基于低共熔溶劑的分散液液微萃取法測定茶飲料中68種農藥殘留

王華威 陳文輝 陳升凡 李倩倩 杜麗平 葉 豐李建勛 李 熠

（1中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193； 2天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

茶是世界上最受歡迎的三種非酒精類飲料之一［1］，它擁有眾多健康益處，能預防神經系統疾病和心血管疾病［2-3］。隨著生活方式和社會環境的變化，人們對即飲茶的需求不斷增長，大幅度促進了茶飲料的發展。2021 年，全球茶飲料市場規模為443 億美元［4］。在有大需求量的同時，茶飲料飲用安全問題也不可忽視。在茶葉種植過程中，為減少病蟲害及提高茶葉產量，種植者會施用農藥或其他農化產品，過量或不當施用往往會導致農藥殘留或飲用安全問題，威脅人類身體健康。因此，對茶飲料中的農藥殘留進行監測十分必要。

目前常用的樣品前處理技術主要有QuEChERS（快速、簡單、低廉、有效、穩定和安全）［5-6］、固相萃取（solid phase extraction，SPE）［7-8］、固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）［9］和液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）［10-11］。為了有更高靈敏度和痕量化，國內外不斷投入研究，以發展新型萃取技術［12］。2006年，Rezaee等［13］首次提出了分散液液微萃取技術（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME），并成功將其用于萃取水中的有機氯和有機磷農藥。DLLME 因具有操作簡單、快速、有機試劑用量少、成本低、回收率高優勢而備受關注，該技術已廣泛應用于茶葉、果蔬、茶飲料、果汁等食品中農藥的提取。然而，使用含氯的高毒性有機溶劑（如C2Cl4、CCl4）作為萃取溶劑會增加試驗人員中毒風險與環境污染負擔。盡管基于離子液體（ionic liquid，IL）的DLLME 比基于有機溶劑的DLLME具有顯著的生態友好優勢［14］，但IL 的缺點同樣不可忽視，如復雜的合成過程、較高的價格和潛在的毒性。因此，尋找低成本、無毒、綠色環保的溶劑是DLLME 開發和應用中的重要任務。

低共熔溶劑（deep eutectic solvent，DES）是一種新型的環保溶劑，由氫鍵供體（hydrogen bond donor，HBD）和氫鍵受體（hydrogen bond acceptor，HBA）組成，熔點極低，其遠低于各單一組分的熔點［15-16］。常用加熱攪拌法合成DES，還有真空蒸發法和冷凍干燥法等。DES制備簡單，成本低，且具有可降解和生物相容性好等特有性能［17-19］，成為近些年來研究的熱點，已被廣泛應用于植物中有效成分的提取［20］。

本研究使用的綠色低共熔溶劑以氯化膽堿（choline chloride，ChCl，無毒害）為氫鍵受體，六氟異丙醇（hexafluoroi-sopropanol，HFIP）為氫鍵供體。以該DES為萃取劑，利用DLLME法對茶飲料中的農藥進行萃取，結合高效液相質譜-串聯質譜（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）進行檢測，并全面優化前處理條件和分析方法。旨在為茶飲料食用與進出口安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15 種茶飲料包括康師傅（茉莉清茶、冰紅茶、綠茶、茉莉蜜茶）、統一（冰紅茶、綠茶）、三得利（烏龍茶）、東方樹葉（紅茶、青柑普洱、綠茶、茉莉花茶）、茶π（柚子綠茶、檸檬紅茶、蜜桃烏龍茶、青提烏龍茶）；乙腈、甲醇（純度99.9%，色譜純），賽默飛世爾科技（中國上海）有限公司；甲酸（純度99.5%，分析純），北京市通廣精細化工有限公司；氯化膽堿（ChCl，純度98%）、六氟異丙醇（HFIP，純度99.5%），北京索萊寶科技有限公司；68種農藥標準品（純度≥95%），上海泰坦科技股份有限公司；ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱，美國沃特世公司。

