3 個不同地區母嬰糞便來源嗜黏蛋白阿克曼菌的分離及其體外益生特性分析

萬開瑞，孟凡姝，陳麗瀾，田豐偉，黃麗麗,*，倪永清,*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）被認為是專性共棲于人類和高等動物腸道黏膜層的一種嚴格厭氧的革蘭氏陰性菌，分類上隸屬于疣微菌門（Verrucomicrobia）[1]。其最顯著的特征是生長于腸道黏液層中，專性利用黏液層中的黏蛋白作為碳、氮源和能源而生存。此外，Akk菌株能利用母乳寡糖作為底物生長。研究發現，Akk菌株對維持腸道黏膜層的厚度、保護腸道屏障的完整性、通過生態位競爭抵御外來病原體在腸道的定植發揮重要作用[2]。動物和臨床研究顯示，Akk菌株對緩解炎癥性腸病[3]、肥胖[4]、糖尿病[5]、心血管疾病[6]、酒精性脂肪肝[7]等有明顯效果，目前在功能食品、醫藥等領域被認為是極具開發價值的新一代益生菌而備受關注。根據文獻報道，Akk在人類十二指腸（0.068 8%）、回腸（0.038 7%）、空腸內容物（0.01%）中的豐度很低；而在結腸和直腸黏膜層中分布更多的杯狀細胞，分泌大量的黏蛋白，Akk的豐度相對較高[8]。

目前，由于直接從人類小腸、大腸腸道內容物、黏液層取樣較為困難，一般通過糞便進行取樣，而糞便中Akk菌株的豐度很低，故大多以糞便作為菌株分離來源的研究，其報道結果差異極其懸殊。此外，由于Akk菌株嚴格厭氧、離體生長條件要求苛刻、生長緩慢，使其在固體培養基上難以與糞便中其他革蘭氏陽性菌株競爭生長。截至目前，從人群糞便中直接分離得到Akk菌株仍然是研究開發該菌株的關鍵性挑戰，使得相關研究工作受到限制[9]。關于Akk菌株的模型動物實驗、臨床試驗，多數研究依然針對模式菌菌株A.mucinniphilaMucT（ATCC BAA-835）開展。最近多個研究發現，腸道中Akk種群存在顯著遺傳差異和多樣生理特性。有報道顯示，人腸道中至少有8 個不同的Akk亞型，菌株之間的16S rRNA序列相似性最低95%。采用188 個分離菌株基因組和2 226 個宏基因組組裝基因組，對Akk進行了大規模基因組學分析，重建系統發育樹顯示，人源Akk菌株很可能分為5 個不同的候選亞種；其中Akk分為4 個亞種，具有不同的宿主偏好和功能特征[10]。但是，目前沒有得到其他亞種或基因型的可培養物。

鑒于目前全球各地區人群Akk菌株的研究報道，了解中國人群腸道中Akk菌株的多樣性和分布狀況，開發新的有潛力、適合于中國人群的新一代益生菌很有必要。本研究收集我國新疆和田、海南昌江、甘肅武威人群的糞便樣品，探究糞便樣本Akk菌株分離的有效方法，初步揭示Akk菌株在宿主人群中的分布差異，分析Akk菌株的遺傳多樣性與體外益生特性。旨在為進一步研究Akk菌株與不同區域宿主人群的健康關系、開發本土化的益生菌奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

2019年11月至2020年9月采集健康的母嬰人群糞便樣品共48 份（新疆和田、海南昌江、甘肅武威8 對各16 份）。標記好樣品后保存于－18 ℃的車載冰箱3 d內運回實驗室，同時詳細調查并記錄采集對象的信息，包括年齡、體質量、飲食習慣、抗生素使用情況等。每位參與者簽署了知情同意書，本項研究通過石河子大學醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審核。

1.1.2 培養基與試劑

改良的富集培養基（1 L）[11]：腦心浸出液肉湯（brain heart infusion，BHI）38.5 g、黏蛋白4.0 g、L-蘇氨酸5.0 g、N-乙酰-D-氨基葡萄糖5.0 g、大豆蛋白胨16.0 g、葡萄糖11.3 g、L-半胱氨酸0.5 g、吐溫80 1.0 mL。

