惡性胸膜間皮瘤細胞培養條件及CDKN2B 對癌細胞的作用

尹小川 ，尹瑞揚 ，李冉華 ，蔡方奇 ，崔 岳 ，畢 濤 ，童興和

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院胸外科，云南 昆明 650032;2）昆明醫科大學海源學院第二臨床醫學系，云南 昆明 651700）

惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）是一種起源于胸膜腔內間皮細胞的惡性腫瘤細胞，侵襲性較高。MPM 可分為上皮樣、肉瘤樣以及雙相型3 種亞型。其中，上皮樣占60%，雙相樣占30%[1]。石棉纖維的吸入是MPM 的主要危險因素[2]。據統計，從事石棉相關工作人群患MPM 的概率為100/1000000，而普通人群的患病率為1/1000000[3]。MPM 早期無明顯癥狀，潛伏期較長，通常為30～40 a。隨著腫瘤的增大，患者會出現氣促、胸部疼痛、咳嗽以及呼吸困難。由于早期無顯著癥狀，患者多于晚期確診，中位生存期為診斷后的12 個月，5 a 生存率低于3%[4]。目前，MPM 的臨床治療方法主要有手術切除、化學藥物治療、放射治療以及3 者聯合治療[5?7]，這些治療雖然可提高患者的生存率，但治療效果仍不夠理想。靶向治療是近來提出的治療策略，早期的臨床實驗已初顯成效[8]，尋找可行的標志物成為治療MPM 的新挑戰。

腫瘤細胞是研究腫瘤發生和發展致病機制的關鍵工具，從腫瘤組織中分離得到的原代細胞生物學和遺傳學特性與腫瘤細胞基本一致，體外培養的癌細胞可用于研究癌細胞生物學行為、癌變機制的探索、抗癌藥物檢測等，在腫瘤研究中起著不可估量的作用。本研究中，筆者取MPM 患者的腫瘤組織，經分離得到原代細胞后分別利用RPMI-1640、DMEM 和DMEM/F12 培養基進行培養，觀察3 種培養基對MPM 細胞傳代的影響，同時探討CDKN2B 對MPM 細胞增殖、侵襲和凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

多聚甲醛（天津光復），Triton X-100、Tween 20（Sigma-vetec），PBS、抗淬滅封片劑（含DAPI）（北京中杉金橋），Annexin V-FITC/PI 試劑、CCK-8 試劑盒盒（上海碧云天），瑞士-吉姆薩符合染色液（北京Solarbio）。CDKN2B、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、Bcl-2、Bax、GAPDH 抗體以及二抗（北京博奧森），Cleaved-caspase-3 抗體（英國Abcam），逆轉錄試劑盒（美國Merck Millipore），Lipofectamine 2000 試劑盒（美國Invitrogen），SYBR II Premix Ex Taq 試劑盒（日本Takara），Transwell小室（美國康寧）。

1.2 臨床樣本及細胞株建立

本研究中患者知情并簽署知情同意書，同時獲得了昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準（2019 倫審L 第25 號）。右側胸膜結節患者麻醉后，利用高頻電刀切割1 個觀察孔，分離胸腔黏連并切除纖維囊壁，電刀在不同方向切除部分含結節在內的壁層胸膜，取多個約1 cm×1 cm×1 cm 的樣本。樣本置于含PBS 的無菌離心管內，用含雙抗的PBS 沖洗3 次后轉移至實驗室內。樣本經無菌D-kank’s 溶液清洗2 次，剪碎后將組織碎片黏附于培養瓶內壁，置于細胞培養箱內培養。當細胞融合至85%時，開始傳代。

1.3 細胞培養及傳代

分別配置含10% FBS 的RPMI-1640、DMEM以及DMEM/F12 培養液，將分離得到的MPM 細胞分別接種于述3 種培養液中，在5% CO2培養箱培養，每48 h 更換1 次培養液。待細胞密度達85%左右時，進行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化細胞并離心，加入細胞培養液制備單細胞懸液，按1∶3 的比例進行傳代，并重復傳代操作。

人間皮細胞MET-5A（上海中喬新舟）生長于人間皮完全培養基（上海中喬新舟）內，并置于5% CO2，37 ℃環境中。

1.4 CCK-8 實驗

消化后的細胞接種至96 孔板，每孔板2000個細胞，細胞在37 ℃，5% CO2環境中培養。在培養的第0、6、12、24、48、72 h，將10 μL CCK-8 試劑加至每孔，置于黑暗環境中培養1 h，酶標儀測定吸光度值。

1.5 瑞氏吉姆薩染色

細胞經0.25%胰蛋白酶消化，0.01 mol/L PBS漂洗每次5 min，重復3 次。細胞經4%多聚甲醛固定30 min。PBS 漂洗細胞后加入瑞氏-吉姆薩復合液染色1 min。滴加等量的0.01 mol 的磷酸鹽緩沖液至玻片，與瑞氏吉姆薩染色液混勻，15 min后蒸餾水漂洗，晾干玻片后顯微鏡拍照并記錄。