本研究選取統一牌綠茶飲料作為代表樣品進行方法優化和驗證，參考GB/T 23200.13-2016《食品安全國家標準 茶葉中448種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-質譜法》［21］以及歐盟、國際法典委員會制定的茶葉中農藥最大殘留限量值（maximum residue limits，MRLs），并通過前期研究基礎和調研文獻，將檢出率較高、不合格率高的部分農藥匯總，最終選取茶葉中68種農藥殘留進行測定。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290-6495 高效液相色譜三重四極桿質譜聯用儀，美國Agilent 公司；HMS-901磁力攪拌器，深圳市博大精科技實業有限公司；Milli-Q Synergy 超純水系統，美國Millipore 公司；TG18.5 臺式高速離心機，長沙綜儀生物科技有限公司；MS200多管渦旋混勻儀，杭州瑞誠儀器有限公司；Vortex-Genie2 渦旋振蕩器，美國Scientific Industries（SI）公司；XPR303SN/AC 電子天平，梅特勒托利多科技（中國上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 制配標準溶液 將每種農藥標準物質用甲醇稀釋成100 mg·L-1的標準儲備液，避光-20 ℃保存。將每種標準儲備液精確量取至同一個10.00 mL 容量瓶中，甲醇定容，獲得1 mg·L-1的混合標準溶液，避光保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 樣品前處理 以綠茶飲料為基質，取適量體積于4 ℃下保存。

1.3.3 DES的制備 如圖1所示，其中ChCl為氫鍵受體，HFIP 為氫鍵供體。根據物質的量比1∶2（ChCl∶HFIP）來稱量，將其與磁轉子一起放入10.00 mL 圓底燒瓶中，后放于磁力攪拌器上，經80 ℃恒溫水浴加熱后，形成透明均一的液體，將其密封保存，放置在-20 ℃下保存。經過24 h 的觀察，如DES 無絮狀沉淀和凝膠現象且保持澄清透明，則表明DES 能夠使用［22］。

圖1 DES合成路線Fig.1 DES synthesis route

1.3.4 DLLME 步驟 精確吸取5.0 mL 茶飲料置于15.00 mL 離心管中，加入200 μL DES、1.6 mL 乙腈。將混合溶液進行渦旋2 min，隨后在6 000 r·min-1的轉速下離心6 min，水相位于上層，DES相位于底層。去除上層水相后，下層DES相過0.22 μm濾膜，后進樣分析。

1.3.5 色譜條件 柱溫35 ℃，流速為0.3 mL·min-1，進樣量5.0 μL。以0.1%的甲酸-水溶液作為流動相A，以乙腈作為流動相B，采用梯度洗脫方法，程序見表1。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution procedure

1.3.6 質譜條件 采用電噴霧離子源（electrospray ionisation source，ESI）；掃描模式：動態多反應監測模式（dynamic multi-response monitoring model，DMRM）；噴嘴電壓2 000 V；離子源溫度280 ℃；干燥氣流速12 L·min-1；霧化器壓力206.85 kPa；鞘氣溫度350 ℃，流速10 L·min-1。表2為68種農藥的質譜參數。

表2 68種農藥的質譜參數Table 2 Mass spectral parameters of 68 pesticides

1.4 數據處理

通過MassHunter workstation B.07.00 提取保留時間和色譜峰面積，以及重復測定的試驗結果的回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。使用Excel 2019 軟件處理數據，使用Origin 8.0 制圖軟件繪制譜圖及圖表。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化結果

為優化質譜參數，將100 μg·L-1的單一標準溶液作為對照品，首先，在電噴霧離子源正離子電離（electrospray ionization+，ESI+）下進行全掃描，獲得響應較高的母離子信息；其次，進行子離子掃描，選擇兩個豐度較高的特征碎片離子，并在DMRM 模式下優化碰撞能，確定最佳質譜參數信息，參數詳見表2。