改良BHI培養基（1 L）[12]：BHI 38.5 g、黏蛋白4.0 g、L-半胱氨酸0.5 g、萬古霉素0.005 g。

益生元培養基（1 L）[11]：大豆蛋白胨32.0 g、蘇氨酸6.0 g、N-乙酰-D-氨基葡萄糖6.0 g、氯化鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.5 g、黏蛋白4.0 g、吐溫80 1.0 mL、L-半胱氨酸0.5 g、益生元8.0 g。

Akk模式菌株 廣東省微生物菌種保藏中心（ATCC BAA-835）；BHI 青島海博生物技術有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、ddH2O 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Marker 天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DG520厭氧培養箱 英國Don Whitley Scientific公司；Fresco21高速冷凍離心機 德國Thermo公司；Multiskan FC酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；TC-512 PCR儀 英國Techne公司；Gel DOC XR凝膠成像系統、PowerPac Universal水平電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 對不同母嬰陽性樣品的篩選和Akk菌株的分離

取1 g糞便樣品，用含有5%L-半胱氨酸的生理鹽水稀釋至10－2、10－3、10－4，混勻后吸取500 μL，加入4.5 mL改良的富集培養基中，置于37 ℃厭氧箱中富集培養4 d。根據翟齊嘯等[13]的方法提取樣品總DNA，采用特異性引物（AM1：5’-CAGACGTGAAGGTGGGGAC-3’；AM2：5’-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3’）進行實時PCR（real-time PCR）擴增陽性率檢測。反應體系：2×PCR Master Mix 5.0 μL、AM1 0.5 μL、AM2 0.5 μL、樣品DNA 2.0 μL，補充ddH2O至10.0 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min后，35 個循環（95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min），最后72 ℃延伸10 min[14]。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測，選擇與Akk模式菌株（ATCC BAA-835）擴增產物條帶一致的陽性擴增樣品進行固體平板的分離培養。樣品同樣進行梯度稀釋后，取100 μL菌懸液均勻涂布于改良BHI培養基平板上，按照上述條件厭氧培養4～5 d。

1.3.2Akk菌株的篩選和鑒定

挑取直徑在1 mm以內、乳白色、黏稠狀菌落，連續轉接2 次重新劃線在固體平板上，每次培養72 h，最后挑取單菌落，鏡檢至純菌株后，接種于液體BHI改良培養基中，培養5～7 d。根據上述方法提取篩選菌株的DNA，再次用Akk特異引物進行PCR擴增，鑒定并選擇陽性菌株，送至金唯智生物科技有限公司進行16S rRNA基因測序，測序結果提交至GenBank數據庫中進行序列同源性比對（BLAST），并用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹。

1.3.3 基于基因外重復回文序列PCR（repetitive extragenic palindrome-PCR，rep-PCR）指紋圖譜的遺傳差異分析對Akk菌株的篩選

將上述獲得分離菌株的DNA采用通用引物(GTG)5和BOXAir擴增，進行rep-PCR指紋分型分析，參照魏小晶等[15]的擴增條件，所有反應在25 μL體系中進行，其中：PCR Master Mix 12.5 μL，引物(GTG)5或BOXAIR 1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增產物上樣至1.6 g/120 mL的瓊脂糖凝膠，在1×TAE Buffer中100 V電泳2 h后，用紫外凝膠成像儀觀察結果并拍照保存，采用GelCompar v8.0軟件進行指紋圖譜聚類分析。

1.3.4 篩選Akk菌株的體外益生特性分析

1.3.4.1 菌株的模擬胃腸液耐受性

參考魏小晶等[15]的方法略有改動，用鹽酸將蒸餾水pH值調節至3.5，加入胃蛋白酶，使其終質量濃度為10 mg/mL，過濾除菌得到模擬胃液。0.68 g KH2PO4溶解于50 mL蒸餾水中，pH值調節至7，在加入胰蛋白酶1 g后，定容至100 mL，過濾除菌得到模擬腸液。將菌液培養24 h后，按體積比1∶10混合于模擬胃液中，37 ℃恒溫厭氧靜置培養，4 h后稀釋并進行平板涂布及菌落計數。在模擬胃液中作用4 h后的混合液進一步以1∶10的體積比混合于模擬腸液中，在4 h后稀釋后平板涂布菌落計數。將菌液加入未經處理的無菌磷酸鹽緩沖液中進行對照。每組3 個平行，按式（1）計算存活率：

