不同產地半夏藥材HPLC特征圖譜的建立

吳建明 華 杰 丁京偉 朱 婷 葉志學

浙江維康藥業股份有限公司，浙江 麗水 323000

半夏(Pinelliae Rhizoma)為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖。夏、秋二季采挖，洗凈，除去外皮和須根，曬干。具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效。用于濕痰寒痰、咳喘痰多、痰飲眩悸、風痰眩暈、痰厥頭痛、嘔吐反胃、胸脘痞悶、梅核氣；外治癰腫痰核[1]。現代學者[2-5]已從半夏中分離得到多種類型化學成分，其中具有生物活性的成分主要包括生物堿類、有機酸類、揮發油類、黃酮類、甾體類和糖類等?，F代藥理研究[2，6-8]表明，半夏除對呼吸系統、消化系統、循環系統有不同程度的影響外，還具有抗腫瘤、抗早孕、鎮痛、鎮靜和催眠的作用。

半夏產地全國分布較多，直到民國除山東外，半夏似未真正形成大宗的道地產區，民國時期半夏以湖北荊州，浙江富陽、衢州、嚴州等為道地產地，現代產地較多，半夏大規模人工栽培，湖北、甘肅、四川、貴州、云南、安徽、河北、河南、湖南等省均有大面積種植，以湖北潛江、天門、京山、江陵、襄陽、鐘祥等地產半夏質量較佳[9-10]。

中藥指紋圖譜是目前中藥產品質量控制主要手段之一，可更全面地反映中藥產品整體特征[11]，目前指紋圖譜研究常用高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法等[12]。2020年版《中國藥典》半夏藥材標準中控制的質量屬性有性狀、鑒別、檢查、浸出物定等，缺乏整體控制手段，故擬對其關鍵質量屬性主要化學成分(指紋圖譜)控制進行相關試驗研究。本試驗收集了不同產地的半夏藥材，探索采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器對其進行專屬性鑒別，再分別對色譜條件及供試品溶液制備方法進行考察，建立了半夏藥材HPLC指紋圖譜，為更好地控制半夏藥材質量提供了可靠的方法依據。

1 材料與儀器

1.1 材料 鳥苷對照品(批號：PS010291，成都普思生物科技股份有限公司)；腺苷對照品(批號：PS001227，成都普思生物科技股份有限公司)；夏佛塔苷對照品(批號：PS000955，成都普思生物科技股份有限公司)。半夏藥材(J20021701、山東省菏澤市鄆城縣；J20021702、山東省菏澤市鄆城縣；J20022002、湖北荊門市京山縣；J20030301、甘肅省隴南市西和縣；J20030901、甘肅省隴南市西和縣；J20031001、甘肅省隴南市西和縣；J20032001、甘肅省隴南市西和縣；J20032002、甘肅省隴南市西和縣；J20032501、貴州省畢節市赫章縣；J20033001、四川省南充市南部縣；J20033002、四川省南充市南部縣；J20040701、湖北省荊門市鐘祥縣；J20040801、甘肅省隴南市西和縣；J20062801、湖北荊門市京山縣；J20062802、湖北荊門市京山縣；J20081201、甘肅省隴南市西和縣；J20081202、甘肅省隴南市西和縣)，均購自浙江惠松制藥有限公司)。甲醇【色譜純，批號：186347，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)】；乙醇(分析純，批號：20191011)、甲醇(分析純，批號：20190912)、甲酸(分析純，批號：1801089)、磷酸(分析純，批號：20191015)，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 取鳥苷、腺苷、夏佛塔苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度分別為0.02 mg/mL的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取半夏藥材適量粉碎，過四號篩(65目)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率900 W，頻率60 kHz)，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，離心，取上清液濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件與系統適用性試驗 SVEA C18Opal 型色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇為流動相A，以水為流動相B，按表1進行梯度洗脫；柱溫為30 ℃；流速為0.9 mL/min；檢測波長為270 nm。

表1 半夏藥材HPLC特征圖譜梯度洗脫表

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 取空白(甲醇)、鳥苷、腺苷、夏佛塔苷、半夏藥材J20032002，按“2.2”“2.3”項下方法制備對照品溶液和供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件進樣檢測分析。結果如圖1所示。結果表明，空白溶劑未在供試品色譜相應位置出峰，供試品色譜中含有與鳥苷、腺苷、夏佛塔苷對照品保留時間且紫外吸收光譜一致的峰(詳見表2)，說明該方法專屬性良好。

從下至上依次為：空白(甲醇)、鳥苷、腺苷、夏佛塔苷、半夏藥材J20032002供試品

表2 對照品與半夏藥材供試品紫外圖譜吸收

2.4.2 精密度試驗 取半夏藥材J20032002，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件連續進樣5針，每次進樣10 μL，將得到5針指紋圖譜以AIA格式依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》計算軟件進行分析，參數設置為：以試驗第一個樣色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數，時間窗0.1；多點校正；全峰匹配，計算相似度結果，并對指紋圖譜中10個明顯特征峰進行標記，計算9個標記峰與標記S峰(鳥苷)的相對保留時間及相對峰面積。如圖2所示。

