WPI和WPI-EGCG構建姜黃素納米乳液的體外消化差異

李艷新，陳立瑩，李 雁，解新安，李 璐

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）是在乳清蛋白的基礎上加工得到的高純度蛋白質[1-2]，可作為食品的功能性成分，如乳化劑、發泡劑、增稠劑、凝膠劑等[3-6]。WPI中約含有50%的β-乳球蛋白，β-乳球蛋白是一種結構緊湊且高度有序的球狀蛋白[7]，具有兩個二硫鍵和一個游離硫醇基團，會影響蛋白質不可逆的熱聚集和膠凝特性[8]。此外，WPI對溫度、離子濃度、酸堿性等環境條件敏感，易造成WPI溶解度和乳化穩定性降低以及出現膠凝和聚集現象[9-10]。因此可以通過物理或化學改性改變WPI的結構，賦予其新的功能特性，增加其應用價值。

自由基接枝共價修飾是一種有效修飾WPI的方法，可以提供理想的物理化學性質和功能[11-12]。Xu Haoxie等[13]通過自由基接枝將綠原酸、WPI共價偶聯后，增強了WPI的溶解度、乳化活性、發泡性能和抗氧化能力。Pham等[14]研究顯示亞麻籽分離蛋白-酚接枝物的熱穩定性和抗氧化能力均高于亞麻籽分離蛋白。前期實驗[15]通過自由基接枝制備WPI-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG）接枝物，發現其抗氧化性和乳化性得到明顯改善。然而，目前對蛋白質-多酚自由基接枝的研究主要集中在蛋白質結構的改變和功能特性的改善上，在蛋白質-多酚接枝物作為乳化劑穩定納米乳液體系的消化行為變化方面鮮有研究。

不同結構的蛋白乳化劑對乳脂的消化效率有不同的影響。顧璐萍[16]研究發現與蛋清蛋白相比，蛋清蛋白-兒茶素自由基接枝物穩定的乳液游離脂肪酸（free fat acid，FFA）消化率較高；然而Su Yuru等[17]研究表明，小麥膠質蛋白-葡萄籽原花青素穩定的乳液的FFA消化率低于小麥膠質蛋白。這些結果表明，以前對乳化劑特性和消化行為關系的研究仍然存在分歧。因此，有必要對不同接枝度的WPI和WPI-EGCG的FFA消化行為進行深入研究。

姜黃素因具有抗氧化、抗炎、降血脂等多種生理功效而在食品和醫藥領域得到廣泛關注和應用。但姜黃素水溶性較差，人體難以通過口服的方式吸收，從而造成其較低的生物利用度[18-19]。本實驗以姜黃素作為模型營養物，以WPI和不同接枝率的WPI-EGCG為乳化劑構建姜黃素納米乳液，并對其體外消化性能進行研究，為姜黃素在食品領域的功能化應用提供思路和數據基礎。

因此，本實驗旨在探討WPI和不同接枝度的WPIEGCG接枝物之間的消化差異。首先，對接枝前后WPI的結構和界面變化進行表征。然后，使用不同接枝率（3%和4%）的WPI-EGCG接枝物和未改性的WPI作為乳化劑制備負載姜黃素的納米乳液。最后，構建三階段體外消化模型，研究不同姜黃素納米乳液體系在各階段的消化行為，分析WPI-EGCG接枝和接枝度差異對所構建納米乳液體系體外消化的影響及規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI、中鏈甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT）、模擬人工口腔消化液、胃蛋白酶、豬膽鹽、脂肪酶 廣州市齊湘生物技術有限公司；EGCG（HPLC≥90%）、姜黃素（HPLC≥90%）上海源葉生物科技有限責任公司；福林-酚蛋白定量試劑盒北京鼎國昌盛生物技術有限公司；其他化學試劑均為分析純，所有樣品均使用超純水制備。

1.2 儀器與設備

UV-2500紫外分光光度計 德國Spike公司；Chriascan圓二光譜儀 英國Applied Photophysics公司；ZetasizerNano ZS90型激光粒度儀 英國Malvern公司；780 Live型激光共聚焦顯微鏡 德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI-EGCG的接枝合成