式中：N1為模擬胃液或腸液處理后的活菌數/（CFU/mL）；N0為對照中的活菌數/（CFU/mL）。

1.3.4.2 菌株的疏水性

通過測定細菌對碳氫化合物的黏附能力可以反映其疏水性，基于Cozzolino等[16]方法使用二甲苯對細菌進行黏附能力實驗，并進行修改。將Akk菌株過夜培養24 h后，洗滌2 次并重新懸浮在磷酸緩沖液中，以達到0.50±0.05的吸光度（A600nm）。然后將細菌懸浮液和二甲苯等量混合，兩相系統徹底混合后在室溫下孵育15 min和60 min，取水相，使用酶標儀測量其在600 nm波長處的吸光度。設置3 個平行，按式（2）計算Akk菌株對二甲苯的親和力（疏水性）：

式中：A0、A1分別為試劑混勻前后菌液在600 nm波長處的吸光度。

1.3.4.3 抗生素敏感實驗

根據Das等[17]方法對分離出來的Akk菌株進行8 種抗生素藥敏實驗，采用紙片瓊脂擴散法，將活化好的Akk菌株懸液均勻涂布于改良BHI瓊脂平板表面，將藥片貼于其上，37 ℃倒置厭氧培養72 h，檢測抑菌圈半徑，每種抗生素做3 個平行，抑菌圈直徑平均值用TB-tools軟件作圖。本實驗選擇使用萬古霉素（30 μg）、紅霉素（15 μg）、氯霉素（30 μg）、卡那霉素（30 μg）、慶大霉素（120 μg）、克林霉素（2 μg）、鏈霉素（300 μg）、諾氟沙星（10 μg）8 種抗生素。

1.3.4.4Akk菌株益生元利用實驗

在逄曉陽等[18]方法的基礎上，采用含有黏蛋白的益生元培養基對Akk菌株進行益生元利用實驗。10 種益生元（包括低聚木糖、低聚麥芽糖、低聚半乳糖、棉子糖、果糖、葡萄糖、水蘇糖、抗性淀粉、菊糖、腦心浸出液）加入益生元液體培養基中，將待測的Akk菌株在改良BHI培養基中復蘇活化，在厭氧工作站中培養24 h后，將復蘇活化后菌液以5%接種量接種到益生元培養基中，設置3 個平行，以添加葡萄糖作為陽性對照，不添加其他碳源為陰性對照，在600 nm波長處測OD值，測定0 h的OD600nm為OD1。37 ℃厭氧培養72 h，測定OD600nm為OD2，最終OD600nm＝OD1－OD2，根據最終OD600nm用TBtools軟件作熱圖。

1.3.4.5Akk菌株抗氧化能力的測定

Akk菌株對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測定根據文獻[19]方法略有改動。稱取0.004 g DPPH，用95%乙醇溶液溶解，定容至100 mL，配制成0.04 mg/mL的DPPH自由基溶液，4 ℃避光保存。將前面分離得到的Akk菌株與ATCC BAA-835菌株在改良BHI培養基中，以相同厭氧條件下37 ℃過夜培養72 h后，將細胞懸浮液在4 ℃的條件下以8 000 r/min離心8 min，取其上清液，將1 mL上清液與1 mL新鮮配制的DPPH無水乙醇溶液混合均勻，室溫放置30 min，無水乙醇作為空白調整，在517 nm波長處測定吸光度，按式（3）計算DPPH自由基清除率：

式中：A0為1 mL無水乙醇＋1 mL DPPH自由基溶液的吸光度；Ai為1 mL樣品溶液＋1 mL DPPH自由基溶液的吸光度；Aj為1 mL樣品溶液＋1 mL無水乙醇的吸光度。

