基于Nrf2/HO-1通路探討健骨顆粒含藥血清對氧化應激狀態成骨細胞骨形成的調控機制

周 芬，孫 攀，黃云梅，王志強，林燕萍*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.上海中醫藥大學附屬市中醫醫院，上海 200071）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）屬于中醫“骨痿”“骨枯”“骨極”等范疇，是絕經后婦女以低骨量和骨組織細微結構退變為特征，并導致骨強度降低、骨脆性增加、易于骨折的全身代謝性疾病。由于PMOP 導致的病理性骨折及其并發癥有較高致殘率和致死率［1-2］，嚴重威脅著中老年女性的身心健康，且給家庭和社會帶來沉重的經濟和醫療負擔［3］。該病由于具體發病機制不甚明確，臨床療效也不佳，已成為世界性健康難題。

國內外研究發現氧化應激和骨質疏松癥密切相關，影響本病的發生與發展［4-6］。氧化應激是指由機體代謝過程中產生的活性氧（ROS），其包含超氧化物陰離子、過氧化物和羥基自由基等過度累積，超過機體抗氧化防御系統的清除能力，從而引起組織和細胞損傷的病理現象［7］。氧化應激狀態下，ROS 激活Nrf2 使其磷酸化，進入細胞核內啟動血紅素氧合酶（HO-1）的轉錄，而HO-1 能有效阻止機體氧化應激反應，故Nrf2/HO-1 通路是機體抗氧化應激的重要途徑，是機體抗氧化系統的重要組成部分［8］。氧化應激可調節成骨特異性轉錄因子2（RUNX2）的表達，降低成骨細胞活性［9］。由此可知，氧化應激與骨形成存在著密切聯系，氧化應激對骨形成的抑制作用是PMOP 發生的一個重要因素。本課題組前期研究結果顯示健骨顆粒對成骨細胞骨形成有較好的促進作用，證實健骨顆粒能夠有效防治PMOP［10-11］。由于氧化應激是PMOP 的主要原因之一，然而健骨顆粒的治療作用與抗氧化應激是否相關尚不明確，因此設計本實驗探討健骨顆粒能否通過Nrf2/HO-1 信號通路調節成骨細胞氧化應激狀態，促進骨形成。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗動物 12 周齡SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體質量（200±20）g，購自浙江省醫學科學院，實驗動物生產許可證：SCXK（浙）2019-0002。飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF 級實驗室，實驗動物使用許可證：SYXK（閩）2019-0007。本研究實驗方法和實驗動物處理方法已通過福建中醫藥大學動物倫理委員會審核（審批號：〔2018〕福中醫倫理審字第（038）號），符合動物實驗倫理要求。

1.2 實驗細胞 UMR-106 成骨樣細胞株購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（目錄號：TCR11）。

1.3 實驗藥材 健骨顆粒由煅狗骨、山茱萸、黨參、山藥等藥物組成，均購自福建同春藥業股份有限公司，由福建省中醫藥科學院中試車間依照課題組制劑工藝標準煎煮濃縮，制備成健骨顆粒浸膏，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 實驗試劑 胎牛血清（美國Sigma 公司，貨號：F8687）；青鏈霉素（貨號：SV30010）、高糖DMEM培養基（貨號：SH30022.01B）、PBS 緩沖液（貨號：SH30256.01B）均購自新西蘭Hyclone 公司；Nrf2（貨號：16396-1-AP）、HO-1（貨號：10701-1-AP）、β-actin 抗體（貨號：66009-1-Ig）、兔二抗（貨號：SA00001-2）、鼠二抗（貨號：SA00001-1）均購自美國Proteintech 公司；Western 封閉液（貨號：P0023B）、Western 一抗稀釋液（貨號：P0023A）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012）、超氧化物陰離子熒光探針（DHE，貨號：S0063）、DAPI 染色液（貨號：C1006）均購自上海碧云天生物技術有限公司；甘氨酸（貨號：1275GR500）、茜素紅染色液（貨號：RASMX-90021）均購自廣州賽業生物科技有限公司；30%過氧化氫（貨號：3004003-01-03）、甲醇（貨號：1030038-01-01）均購自西隴科學股份有限公司。

1.5 實驗器材 CO2培養箱、-80 ℃超低溫冰箱均購自美國Thermo Fisher 公司；低溫高速離心機、移液器均購自德國Eppendorf公司；恒溫水浴鍋、DHG-9070A 烘箱均購自上海精宏實驗設備有限公司；小型垂直電泳、小型Trans-Blot 轉印槽均購自美國Bio-Rad 公司；DFC295 倒置顯微鏡、DFC425 熒光顯微鏡均購自德國Leica 公司。