將0.5 g WPI與49 mL去離子水混合均勻后，加入1 mL 5 mol/L H2O2溶液以及適量的抗壞血酸。于25 ℃振蕩水浴鍋中2 h。加入0.05 g EGCG，繼續在25 ℃振蕩水浴鍋中24 h。然后將樣品透析72 h（每6 h需更換一次去離子水，透析袋的分子截留量為12～14 kDa），將透析液放入-20 ℃冰箱中冷凍5 h，放入-50 ℃真空冷凍干燥機中冷凍干燥48 h[20]。

1.3.2 WPI-EGCG接枝率測定

采用福林-酚法測定WPI-EGCG的接枝率。將1 mL 1 mg/mL的樣品溶液和2.5 mL 0.2 mol/L福林-酚試劑在室溫下磁力攪拌5 min，加入2 mL 7.5%碳酸鈉溶液避光反應2 h。用UV-2500紫外分光光度計測定760 nm波長處的吸光度。用EGCG標準曲線計算接枝后樣品中EGCG的含量。接枝率是接枝反應中表征產物的關鍵數據之一，其計算公式如下：

式 中：mE為接枝EGCG的質量/g；M為接枝量/（mg/g）（以樣品中EGCG計算）；Pg為接枝率/%；mp和mg分別為接枝前后WPI的質量/g。

1.3.3 酪氨酸基團的測定

參考Hassan[21]的方法，取0.9 mL 1 mg/mL冷凍干燥后的樣品與1 mL 16 mol/L硝酸溶液混合均勻，并在50 ℃水浴中加熱15 min，取出于冰水浴中冷卻，加入4 mL 5 mol/L NaOH溶液和4 mL無水乙醇并混合均勻。用紫外分光光度計測定A360nm和A430nm。酪氨酸含量的計算公式如下：

1.3.4 二級結構相對含量測定

將樣品溶解在pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L）中，于25 ℃使用圓二色光譜儀在持續通氮氣條件下進行測定。樣品池光程為1.0 mm，設置路徑長度1 mm，掃描范圍為190～260 nm，數據間隔為1.0 nm。頻譜是10 次測量的平均值。使用CD Pro軟件計算樣品中二級結構的相對含量。

1.3.5 接枝蛋白的吸附膜厚度測定

參考Liu Yan等[22]的方法稍作修改，采用單分散聚苯乙烯乳膠顆粒作為油滴模型，測定WPI、WPI-EGCG為乳化劑制備的乳液在界面處的吸附膜厚度。用pH 7.0磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）分別配制蛋白質量分數為1.0%的WPI和WPI-EGCG蛋白溶液和0.1%的聚苯乙烯溶液，將蛋白溶液和0.1%聚苯乙烯以9∶1的比例混合，在室溫下靜置60 min，使其均勻分散。使用激光粒度儀在常溫平衡2 min后測定單分散聚苯乙烯的粒徑和蛋白溶液與聚苯乙烯混合溶液的粒徑，根據聚苯乙烯粒徑與具有蛋白質吸附層的聚苯乙烯的粒徑差異計算吸附膜厚度。計算公式如下：

式中：d1為WPI、WPI-EGCG與聚苯乙烯混合物的平均粒徑/nm；d2為聚苯乙烯的平均粒徑/nm。

1.3.6 姜黃素納米乳液的制備

將質量濃度為1 g/100 mL的WPI-EGCG接枝物和WPI溶解于磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），并在25 ℃、100 r/min磁力攪拌4 h后，置于4℃冰箱儲存過夜，得到乳液的連續相。將MCT加熱至60 ℃，加入質量濃度為0.1 g/100 mL的姜黃素，磁力攪拌10 min后得到分散相。然后將連續相與分散相按9∶1的比例混合，磁力攪拌均勻后在高速分散機上以10000 r/min分散5 min制得粗乳液，制得的粗乳液通過高壓均質機在110 MPa條件下循環均質3 次以形成水包油（O/W）納米乳液。

1.3.7 體外模擬消化道的構建

根據人體和動物消化道的構造，構建一個三階段模擬消化道，包括模擬口腔、模擬胃和模擬腸階段，胃腸消化液參考洪澤翰[23]、Salvia-Trujillo[24]等的方法進行配制。

1.3.7.1 模擬口腔消化階段

將新鮮制備的乳液和人工唾液預熱37 ℃后按照1∶1（V/V）混合于燒杯中，用NaOH溶液將混合液調節至pH 6.8，以恒定速率（100 r/min）振蕩反應3 min，以模擬口腔中食物的咀嚼環境。