1.6 免疫熒光染色

細胞經PBS 漂洗3 次，每次5 min。固定后的細胞加入0.2% Triton X-100 在室溫中通透20 min。隨后加入5%正常血清封閉，1 h 后取出玻片上多余的封閉液，與稀釋后的一抗4 ℃過夜孵育。0.01 mol/L PBST 漂洗玻片，與二抗孵育1 h。漂洗、封片，熒光顯微鏡觀察熒光強度。

1.7 Western blot

收集細胞，通過RIPA 試劑充分裂解細胞，提取細胞中的總蛋白。測定總蛋白濃度，使用SDS-PAGE 在10%凝膠上對蛋白質進行電泳，并轉移到PVDF 膜。室溫中，用5%牛血清白蛋白封閉1 h，隨后分別與稀釋后的一抗過夜孵育，再與二抗孵育2 h。通過增強化學發光試劑盒顯示目的條帶。

1.8 RT-qPCR

收集MPM 細胞，TRIzol 提取細胞中的總RNA，逆轉錄試劑盒用于合成cDNA。SYBR II Premix Ex Taq 試劑盒用于CDKN2B mRNA 的qPCR 檢測。GAPDH 作為CDKN2B 的參照物。2-ΔΔct法用于分析CDKN2B mRNA 表達。

1.9 細胞轉染

上海吉凱基因合成pcDNA-NC 和pcDNACDKN2B。根據試劑盒說明書，利用Lipofectamine 2000 試劑盒 將pcDNA-NC 和pcDNA-CDKN2B 分別轉染至MPM 細胞中，將細胞置于37 ℃、5%CO2條件下培養48 h。RT-qPCR 和Western blot 檢測轉染效率。

1.10 Transwell 檢測侵襲

8 μm 的Transwell 小室用于檢測細胞侵襲能力。無血清培養基稀釋的基質膠平鋪于小室上室。無血清RPMI-1640 培養液重懸消化后的細胞，再接種于24 孔板（6×104個/孔），下室中加入含10%FBS 的RPMI-1640 培養液。Transwell 小室放入細胞培養箱常規培養。48 h 后，取出下室，用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色，倒置顯微鏡觀察細胞。

1.11 流式細胞術檢測凋亡

0.25%胰蛋白酶消化MPM 細胞，PBS 漂洗。加入5 μL FITC 與細胞混合均勻，避光孵育15 min。再與3 μL PI 避光孵育5 min，流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.12 統計學處理

上述實驗均進行3 次重復。GraphPad Prism 8用于分析數據及繪圖，2 組間數據比較采用學生t檢驗。多組間差異通過采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey’s 檢驗。數據表示為均值±標準差。P＜ 0.05 代表差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 3 種培養條件對MPM 細胞形態和增殖的作用

分別利用RPMI-1640、DMEM 和DMEM/F12培養液培養細胞并進行傳代，觀察發現，MPM 細胞主要呈短梭形或不規則多角形、貼壁，相連成片，重疊生長，見圖1A。DMEM 和DMEM/F12培養液培養的MPM 細胞在P（passage，P）10 時相對稀疏，細胞多呈長梭形，分散分布。隨后，通過CCK-8 實驗檢測細胞增殖活力，各組中P1 細胞增殖活力無明顯差異（P＞ 0.05），P5 細胞在DMEM 組和DMEM/F12 培養12 h 時增殖活力顯著高于RPMI-1640 組，P10 中各組細胞的增殖活力在72 h 時RPMI-1640 組中細胞活力高于DMEM和DMEM/F12 組（P＜ 0.05）。由此表明，建立的MPM 細胞在RPMI-1640 組細胞的活力較為穩定。

圖1 3 種培養條件對MPM 細胞形態和增殖的作用Fig.1 Effect of three culture conditions on morphology and proliferation of MPM cells

2.2 瑞氏-吉姆薩染色結果

瑞氏吉姆薩染色結果，見圖2。3 種條件下培養的MPM 細胞多為橢球型或不規則多邊形，核呈紫藍色，胞質為淡紫色，細胞胞體飽滿，形態均一。細胞核核大小不一，偶有巨核和多核。

圖2 瑞氏-吉姆薩染色結果（20×）Fig.2 The results of Wright Giemsa staining（20×）

2.3 免疫熒光檢測MPM 細胞標志物

通過免疫熒光染色檢測MPM 標志物Calretinin、CD141、CK5、EMA 和WT-1 的熒光強度，結果顯示，3 種培養條件下Calretinin、CD141、CK5、EMA 和WT-1 均在P1、P5 和P10 的MPM 細胞中表達，且Calretinin 和CK5 的熒光強度較高，見圖3。