從下至上依次為：精密度1、精密度2、精密度3、精密度4、精密度5

結果表明，連續進樣的5針供試品溶液指紋圖譜相似度均大于0.99，各供試品溶液與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，各特征峰的峰相對保留時間RSD均小于1.0%，除峰9外，各特征峰相對峰面積小于10.0%，其中峰9由于受基線噪音影響，導致其相對峰面積RSD較大。綜合分析，該方法儀器精密度良好。

在對企業工程領域法律風險源進行全面摸排調查，并分析評估內外部法律環境基礎上，形成了全面覆蓋工程各環節的法律風險防控模式，法律風險防范工作實現了由事后救濟型向事先預防、過程控制型轉變。其基本內涵是：通過組織機制建設，構建工程法律風險管理體制；通過點線面的聯動機制和流程再造，實現法律風險防控程序化；通過法律風險防控與基層業務的融合、多重管理機制管理手段相結合，構建全面風險管理體系，實現法律風險防控同制度創新、技術創新的融合。為構建工程法律風險全過程全方位防控模式，企業的主要做法是：

2.4.3 重復性試驗 取半夏藥材J20032002，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件各進樣10 μL，將得到的指紋圖譜以AIA格式依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》計算軟件進行分析，參數設置為：以試驗第一個樣色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數，時間窗0.1；多點校正；全峰匹配，計算相似度結果，計算9個標記峰與標記S峰(鳥苷)的相對保留時間及相對峰面積。如圖3所示。

從下至上依次為重復性1、重復性2、重復性3、重復性4、重復性5、重復性6

結果表明，6個供試品呈現出的色譜相似度均大于0.99，各供試品溶液與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，各特征峰(同精密度項下)相對保留時間RSD均小于1.0%；除峰9外，其余各特征峰相對峰面積小于10.0%，其中峰9由于受基線噪音影響，導致其相對峰面積RSD較大。綜合分析，該方法重復性良好。

2.4.4 溶液穩定性試驗 取半夏藥材J20032002，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h按照“2.4”項下色譜條件各進樣10 μL進樣檢測，將得到的指紋圖譜以AIA格式依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》計算軟件進行分析，參數設置為：以0 h色譜圖為參照圖譜，生成方法中位數，時間窗0.1；多點校正；全峰匹配，計算相似度結果，計算9個標記峰與標記S峰(鳥苷)的相對保留時間及相對峰面積。如圖4所示。

從下至上依次為：0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h

結果表明，不同時間點測得的色譜相似度均大于0.99，各時間點供試品溶液與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，各特征峰(同精密度項下)相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD均小于10.0%，該供試品溶液在常溫放置8 h內穩定性良好。

2.5 指紋圖譜的差異分析 按照“2.4”項下色譜條件，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，對17批半夏藥材供試品溶液進行指紋圖譜檢測，將得到的指紋圖譜以AIA格式依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》計算軟件進行分析，參數設置為：數據剪切0～5 min以及 45 min，以S1(J20021701)為參照圖譜，生成方法中位數，時間窗0.1；多點校正11個峰；全峰匹配，計算相似度結果，生成對照指紋圖譜如圖5。比較各批次樣品指紋圖譜的相似度、共有峰相對峰面積等差異，評價不同批間樣品的質量差異。

圖5 17批半夏藥材特征圖譜

S1-S17依次為J20021701、J20021702、J20022002、J20030301、J20030901、J20031001、J20032001、J20032002、J20032501、J20033001、J20033002、J20040701、J20040801、J20062801、J20062802、J20081201、J20081202

相似度結果顯示，17批半夏藥材之間相似度在0.715～1.000之間，17批藥材分別與擬合的對照指紋圖譜的相似度結果在0.869～0.990范圍內。

選擇占總峰面相對較大(占總峰面積2%)、響應值較高、分離度較好的共有峰作為特征峰，經評估，半夏藥材對照指紋圖譜中不低于總峰面積2%共有色譜峰有9個，分別為共有峰2、3、4、5、6、8、9、10、11，并以這9個共有峰作為特征峰，統計各特征峰的相對保留時間與峰面積。結果如圖6所示，見表3～5。

表3 對照指紋圖譜共有峰占總峰面積比例

表4 特征峰相對保留時間

表5 特征峰相對峰面積

3 討論

不同來源的半夏藥材由于受產地、種植、采收、貯藏等影響致使其所含的有效成分的含量具有一定的差別，從而影響了臨床療效[13]。指紋圖譜能夠反映出待測樣品的整體性、特征性，通過建立指紋圖譜，對半夏藥材中多種有效成分進行控制，保證藥材質量均一性和穩定性。