2 實驗方法

2.1 健骨顆粒含藥血清和生理鹽水血清制備 6 周齡SPF 級雄性SD 大鼠40 只，適應性喂養1 周后隨機分為健骨顆粒組和生理鹽水組，每組20 只。健骨顆粒組給藥劑量根據人與動物間體表面積折算的等效劑量系數換算，健骨顆粒組每天灌服含生藥量7.8 g/kg 健骨顆粒浸膏稀釋液2 mL，生理鹽水組每天灌服生理鹽水2 mL，2 組每日灌胃1 次，連續灌胃7 d。第7 天在灌胃1 h 后腹主動脈取血，靜置4 h后以3 000 r/min 離心15 min，分離上清，56 ℃水浴30 min 滅活補體，過濾除菌后分裝，置于-80 ℃冰箱保存。健骨顆粒組提取的血清即為健骨顆粒含藥血清，生理鹽水組提取的血清即為生理鹽水血清。

2.2 UMR-106 細胞復蘇與傳代 從-80 ℃冰箱中取出凍存的UMR-106 細胞，迅速置于37 ℃恒溫水浴鍋中，融化后加入1 mL 完全培養液，輕輕吹打，轉移至15 mL 離心管中；再加入5 mL 完全培養基，以1 000 r/min 離心3 min，棄上清，加入1 mL 完全培養基，輕輕吹打使細胞懸起，轉移至細胞培養瓶中；再加入4 mL 完全培養基，“8”字法搖勻后置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。待細胞密度為80%時進行傳代，棄去培養瓶中培養基，加入2 mL PBS，清洗2 次；然后向瓶中加入1 mL 含EDTA 胰蛋白酶，37 ℃消化1 min，向瓶中加入1 mL 完全培養液終止消化，輕輕吹下細胞，轉移至15 mL 離心管中，以1 000 r/min 離心3 min，棄上清；加入1 mL 完全培養液，輕輕吹打制成均勻的細胞懸液，向2 個培養瓶中各加入500 μL 細胞懸液，并加入4.5 mL完全培養基，混勻后置入細胞培養箱中。

2.3 實驗分組與干預 將課題組前期構建的Nrf2敲減穩定的UMR-106 細胞株和Nrf2 陰性對照細胞［12］，分別分為Nrf2-KD＋JG 組、Nrf2-KD＋NS 組和NC＋JG 組、NC＋NS 組。種皿后待細胞匯合至皿底80%面積，使用無血清培養基饑餓12 h 后，Nrf2-KD＋JG 組和NC＋JG 組分別采用10%健骨顆粒含藥血清［10］加高糖DMEM 培養12 h，Nrf2-KD＋NS 組和NC＋NS 組分別采用10%生理鹽水血清加高糖DMEM 培養12 h，再用10 μmol/L 過氧化氫干預12 h［12］。

2.4 觀察指標

2.4.1 DHE 檢測4 組超氧化物陰離子水平 將處于對數生長期的UMR-106 細胞消化重懸，按照1×105個/mL 接種于20 mm2共聚焦培養皿，按照“2.3”項下方法分組并干預4 組細胞。干預后棄上清，PBS洗凈皿內殘余培養液，每皿加500 μL 4%多聚甲醛固定細胞30 min，用PBS將DHE稀釋為2 μmol/L；每皿加入1 mL DHE，37 ℃孵育30 min，孵育完畢棄去皿內液體，PBS 洗皿5 min×3 次；再向皿內加入500 μL DAPI 染色液，37 ℃孵育5 min，PBS 洗皿5 min×3 次；雙轉盤激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，561 nm 波長下觀察DHE 紅色熒光，即細胞內超氧化物陰離子，488 nm 波長觀察DAPI 藍色熒光，即細胞核，ImageJ 軟件分析紅色熒光面積占藍色熒光面積的百分比，即相對熒光強度。

2.4.2 茜素紅染色觀察4 組礦化結節數量 將4 組細胞按照“2.3”項下方法干預后再更換完全培養基，連續培養2 周。期間觀察細胞生長情況，隔天換液1 次，2 周后棄去培養基，PBS 洗2 遍后每孔加1 mL 4%多聚甲醛固定細胞30 min；再PBS 洗2 遍后每孔加入1 mL 茜素紅染色液，染5 min 后棄去茜素紅染色液；再用PBS 沖洗3 次，于顯微鏡汞燈藍光下觀察礦化結節數量。

2.4.3 Western blot 法檢測4 組Nrf2、核Nrf2、HO-1及RUNX2 蛋白相對表達量 4 組細胞按照“2.3”項下方法干預后棄液，PBS 洗凈。① 細胞總蛋白提取：每皿加入100 μL 蛋白裂解液（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑＝100∶1∶1），冰上裂解30 min，用細胞刮刀將裂解好的細胞輕輕刮下，轉移至EP 管中，移至離心機中以12 000 r/min、4 ℃離心20 min，分離上清即為細胞總蛋白；② 細胞核蛋白提取：按照說明書配置Hypotonic Buffer（1 mL 加入5 μL 磷酸酶抑制劑和10 μL PMSF）和Lysis Buffer（1 mL加入5 μL磷酸酶抑制劑和10 μL PMSF）備用。PBS 洗凈皿內殘余培養液，向皿內加入450 μL 配置好的Hypotonic Buffer，冰上裂解10 min；用細胞刮刀將裂解好的細胞輕輕刮下移至EP 管，震蕩管壁使沉淀懸起，冰浴10 min，震蕩10 s，混勻，以3 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清；再加400 μL Hypotonic Buffer，震蕩洗滌沉淀30 s，再以5 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清；沉淀中再加入100 μL 配置好的Lysis Buffer，震蕩懸起沉淀，冰浴20 min，以15 000 r/min，4 ℃離心10 min，分離上清即為細胞核蛋白。BCA 法將蛋白定量后95 ℃金屬浴5 min 使蛋白變性，置于-80 ℃冰箱保存備用。配置好SDS-PAGE 膠后依序上樣，先用20 V 電壓電泳10 min，再調整到80 V 電壓電泳30 min，最后使用120 V 電壓電泳直至目的蛋白清晰分離后停止電泳。電泳結束后用濕轉法轉模，再用Western 封閉液封閉1 h，按比例加入一抗（Nrf2、HO-1 按1∶1 000 稀釋，RUNX2 按1∶2 000 稀釋）4 ℃過夜；次日取出并使用TBST 洗3 遍，加入相對應的二抗（稀釋比例為1∶10 000）孵育1 h，TBST搖洗后PVDF 膜放置在顯影盒內，均勻滴加顯影液，運行Image Lab 6.0 分析實驗結果。