圖3 免疫熒光檢測MPM 細胞標志物（40×）Fig.3 The MPM cells biomarkers were detected by immunofluorescence assay（40×）

2.4 CDKN2B 調控MPM 細胞增殖、侵襲和凋亡

上述實驗結果表明，分離得到的MPM 細胞在RPMI-1640 培養條件下細胞活力相對穩定，筆者選擇RPMI-1640 培養基培養分離得到MPM 細胞。RT-qPCR 和Western blot 檢測第5 代MPM 細胞中CDKN2B 的表達，發現CDKN2B mRNA 和蛋白表達在MPM 細胞中表達低于人間皮膜細胞MET-5A（P＜ 0.05），見圖4A～4B。隨 后，在MPM 細胞中轉染pcDNA-CDKN2B，轉染后CDKN2B 的表達顯著高于對照組（P＜ 0.05），見圖4C～4D。CCK-8、Transwell、Western blot 以及流式細胞術結果表明，相比較于對照組，過表達CDKN2B 組中MPM 細胞的增殖活力降低（P＜0.05），見圖4E；過表達CDKN2B 抑制細胞侵襲（P＜ 0.05），見圖4F；在過表達CDKN2B 組中間質標志物N-cadherin（P＜ 0.001）和Vimentin（P＜0.01）表達降低，上皮標志物E-cadherin 表達升高（P＜ 0.01），見圖4G；與對照組相比，過表達CDKN2B 組MPM 細胞凋亡率（P＜ 0.01）和促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3（P＜ 0.01）和Bax（P＜ 0.001）表達升高，Bcl-2 表達被抑制（P＜ 0.01），見圖4H～4I。由此表明，過表達CDKN2B 可抑制MPM 細胞增殖和轉移，促進細胞凋亡。

圖4 CDKN2B 調控MPM 細胞增殖、侵襲、上皮間質轉化和凋亡Fig.4 CDKN2B modulated the proliferation，invasion，epithelial interstitial transformation and apoptosis of MPM cells

3 討論

MPM 的發生與石棉暴露密切相關，盡管大多數國家已禁止使用石棉，但目前MPM 的發病率仍在繼續攀升。因此，了解MPM 發病機制對于對抗MPM 至關重要。體外MPM 模型是研究疾病以及開發新療法的寶貴工具。本研究中，筆者從MPM 組織中提取MPM 細胞并分別置于RPMI-1640、DMEM 以及DMEM/F12 培養液中培養傳代，發現在RPMI-1640 培養液中第1 至第10 代的細胞狀態相對穩定，筆者推測RPMI-1640 培養液更適合分離的MPM 細胞培養。

目前，已有報道從腫瘤組織或胸腔液中建立MPM 細胞系，成功率為20%～80%[9?13]。許多細胞系具有MPM 腫瘤中常見的遺傳突變，可代表一系列的MPM 組織病理學亞型。然而，大多數研究中建立的細胞系未與原始腫瘤組織中的基因組進行比較，無法確定建立的細胞系與組織病理學的相似程度。Oey 等[14]報道，MPM 細胞培養物中存在大量的單核苷酸取代物聚集在一個點上，而這一現象未在原發性腫瘤組織中觀察到。此外，商業MPM 細胞與原代細胞之間的轉錄組存在明顯不同，且商業MPM 細胞代謝向糖酵解表型轉移[9]，MPM 細胞對藥物敏感性存在較大的個體差異[15]。本研究中，筆者培養的MPM細胞均表達MPM 標志物Calretinin、CD141、CK5、EMA 和WT-1。

CDKN2B 是細胞G1 周期進展調節因子，通過與CDK4 或CDK6 形成復合物以及阻止CDK 激酶的活化，從而發揮調控作用。同時，CDKN1B還在細胞應激識別和調節發育和增加階段的細胞衰老、分化和凋亡中發揮多方面的作用[16]。CDKN2B被發現在腫瘤細胞的惡性轉化過程中突變和缺失[17?18]。例如，通過表觀遺傳抑制CDKN2B 的表達，可促進結直腸癌細胞的增殖和結直腸癌的進展[19]。抑制CDKN2B 可顯著促進膀胱癌患者的增殖并抑制細胞的凋亡[20]。CDKN2B 表達增加抑制膽管癌細胞增殖，抑制膽管癌的發展[21]。CDKN2B缺失與兒童急性淋巴細胞白血病患者較差的無復發生存率相關[22]。在本研究中，筆者發現CDKN2B在MPM 細胞中低表達，過表達CDKN2B 顯著抑制MPM 細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化，并促進細胞凋亡。

綜上所述，筆者分離得到的MPM 細胞在RPMI-1640 培養液中可穩定傳 代，CDKN2B 在MPM 細胞中低表達，過表達CDKN2B 抑制細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化并誘導細胞凋亡。