首先根據半夏化學成分組成、處方藥味的制備方法選擇高效液相色譜-二極管陣列檢測器，再分別對色譜條件及供試品溶液制備方法進行考察，初步確定指紋圖譜研究用色譜條件。

3.1 供試品溶液制備方法選擇 以色譜峰個數、整體分布呈現等為指標，采用超聲處理30 min的方式，對供試品溶液提取溶媒進行了研究。先對比70%乙醇、95%乙醇、甲醇、水超聲提取所得色譜峰差異進行判斷，再根據結果考察20%甲醇、50%甲醇、水超聲提取所得指紋圖譜。結果表明，在同一洗脫條件下，以水為提取溶媒時，指紋圖譜色譜峰個數、整體分布及部分峰分離情況更好，故選擇水作為提取溶媒。

3.2 檢測波長確定 結合確定的方法所測半夏指紋圖譜的3D圖(時間-波長-響應值)分析可知，230～290 nm波長呈現的色譜峰相對較多，對比不同波長下指紋圖譜可知，270 nm波長下呈現的色譜峰響應值更高，各峰分布較為均勻，整體譜圖呈現良好，故選擇270 nm為半夏指紋圖譜檢測波長。

3.3 流動相的考察研究 通過查閱大量半夏藥材高效液相色譜指紋圖譜方法研究，初步以甲醇-水為流動相，并且對比“甲醇-水”與“甲醇-0.1%甲酸”“甲醇-0.1%磷酸”分別作為流動相體系時半夏指紋圖譜呈現情況。結果顯示，不同流動相體系，色譜峰個數及響應值均存在差異，其中以甲醇-水為流動相時洗脫出的色譜峰信息更多且部分色譜峰分離度更好，故暫選“甲醇-水”作為半夏指紋圖譜流動相體系。以“甲醇-水”流動相體系進行洗脫程序的優化，最終確定流動相為以甲醇為流動相A，以水為流動相B，進行梯度洗脫。

3.4 特征峰的確認 根據17批次半夏藥材指紋圖譜直觀分析，可知各批次相應較大色譜峰個數基本一致，但不同批次相同色譜峰響應值存在差異，尤其是保留時間5～10 min左右色譜峰；由相似度結果可知，17批藥材中僅半夏J20030301、J20030901與對照指紋圖譜相似度低于0.9，兩次均來自甘肅省隴南市西和縣，根據相似度結果初步分析兩批次與其他質量存在一定差異；各特征峰(S峰除外)相對峰面積RSD值在23.4%～101.7%，除去相似度低于0.9的兩批次后，各特征峰(S峰除外)相對峰面積的RSD值在24.9%～70.0%，說明不同批次間特征峰相對保留時間存在較大差異。

17批半夏藥材中共有峰11個，統計對照指紋圖譜中各共有峰中峰面積占共有峰總峰面積百分比可知，11個共有峰中只有2個峰(峰1、峰7)占總峰面積比值低于2%，考慮到批次間質量化學成分含量存在差異，峰面積較小、分離度較差的共有峰受檢測條件等影響較大，不適宜作為特征峰用于藥材的質量控制，故選擇占總峰面相對較大(占總峰面積2%)、響應值較高、分離度較好的共有峰作為特征峰，經評估，半夏藥材對照指紋圖譜中不低于總峰面積2%共有色譜峰有9個。

綜上分析，不同批次間化學成分種類及含量均存在一定差異，且不同批次間各主要成分的相對含量差異也較大，故半夏藥材整體質量評價以主要化學成分的控制，即特征圖譜為主，相似度作為參考；根據17批次樣品譜圖中特征峰的相對保留時間平均值，制定特征圖譜的規定值，考慮到儀器、色譜柱等可能會影響色譜峰的保留時間，設置特征峰相對保留時間允許范圍為規定值的±10%。

4 結論

以SVEA C18Opal 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇—水(梯度洗脫)為流動相；流速為0.9 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為 270 nm，采用HPLC法測定。

建立的半夏特征圖譜中共標記9個特征性明顯的共有色譜峰，如圖7對照特征圖譜所示，根據17批次樣品譜圖中特征峰的相對保留時間平均值，制定特征圖譜的規定值，最終確立特征圖譜標準為：供試品特征圖譜中呈現9個特征峰，與鳥苷參照物相應的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，應在規定值的±10%之內。相對保留時間規定值為：0.503(峰1)、0.563(峰2)、0.643(峰3)、0.928(峰4)、1.000(峰5)、1.490(峰6)、1.536(峰7)、2.171(峰8)、2.210(峰9)。試驗證明，該方法經過方法學驗證，結果可靠，可用于半夏藥材的質量控制。

峰5(S)：鳥苷；峰7：腺苷；峰9：夏佛塔苷