2 結果與分析

2.1 對不同母嬰陽性樣品的篩選和Akk菌株的檢測結果

real-time PCR對3 個地域（甘肅武威、新疆和田、海南昌江）采集的48 份母嬰糞便中Akk菌株的檢測結果表明，武威母嬰人群的16 份糞便樣本陽性率為31.25%（母親3 份、嬰兒2 份），和田母嬰16 份糞便樣本中陽性檢測率75%（母親6 份、嬰兒6 份），昌江母嬰16 份糞便樣本中陽性檢測率為37.5%（母親3 份，嬰兒3 份）。48 份樣品中，Akk菌株的總體陽性檢測率為47.92%，其中成年人陽性率為50%，嬰兒陽性率為45.83%；不同地域母嬰族群Akk菌株陽性檢測率具有一些差異，和田母嬰（75%）＞昌江母嬰（37.5%）＞武威母嬰（31.25%），成年人＞嬰幼兒。

2.2 Akk菌株的分離、篩選、鑒定和遺傳差異分析

對3 個地域母嬰來源檢測陽性的23 份糞便樣品富集培養，稀釋液平板涂布分離，根據菌株表型特征，獲得的分離株進行16S rRNA基因測序、BLAST比對后，24 株分離菌株初步鑒定為Akk，來自8 份Akk菌株檢測陽性的糞便樣品。但是real-time PCR檢測陽性率最高的和田糞便樣品并沒有分離到菌株。選擇其中10 株代表菌株與其他參考菌株構建系統進化樹（圖1），可以看出分離菌株與Akkermansia屬的Akk親緣關系最近，所有菌株的16S rRNA基因與AkkATCC BAA-835高度相近，屬于同一個單系的進化分支，與該屬另一個種A.glycaniphila親緣關系較遠。所有菌株與登錄號為CP048438.1的AkkJCM30893相似度達到99%以上，結合Akk特異引物的PCR陽性擴增菌株篩選，將所有24 株菌鑒定為Akk菌株。

圖1 基于16S rRNA基因序列的10 株Akk代表菌系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 10 representative Akk strains based on 16S rRNA gene sequences

選擇1 8 株代表性Akk分離菌株和模式菌株ATCC BAA-835進行rep-PCR指紋圖譜聚類分析，由圖2可知，19 株Akk菌株在55%的相似性水平上被分成了2 個大群、4 個小群：第1群的4 株分離株和ATCC BAA-835的基因型高度相近；第2群的8 株分離株與第3群的2 株分離株基因型接近，同屬于一個大的分支；第4群的4 株菌株與隸屬于第2、3群菌株有一定程度的遺傳差異。

圖2 基于rep-PCR對18 株代表性Akk的指紋圖譜進行聚類Fig.2 Clustering of fingerprint profiles of 18 representative Akk strains based on rep-PCR

2.3 篩選Akk菌株的表征特性分析

2.3.1 分離Akk菌株的模擬胃腸液耐受性

通過模擬胃、腸液計算存活率，檢測分離Akk菌株的耐受能力，結果見表1。除WW48D4-1以外，剩下所有測試菌株都對模擬胃液具有一定程度的耐受力，但是菌株之間差異顯著，其中菌株ATCC BAA-835、HN18D-1、HN18D-3、WW49X23-1具有較好的耐受性，在經過4 h的模擬胃液處理后，存活率達到10%以上，菌株WW48D1-13經處理后存活率為9.55%。隨后進行模擬腸液實驗，菌株ATCC BAA-835、HN18D-1、HN18D-3、WW48D1-13、WW48D15-4、WW50D-9在4 h之后仍有1%以上的存活率。綜合胃液、腸液耐受性，菌株ATCC BAA-835、HN18D-1、HN18D-3、WW48D1-13對模擬胃腸液耐受能力最優。

表1 Akk經模擬胃腸液處理后的存活率Table 1 Survival rates of Akk strains in simulated gastrointestinal fluid

2.3.2 分離Akk菌株的疏水性

分離Akk菌株的疏水性結果顯示，所有實驗菌株都具有疏水性，不同菌株的疏水性有明顯差異（圖3）。在60 min，模式菌株ATCC BAA-835的疏水性為33.04%，本實驗中4 株菌株（WW48D15-4、WW48D4-2、WW50D-6、WW49X23-3）的疏水性相對較高，超過40%，有10 株分離菌株的疏水性都接近或者高于ATCC BAA-835。