1.3.7.2 模擬胃消化階段

在37 ℃條件下，取20 mL口腔消化液，與20 mL含有3.2 mg/mL胃蛋白酶的胃液（2 g NaCl和7 mL HCl溶于1 L去離子水中）混合，立即用NaOH調節pH值至2.5，在搖床上振蕩2 h（100 r/min）。胃消化結束之后，取一部分消化后樣品將其pH值調節至7.0，從而終止胃蛋白酶的消化過程。

1.3.7.3 模擬腸消化階段

在37 ℃條件下，取30 mL胃消化液，用NaOH或HCl調節pH值至7.0。然后加入1.5 mL小腸液（5.5 g CaCl2和32.87 g NaCl溶于150 mL去離子水中）和3.5 mL膽鹽（53.57 mg/mL），精準調節pH值至7.0，立即加入2.5 mL脂肪酶懸浮液（24 mg/mL），在37 ℃條件下以恒定速率（100 r/min）振蕩反應2 h。在消化過程中，通過不斷滴定0.25 mol/L的NaOH溶液，使消化液pH值始終保持在7.0。

1.3.8 消化過程中姜黃素乳液的粒徑和Zeta電位測定

采用激光粒度儀測定姜黃素納米乳液在消化過程中的平均粒徑和粒徑分布。將納米乳液用去離子水稀釋200 倍后加入石英比色皿中（約為比色皿的2/3處），設置水的折射率為1.33，油的折射率為1.45，每個樣品平行測定3 次取平均值。

采用激光粒度儀測定姜黃素納米乳液在消化過程中的Zeta電位。將納米乳液用去離子水稀釋200 倍后加入比色皿中，設置水的折射率為1.33，油的折射率為1.45，每個樣品平行測定3 次取平均值。

1.3.9 消化過程中姜黃素乳液的微觀形態觀察

采用激光共聚焦顯微鏡對納米乳液的微觀形態進行觀察。其中采用尼羅紅染油相，采用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）染水相。分析前，移取3 個消化階段的樣品于試管中，然后分別加入1 mg/mL的尼羅紅溶液和1 mg/mL的FITC（樣品和染液的比例為20∶1）。將樣品放置于激光共聚焦顯微鏡載物臺上，尼羅紅的激發和發射波長分別為543 nm和605 nm，FITC的激發和發射波長分別為488 nm和515 nm。根據觀察到的視圖對油鏡和目鏡進行調整，記錄最清晰的目鏡和物鏡倍數，拍下納米乳液的顯微鏡視圖。

1.3.10 FFA釋放率的測定

在腸消化中，脂肪酶將乳液體系的油滴不斷分解成FFA，導致體系pH值下降。因此利用NaOH溶液中和產生的FFA，以維持體系pH值的穩定。根據消耗的NaOH的體積，按照下式計算姜黃素納米乳液體系中FFA釋放率：

式中：VNaOH為產生FFA所消耗的NaOH溶液的體積/mL；cNaOH為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；Mlipid為MCT油脂的平均摩爾質量/（g/mol）；mlipid為最初存于納米乳液中MCT的質量/g。

1.3.11 乳液中姜黃素生物可及性的測定

將小腸消化液在4 ℃、4000×g離心40 min，收集上清液，置于紫外分光光度計下測定姜黃素的吸光度，測定波長為425 nm。根據標準曲線計算姜黃素的質量濃度。按下式計算姜黃素生物可及性：

式中：ρ1為納米乳液中姜黃素的質量濃度/（μg/mL）；ρ2為膠束中姜黃素的質量濃度/（μg/mL）。

1.4 統計分析

所有實驗均進行3 組平行實驗，使用Origin 2018軟件計算標準差并作圖，使用SPSS 10.0軟件對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 WPI接枝前后的結構變化

2.1.1 二級結構和酪氨酸含量的變化

用圓二光譜儀和紫外分光光度計分別研究接枝前后WPI的二級結構和酪氨酸含量的變化，結果見表1。與未修飾的WPI相比，接枝后WPI-EGCG的α-螺旋相對含量下降到19.9%，β-片狀相對含量上升到42.6%，說明與EGCG的結合可能導致WPI分子結構的部分擴展[25-26]。酪氨酸含量的減少是由于多酚與蛋白質中的酪氨酸有更強的相互作用，與更多的疏水氨基酸結合，表明更多的疏水殘基暴露在外界環境中或在EGCG的作用下轉移到親水環境[27]。