2.5 統計學方法 實驗數據采用SPSS 25.0 軟件處理。計量資料符合正態分布以（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 4 組超氧化物陰離子含量比較 與NC＋JG 組比較，Nrf2-KD＋JG 組超氧化物陰離子含量明顯增多（P＜0.05）；與NC＋NS 組比較，NC＋JG 組的超氧化物陰離子含量顯著降低（P＜0.05），Nrf2-KD＋NS 組的明顯增多（P＜0.05）。見圖1。

圖1 4 組超氧化物陰離子含量比較（×400）

3.2 4 組礦化結節數量比較 茜素紅染色后顯微鏡下可見：Nrf2-KD＋JG 組較NC＋JG 組礦化結節數量減少；與NC＋NS 組比較，Nrf2-KD＋NS 組礦化結節數量減少，而NC＋JG 組的卻明顯增多。見圖2。

圖2 4 組礦化結節數量比較（×100）

3.3 4 組Nrf2、核Nrf2、HO-1、RUNX2 蛋白相對表達量比較 Nrf2-KD＋JG 組細胞內Nrf2、核Nrf2、HO-1、RUNX2 蛋白相對表達量較NC＋JG 組減少（P＜0.05）；與NC＋NS 組比較，Nrf2-KD＋NS 組上述指標蛋白相對表達量減少（P＜0.05），而NC＋JG組上述指標蛋白相對表達量則明顯升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 4 組Nrf2、核Nrf2、HO-1、RUNX2 蛋白相對表達量比較

4 討 論

生理狀態下，細胞內Nrf2 與KEAP1 結合，只有少量游離于細胞質內。當細胞內ROS 含量過高，處于氧化應激狀態下，ROS 能夠激活MAPK、PI3K、PKC 信號通路使Nrf2 磷酸化，進入細胞核內與啟動子抗氧化反應元件ARE 結合，啟動HO-1 的轉錄，HO-1 在ROS 升高時大量表達，催化氧化性血紅素降解，生成膽綠素、一氧化碳和鐵離子，在阻止機體氧化應激過程中發揮重要作用，可見Nrf2/HO-1 信號通路是調節氧化應激的關鍵橋梁［13-14］。已有研究發現當敲減成骨細胞中的Nrf2 基因后，細胞內ROS 含量明顯升高，同時成骨細胞分泌的RANKL 表達也明顯升高［15］；Nrf2 基因敲除小鼠明顯出現骨形成速率下降，骨丟失增加［16］；當上調Nrf2 基因表達時，能有效促進成骨細胞分化［17］，同時抑制成骨細胞的凋亡［9］：這提示Nrf2 對成骨細胞骨形成的作用至關重要。本研究結果顯示：在敲減Nrf2 基因后，健骨顆粒含藥血清和生理鹽水血清均不能有效激活細胞內Nrf2/HO-1 信號通路，抗氧化酶HO-1 的表達也出現了明顯下降，不能調節細胞內超氧化物陰離子含量，細胞氧化應激水平升高，骨形成標志蛋白RUNX2 的表達下降，細胞礦化能力下降，骨形成受到抑制。這提示在氧化應激狀態下，調控成骨細胞內Nrf2 含量可調節細胞氧化應激水平，進而影響成骨細胞骨形成的功能。

本實驗結果顯示：氧化應激狀態下NC＋JG 組細胞內Nrf2 蛋白表達量較NC＋NS 組升高，其下游的HO-1 也隨之升高，超氧化物陰離子含量相應減少，礦化結節數量增多且RUNX2 蛋白含量增加。這說明Nrf2/HO-1 信號通路在健骨顆粒含藥血清促進成骨細胞骨形成作用中起到關鍵作用。健骨顆粒含藥血清可通過激活Nrf2/HO-1 信號通路，提高成骨細胞抗氧化能力，降低氧化應激水平，升高骨形成標志蛋白RUNX2 的表達，提升骨礦化能力，促進成骨細胞骨形成，使骨穩態恢復平衡，達到防治PMOP 的目的。