2.2 前處理方法優化結果

2.2.1 離子強度 溶液中離子強度會因為NaCl等無機鹽的鹽析作用而改變，從而減小目標物在水相中的溶解度，促使其轉入萃取相中，提高萃取率［23］。試驗選取的NaCl添加梯度為0、0.02、0.05、0.08、0.01 g·mL-1。結果顯示（圖2），NaCl 添加濃度對茶飲料基質中農藥回收率的影響不明顯；不添加NaCl 時，平均回收率處于最大值；當添加濃度為0.02～0.08 g·mL-1時，平均回收率無明顯變化，但0.1 g·mL-1添加濃度時的平均回收率明顯降低，可能是離子強度增大后，降低了溶液的傳質效率，最終導致萃取效果降低。因此，本試驗選擇不添加NaCl。

圖2 離子強度的影響Fig.2 Effect of ionic strength

2.2.2 萃取劑體積 針對ChCl-HFIP 體積進行優化，選取DES 體積為100、150、200、250、300、350、400 μL。結果如圖3 所示，隨著萃取劑體積增加，各類農藥回收率均保持先上升后下降的趨勢。當萃取劑DES 用量為100 μL 時，其在待測液中體積過小，在乳化劑作用下也無法形成DES 相；當DES 用量為150～200 μL 時，萃取效果較佳，各類農藥的平均回收率均大于70%，DES 用量為200 μL 時，回收率達最大值；當萃取劑用量高于200 μL 時，回收率均明顯下降。因此，萃取劑DES最佳選用量為200 μL。

圖3 萃取劑用量的影響Fig.3 Effects of extractant volume

2.2.3 乳化劑體積 在待測液中加入適量乳化劑可誘導DES 的快速生成并富集于樣品溶液底部，有利于DES相的回收。本試驗選擇乙腈作為乳化劑，考察用量1.0、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0 mL 對回收率的影響。結果表明（圖4），萃取效果隨著乙腈用量增加而先增大后降低，當添加量為1.6 mL 時，平均回收率達到最大值。因此，后續試驗選擇添加乳化劑體積為1.6 mL。

圖4 乳化劑用量的影響Fig.4 Effects of emulsifier volume

2.2.4 渦旋時間與超聲時間 本研究針對渦旋時間10、30、60、120、180、240 s進行優化。結果如圖5所示，在渦旋時間10～120 s 范圍內，各類農藥回收率隨渦旋時間的延長呈上升趨勢，在120 s 時回收率達到極值；渦旋時間超過120 s 后，回收率無明顯變化，因此選擇120 s為最佳渦旋時間。進一步優化超聲時間（0、3、5、10、15、20 min），結果如圖5 所示，不超聲時，各農藥殘留的萃取效果最佳；超聲時間在1～10 min 范圍時，各類農藥回收率變化不明顯；萃取時間超過10 min后，各類農藥回收率明顯下降，可能是超聲時間過長導致部分農殘降解［24］。因此，在前處理中不選擇超聲步驟。

圖5 渦旋時間、超聲時間的影響Fig.5 Effect of vortex time and ultrasonic time

2.3 基質效應評價

基質效應（matrix effect，ME）是指非待測物對目標物濃度的影響，普遍存在于茶葉及茶飲料農殘檢測，會對檢測結果造成影響，普遍是制作基質匹配標準曲線對農藥殘留檢測的基質效應進行校正［25］。本研究采用基質加標法評估基質效應。制得100 μg·mL-1的茶飲料基質匹配標準溶液，與對應的標準溶液峰面積進行對比得到每種農藥的基質效應。根據公式［26］計算基質效應：

68 種農藥在茶飲料基質中的基質效應結果如圖6所示，ME值范圍為-47.5%～33.2%，負值居多，說明基質抑制效應更明顯。本試驗利用茶飲料基質匹配標準曲線來減少基質效應對農藥殘留定量結果的影響。