圖3 Akk分離株與模式菌株ATCC BAA-835在二甲苯接觸15、60 min后的疏水性比較Fig.3 Comparison of hydrophobicity of 24 Akk strains with that of the type strain ATCC BAA-835 exposure to xylene for 15 or 60 min

2.3.3 抗生素敏感實驗

25 株Akk菌株對8 種抗生素的敏感性實驗采用熱圖形式顯示（圖4），顏色梯度（紅色、淡紅色、黃綠色、灰色、淺藍色、深藍色）直觀地反映菌株對抗生素的抑菌圈半徑依次減小。不同分離株對抗生素敏感性有差異。總體上，所有Akk菌株對4 種抗生素（萬古霉素、克林霉素、卡那霉素和紅霉素）顯示了一定程度的耐藥性。所有分離株對氯霉素有很高的敏感性，對慶大霉素、鏈霉素、諾氟沙星的敏感性和文獻報道ATCC BAA-835的敏感性相似。

圖4 基于抑菌圈半徑對25 株Akk的抗生素抗性熱圖分析Fig.4 Heatmap analysis of antibiotic resistance to 24 Akk strains and the type strain ATCC BAA-835 based on the radius of inhibition zone

2.3.4 含有黏蛋白的益生元培養基對分離Akk菌株的作用

圖5為600 nm波長處吸光度的熱圖，顯示了在黏蛋白培養基中添加各種益生元對分離Akk菌株生長的作用，菌株之間存在差異。以葡萄糖作為陽性對照，培養基添加低聚木糖、大豆低聚糖能夠顯著促進Akk菌株的生長，其他益生元對Akk菌株的生長促進相對較弱。其中菊糖對菌株WW48D1-2有促進作用外，其他益生元都對其生長促進作用不大。

圖5 黏蛋白益生元培養基對分離Akk株生長的作用Fig.5 Addition of xylooligosaccharides and soybean oligosaccharides to mucin-enriched medium promoted the growth of 24 Akk strains

2.3.5 分菌Akk菌株體外抗氧化能力分析

依據遺傳差異相近程度，對包括模式菌在內的17 株代表性Akk菌株，測試Akk菌株的DPPH自由基清除能力。由圖6可知，Akk菌株的DPPH自由基清除能力存在差異，菌株HN18D-1（63.22%）、HN18D-6（57.76%）、WW50D-7（58.91%）、HN50D-4（58.05%）、WW50D-1（57.47%）、WW48D1-11（54.63%）對DPPH自由基清除率都達到50%以上，顯示出較好的體外抗氧化特性。

圖6 16 株Akk代表性菌株與模式菌株ATCC BAA-835體外抗氧化能力比較Fig.6 Comparison of in vitro antioxidant capacity of 16 representative Akk strains with that of the type strain ATCC BAA-835

3 討論與結論

自2004年第一次從人類糞便中分離得出Akk菌株以來，關于Akk菌株的研究報道逐漸成為熱門。尤其發現腸道菌群的改變可導致宿主出現肥胖、2型糖尿病等諸多代謝疾病[20]。通過小鼠實驗證實，肥胖、2型糖尿病的患病程度和腸道中Akk菌株的豐度呈顯著相關，但是其作用機制目前尚不明確[21]。隨著對Akk菌株研究的深入，其在癌癥治療[22]、緩解結腸炎[23]、減輕肝損傷[24]、改善代謝[25]、治療漸凍癥[26]、延緩衰老[27]等方面的巨大潛力逐漸顯現。最近，有研究發現滅活的Akk菌株對于改善肥胖人群的代謝功能有顯著效果，能夠降低體質量[28]。這些研究極大促進了Akk菌株作為商業化益生菌的可能性。