表1 WPI接枝前后二級結構和酪氨酸含量的變化Table 1 Changes in secondary structure and tyrosine content of WPI before and after grafting with EGCG

2.1.2 界面蛋白吸附量的變化

蛋白質具有兩親性，當蛋白質吸附在油滴表面時，可以降低界面張力，形成高強度具有黏彈性的膜，從而防止油滴結塊或絮凝[28-29]。蛋白質的界面吸附量越高，界面膜越厚，說明蛋白質對油水界面的吸附能力越強，作為乳化劑構建乳液體系時可以形成更穩定的界面結構。如圖1A所示，WPI-EGCG的界面吸附膜厚度為127.6 nm，明顯大于WPI的界面吸附膜厚度（96.0 nm），增加了31.6 nm。這可能是由于EGCG改變了蛋白質的二級結構，使其向無序方向展開，從而使分子在油水界面迅速吸附，并緊密地相互作用，形成較厚的乳化層。圖1B是WPI和WPI-EGCG乳化劑吸附在油水界面上形成的界面層的示意圖。

圖1 WPI和WPI-EGCG作為乳化劑制備乳液的激光共聚焦顯微鏡圖（A）和界面示意圖（B）Fig.1 Laser confocal microscopy images (A) and schematic diagrams of the interface (B) of WPI and WPI-EGCG stabilized emulsion

2.2 體外消化實驗結果

上述結果表明，WPI接枝EGCG后的分子結構和界面性質發生了變化，這可能會影響以WPI-EGCG為乳化劑的納米乳液的消化率。因此通過構建體外模擬消化模型，探討乳劑在不同消化階段的粒徑、勢能、微觀結構和脂肪酸釋放情況。

2.2.1 消化階段納米乳液粒徑變化

從圖2A～C可以看出，在初始階段，3% WPI-EGCG和4% WPI-EGCG乳液的粒徑呈單峰分布（多分散指數分別為0.034和0.040），而WPI乳液在5000 nm處還有1 個小峰（多分散指數為0.23），說明WPI穩定乳液的粒徑分散較大。表明自由基接枝物能發揮較好的乳化活性，能夠快速吸附至油水界面并形成穩定的乳液。

圖2 3 種乳化劑穩定的納米乳液在不同消化階段的粒徑分布（A～ C）和平均粒徑（D）Fig.2 Particle size distribution (A–C) and average particle size (D) of nanoemulsions stabilized with three emulsifiers at different stages of digestion

圖2D顯示，在不同的消化階段，WPI-EGCG穩定的納米乳液液滴尺寸更小，可能原因是EGCG與WPI的共價結合破壞蛋白質二級結構，導致WPI去折疊和內部疏水氨基酸的暴露，提高了表面活性，從而有利于WPI快速吸附至油水界面[30]。

2.2.2 消化階段納米乳液Zeta電位變化

圖3顯示，WPI以及WPI-EGCG納米乳液在消化前的Zeta電位絕對值均大于30 mV，因此這3 種納米乳劑都具有抗絮凝能力[31]。由于WPI或WPI-EGCG接枝物在油水界面的吸附，乳化液滴之間發生了強烈的靜電排斥現象，從而使納米乳劑具有良好的物理穩定性[23]。然而，由兩種接枝物穩定的納米乳液比單獨由WPI穩定的納米乳液具有更高的負電位（P＜0.05），原因可能是接枝物在液滴表面形成更厚的蛋白吸附層，進一步增加了乳液液滴之間的靜電排斥，從而抑制液滴之間的聚集，提高乳液的物理穩定性。此外，Zeta電位隨著WPI-EGCG接枝率的增加而降低，這是因為具有較大接枝率的WPI能夠形成更加堅硬和致密的表面結構，減緩胃蛋白酶對乳化劑的消化[32]。

圖3 WPI、3% WPI-EGCG和4% WPI-EGCG納米乳液在不同模擬消化階段的Zeta電位變化Fig.3 Changes in zeta potential of WPI,3% WPI-EGCG and 4% WPI-EGCG stabilized nanoemulsions at different stages of simulated digestion