圖6 68種農藥在液體基質的基質效應Fig.6 Matrix effects of 68 pesticides in tea beverage matrices

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍和定量限 由表3 可知，多數農藥在1～500 或10～500 μg·L-1濃度范圍線性關系良好，個別農藥化合物線性范圍較小，如樂果、異丙隆等，相關系數（r2）皆大于0.995，定量下限（lower limit of quantification，LOQ）選擇信噪比為10 的定量離子對色譜峰，本方法的定量限為0.2～10.0 μg·kg-1。

表3 68種農藥線性關系、定量限、基質效應與方法的精密度Table 3 The linearity，limit of quantification，matrix effects and method precision of 68 pesticides

2.4.2 準確度與精密度 各農藥回收率和相對標準偏差由加標回收試驗得到。在3 個加標水平（10、50、100 μg·kg-1）下68 種農藥的平均回收率分別為59.1%～103.6%、67.3%～105.4%和70.5%～113.7%，RSD 均小于10.0%，結果重現性好，符合檢測要求。

2.5 實際樣品測定

為驗證上述前處理方法的適用性，對15 種常見市售的茶飲料（統一、康師傅、東方茶葉、茶π 等）進行農藥殘留檢測。共檢出5 種農藥，結果如表4 所示，通過與歐盟委員會（EC）和中國國家標準GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》［27］發布的MRLs標準對比，均未發現超標現象。

表4 15種市售茶飲料實際樣品檢測結果Table 4 The actual sample detection results of 15 kinds of marketing tea beverage

3 討論

本研究基于DES 的分散液液微萃取前處理方法，結合HPLC-MS/MS 測定了茶飲料中的68種農藥殘留，與傳統方法相比具有一定優勢。

傅強等［28］采用固相萃取技術測定茶飲料中5種農殘含量，使用乙腈提取并經過Florisil柱凈化，氮吹復溶后進行氣相色譜串聯質譜儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，該方法預處理時間較長，而本研究極大縮短了預處理時長，30 min 以內即可完成預處理操作。聶宏騫等［29］使用分散液液微萃取結合氣相色譜-三重四級桿質譜法（gas chromatography-triple quadruple mass spectrometry，GC-MS/MS）測定茶飲料中的5 種農藥殘留時，采用了具有揮發性和較強毒性的四氯甲烷，會威脅試驗員和環境安全，而本研究采用DES 作為萃取劑，無毒性，是一種綠色環保的前處理方法。

宋寧慧等［30］采用固相萃取技術結合GC-MS 測定12種擬除蟲菊酯類農殘，用20 mL乙酸乙酯萃取3次并通過固相萃取凈化，得到12 種農藥回收率為71.8%～104.2%，但該方法有機試劑使用量較大，步驟也較為繁瑣。

本研究采用DES 作為萃取劑，結合HPLC-MS/MS對茶飲料中的68 種農殘含量進行檢測，通過前處理優化試驗，包括離子強度、萃取劑體積、乳化劑體積、渦旋時間和超聲時間等，獲得最佳前處理條件，通過方法學考察，得到68種農藥平均加標回收率為59.1%～113.7%，符合農殘檢測要求，在預處理時長、有機試劑的使用量、環保等方面上較上述方法均有較大優勢。

但本研究也存在基質效應問題，因此后續可比較研究不同種類低共熔溶劑對茶飲料中農藥多殘留的萃取效果，以降低基質效應，進一步降低農藥殘留的檢出限，為茶飲料的相關檢測技術提供更加新穎的預處理方法。

4 結論

本研究建立了一種DLLME-HPLC-MS/MS 測定茶飲料中68 種農藥殘留的方法，以綠色環保的DES（ChCl-HFIP）為萃取劑，并以乙腈為乳化劑。全面優化前處理條件后，回收率最優組合為：ChCl 與HFIP 的物質的量配比為1∶2，添加200 μL DES、1.6 mL 乙腈，再進行2 min 渦旋震蕩。此方法快捷且靈敏，LOQ 為0.2～10.0 μg·kg-1，回收率高、綠色環保且成本低，可作為一種全新并快速有效的技術手段應用于茶飲料中農藥多殘留的檢測。