目前，雖然研究表明結腸和直腸黏膜層中Akk的豐度相對較高，但直接取樣人類腸道內容物、黏液層困難很大。糞便中Akk菌株的豐度很低，大多以糞便作為菌株分離來源的研究，其報道結果差異極其懸殊。前期研究根據翟齊嘯等[13]的專利，選擇先富集糞便樣品，進行初步篩選樣品后再進行涂布，成功分離到了Akk菌株。但其富集培養基不僅添加了黏蛋白，而且加入了極復雜的微量組分，操作復雜。本研究以Akk菌株復合培養基為基礎，綜合文獻報道，在富集培養基中除黏蛋白外，還加入了BHI培養基、蘇氨酸等促進Akk菌株生長的多個成分，簡化了富集培養的步驟，從48 份糞便樣品的富集液中的8 份樣品成功分離到Akk菌株。其次，本實驗在選擇培養過程中加入萬古霉素外，同時加入卡那霉素、慶大霉素能夠有效抑制糞便中其他競爭性菌株的生長，提高篩選的陽性率。Ouwerkerk等[29]研究發現，純化后Akk菌株在微量氧氣下生長狀態更好。但是分離的初步階段要處于嚴格厭氧環境，否則糞便中其他微耗氧雜菌生長旺盛，增加純化的難度。此外，本研究采用富集母嬰糞便樣品結合real-time PCR檢測的方法，顯示有近50%的樣品檢測陽性，但實際上只有8 份樣品成功分離到菌株。這與翟齊嘯等[13]在7 份糞便樣品檢測出1 份陽性，從中分離出9 株Akk菌株結果相近，表明取樣的糞便樣品中Akk菌株活菌存活率較低。

最近多個研究發現，腸道中Akk種群存在顯著的遺傳差異和多樣的生理特性。人腸道中的至少有8 個不同的Akk亞型，菌株之間的16S rRNA序列相似性最低95%。分離菌株基因組和宏基因組組裝基因組分析顯示，人源Akk菌株很可能分有多個不同的候選亞種[10]。本研究分離的24 株菌的16S rRNA基因序列與Akk的模式菌株ATCC BAA-835基本一致，因此全部隸屬于Akkermansia屬的Akk，與從蟒蛇糞便發現的該屬A.glycaniphila親緣關系較遠[30]。采用rep-PCR遺傳指紋圖譜技術研究了分離Akk菌株種群的遺傳差異，發現可以劃分為4 個亞群，在分析它們體外表型特征的基礎上，后續將對其基因組特征和其他表型開展更詳盡的解析。

目前，因分離培養Akk菌株的挑戰性，關于Akk分離菌株的體外研究較少，大多以Akk菌株的模式菌株（ATCC BAA-835）為研究對象。疏水性是一個重要的益生指標，本研究分離的菌株中，13 株Akk菌株的疏水性都高于模式菌ATCC BAA-835，11 株分離株具有中等以上疏水性。幾乎所有Akk菌株對萬古霉素、克林霉素、卡那霉素和紅霉素都具有一定程度的耐藥性，這與近期關于分離純化Akk菌株的探究中，在培養基中加入萬古霉素、卡那霉素、克林霉素可實現有效的選擇性分離培養結果一致[1]。

對目前廣泛作為益生元的各種低聚寡糖和多糖能否被Akk菌株有效利用的報道較少。有研究表明，給肥胖模型小鼠額外補充低聚果糖，其糞便中Akk菌株含量由107cells/g提高到109cells/g[21]。另一研究顯示，Akk菌株基礎培養基中，低聚木糖能作為有效益生元促進Akk菌株的生長[18]。從Akk菌株分離的難度，推測各種低聚寡糖和多糖被Akk菌株直接利用的效果還很差，有可能存在協同作用，目前機理尚不清楚。本實驗基于9 種益生元對24 株Akk菌株分離株的促生長作初步研究，與葡萄糖作為陽性對照相比，大豆低聚糖、低聚木糖能夠明顯促進Akk菌株的生長，但其他益生元效果不明顯。尤其需要驗證所有低聚糖的純度，以便確認這兩種低聚糖可以作為Akk菌株的益生元，在合生元配方或者微膠囊加工中加以組合利用。

綜上，本研究針對分離新的Akk菌株難度較大的現狀，采用改良的黏蛋白富集培養基結合real-time PCR檢測糞便樣品，優化了分離效果，但即使富集檢測陽性的樣品也不一定能成功分離到菌株。通過對比Akk模式菌株ATCC BAA-835與分離株的疏水性、抗生素敏感性、體外抗氧化特性和益生元利用的性能，得出Akk分離株HN18D-1、HN18D-3、WW48D1-13可作為潛在益生菌菌株進行下一步系統的研究。