2.2.3 消化過程中納米乳液微觀結構分析

如圖4所示，在消化前不同納米乳液樣品的液滴呈現均勻分布，未觀察到乳液聚集現象，說明姜黃素可以有效地包裹在3 種納米乳液中。進入口腔消化后，大多數油滴在口腔條件下仍然保持穩定。經過胃液消化后，所有樣品的微觀結構都有明顯的變化，3 種納米乳液中小油滴消失，出現許多由大油滴形成的絮狀物。此外，3%、4% WPI-EGCG接枝物穩定納米乳液中的絮凝相對小于WPI穩定納米乳液，且分布較均勻，證實了粒徑分布結果，表明接枝物制備的納米乳液更加穩定。Quan等[33]研究結果也表明鴨蛋白水解物-EGCG共軛物有效地生成了尺寸較小的乳液或阻止了液滴的聚結。圖4顯示，大部分乳滴在小腸階段已被消化，還有一些個別粒徑較大的乳滴，這可能是由于脂肪酶消化油相，并將脂質消化產物并入混合膠束和囊泡中，從而產生較大的油滴。

圖4 WPI、3% WPI-EGCG和4% WPI-EGCG納米乳液模擬消化時的激光共聚焦顯微鏡圖像Fig.4 CLSM images of WPI,3% WPI-EGCG and 4% WPI-EGCG stabilized nanoemulsion at different stages of simulated digestion

2.2.4 納米乳液中脂肪釋放分析

如圖5所示，WPI、3% WPI-EGCG和4% WPI-EGCG制備的納米乳液體系遵循相似的脂肪消化規律，在前20 min FFA的釋放率快速增加，20 min后，釋放趨于平緩直到達到相對恒定的最終值。出現這一種情況主要是因為，脂肪酶在消化的前20 min水解三酰基甘油，三酰基甘油幾乎被水解后，FFA釋放變得緩慢[34]。比較3 種乳化劑制備的姜黃素納米乳液的FFA釋放量，WPI-EGCG接枝物穩定的納米乳液中脂肪消化速率稍快一些，這是因為脂肪消化速率與乳液的粒徑大小密切相關。經WPIEGCG接枝物穩定的納米乳液，由于平均粒徑較小，在胃液中油滴簇也較小，油滴的比表面積較大，更有利于脂肪酶的分解[35]。此外，3% WPI-EGCG和4% WPI-EGCG制備的納米乳液在消化120 min后，最終的FFA釋放率分別為80.68%和85.13%，表明自由基接枝的程度越高，越能更好地促進脂質消化。

圖5 不同納米乳液在模擬腸消化過程FFA釋放率Fig.5 Release rates of FFA from different nanoemulsions during simulated intestinal digestion

2.2.5 姜黃素的生物可及性

通過測量消化結束產生的膠束相中姜黃素含量，可得到姜黃素的生物可及性。由圖6可知，WPI、3% WPIEGCG和4% WPI-EGCG制備的姜黃素納米乳液的生物可及性分別為19.18%、20.04%和21.53%，該結果與乳液在模擬腸消化階段FFA的最終釋放量有相同的趨勢。這表明WPI與EGCG共價結合提高姜黃素的生物可及性，且隨接枝率的增加而增加。這可能是因為WPI-EGCG作為乳化劑被吸附在油水界面上，形成較厚的界面蛋白膜，有效地保護了姜黃素。FFA釋放量越高，姜黃素的生物可及性也越高，是因為隨著脂肪酶水解增加，更多脂肪消化產物形成膠束，姜黃素從油滴中釋放出來，從而提高了姜黃素在膠束相中的溶解度。之前研究也表明，乳液中營養素的生物可及性與脂肪分解程度呈正相關[36]。

圖6 不同納米乳液的姜黃素生物可及性Fig.6 Bioaccessibility of curcumin in different nanoemulsion samples

3 結論

研究發現，乳化劑的結構和類型與消化率有一定的相關性。EGCG的結合展開了WPI的二級結構，增加了所制備乳液的界面膜厚度，導致接枝后的WPI具有較小的液滴尺寸和較高的負電位，從而抑制液滴之間的聚集，提高乳液的物理穩定性。相比WPI制備的納米乳液，采用自由基接枝物制備的納米乳液有效改善了油脂的消化，提高了體系所包埋的姜黃素生物可及性，且以接枝率為4%的WPI-EGCG接枝物為乳化劑構建的納米乳液中，姜黃素營養物的生物可及性高于接枝率為3%的乳液體系。因此，WPI-EGCG可作為乳化劑用于調節脂肪消化和脂肪釋放，以及促進姜黃素的穩定性和生物可及性。