍具有較高ACE抑制活性；隨著金屬離子質量濃度的升高，L1的ACE抑制率總體呈下降趨勢（P＜0.05），但是ACE抑制活性相對較高，ACE抑制率均在96%左右；此外，紫外處理會使L1的ACE抑制活性顯著下降（P＜0.05）。