辛伐他汀抑制川畸病大鼠心肌損傷

姜虹羽, 莊秀娟, 蔡思銘, 岑紅霞

海南醫學院第二附屬醫院兒科二區,海南海口570311

川崎病(Kawasaki disease,KD)又名皮膚黏膜淋巴結綜合征,在急性發作期體內的免疫細胞被過度激活,形成炎癥因子風暴,誘導心肌細胞凋亡,導致心肌損傷,進而引起心肌纖維化從而降低心肌順應性[1-2]。辛伐他汀可以減輕缺血再灌注所引起的大鼠心肌細胞損傷,抑制心肌細胞凋亡,提升心肌細胞代謝活性從而改善心功能[3-4]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)被分泌到細胞外后可引起強烈的促炎作用,與組織細胞表面晚期糖基化終末產物受體(receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)高親和力結合,誘導細胞發生凋亡[5-6]。既往研究證實HMGB1的表達與心肌損傷密切相關[7]。然而,辛伐他汀是否對川崎病誘導的心肌損傷具有保護作用目前仍未可知。本研究探討辛伐他汀對川崎病大鼠心肌的影響及機制,為川崎病誘導的心肌損傷提供新的診療方案。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

干酪乳酸桿菌、細菌肉湯培養基購自上海微生物保種公司;SDS裂解液購自上海碧云天生物科技公司;RNA酶、DNA酶、蛋白酶抑制劑購自上海生工公司;肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnI)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購自上海聯科生物科技公司;HE染色試劑盒購自上海碧云天生物科技公司;抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、促凋亡蛋白Bcl-2關聯X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、促凋亡蛋白活化的Caspase-3(cleaved-Caspase-3)、HMGB1、RAGE、GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.2 實驗動物及處理

4周齡SD雄性大鼠購自上海睿太莫斯生物科技有限公司;川崎病大鼠模型造模流程參考文獻[8]。在37 ℃厭氧培養箱中使用肉湯培養基擴增干酪乳酸桿菌菌種5天;培養基8 000 g離心30 min,取沉淀細菌組分,加入SDS裂解液過夜裂解。8 000 g離心裂解液15 min,洗滌3次,加入5 mL RNA酶(100 mg/L)及5 mL DNA酶(100 mg/L)混合于37 ℃過夜孵育。次日,離心棄上清,洗滌3次獲得細菌組分,將其置于超聲細胞破碎儀中,冰浴條件下破碎10 min,洗滌3遍,最后利用高速離心機12 000 g低溫離心2 h,棄去沉淀,所得上清即為川崎病大鼠模型造模溶液,將其稀釋至1 g/L造模備用。

將24只SD大鼠隨機均分為對照組、模型組和辛伐他汀組。對照組大鼠腹腔注射1 mL生理鹽水;模型組大鼠腹腔注射KD造模溶液1 mL;辛伐他汀組大鼠腹腔注射KD造模溶液1 mL和辛伐他汀溶液(100 mg/kg)。辛伐他汀給藥方式參照文獻[9]。每日監測各組大鼠的存活情況。造模后28天結束動物實驗并取材,檢測相關指標變化情況。造模后可通過心臟超聲及病理切片驗證川崎病誘導的心肌損傷程度。

1.3 大鼠心臟功能檢測

各組大鼠使用1.5%的異氟烷麻醉,仰臥位固定于小動物加熱儀器,用除毛膏將大鼠左側胸前毛發脫去,涂抹超聲耦合劑,將探頭放于左側胸前,在乳頭水平用M型取樣線檢測大鼠心率,并完整檢測多個心動周期,分別在收縮期與舒張期測量左室內徑等心臟結構參數,計算左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)及左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.4 HE染色

取大鼠心肌組織于4%多聚甲醛中固定過夜,采用常規石蠟包埋切片,脫蠟復水方式進行HE染色,光鏡下觀察心肌結構和炎癥細胞浸潤情況。

1.5 血清心肌損傷標志物檢測

各組大鼠取材后收集主動脈血1 mL,3 000 r/min離心10 min,棄去沉淀收集血清,按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測血清中CK-MB及cTnI水平。

1.6 心肌組織炎癥因子檢測

取50 mg心肌組織放入研缽中,預冷的PBS清洗,加入ELISA實驗裂解液(質量/體積比為1∶3),將心肌組織充分研磨15 min,12 000 g低溫下離心20 min,棄去沉淀并收集上清進行后續檢測。按照ELISA試劑盒要求加入各種試劑,采用酶標儀計算IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.7 免疫印跡法

每只大鼠取50 mg心肌組織放入離心管,加入SDS裂解液提取總蛋白并測定蛋白含量。按照免疫印跡法操作流程,10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離蛋白,半干轉法轉膜,5%牛血清白蛋白溶液對膜進行室溫封閉3 h。加入稀釋好的一抗Bcl-2、Bax、cleaved-Cpaspase-3、HMGB1、RAGE(1∶1 000),與膜在4 ℃共孵育16 h過夜。次日,加入稀釋好的二抗(1∶5 000)與膜共孵育1 h,后暗室顯影并用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值定量分析。以目標條帶和GAPDH內參條帶的比值作為各組目標條帶表達量,Image J分析灰度值。

1.8 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件處理數據。多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用Dunnett檢驗。P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 辛伐他汀對各組大鼠心臟功能的影響

與對照組比較,模型組大鼠心肌損傷明顯,LVEF及LVFS水平明顯下降(P<0.05);與模型組比較,辛伐他汀組大鼠心臟情況明顯好轉,LVEF及LVFS值恢復至正常水平(P<0.05;圖1)。

圖1 各組大鼠心臟超聲結果A、B、C分別為對照組、模型組、辛伐他汀組大鼠心臟彩超結果;D為各組川崎病大鼠LVEF、LVFS值的柱狀圖。a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.2 辛伐他汀對大鼠心肌損傷及炎癥水平的影響

HE染色結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠心肌組織可見心肌纖維斷裂、心肌纖維化和炎癥細胞浸潤,而給與辛伐他汀治療后心肌纖維斷裂、纖維化及炎癥細胞浸潤明顯減輕(圖2)。與對照組比較,模型組大鼠CK-MB、cTnI、IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著增高(P<0.05);與模型組比較,辛伐他汀組大鼠上述各指標水平顯著降低(P<0.05;表1)。

表1 各組大鼠血清中CK-MB、cTnI及心肌組織中炎癥因子水平比較(n=8)

圖2 各組大鼠心肌組織HE染色結果(200×)A為對照組;B為模型組;C為辛伐他汀組。

2.3 辛伐他汀對各組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白的影響

與對照組比較,模型組小鼠心肌組織中Bax、cleaved-Caspase-3表達明顯升高,Bcl-2表達顯著下降(P<0.05);與模型組比較,辛伐他汀組大鼠心肌組織Bax、cleaved-Caspase-3表達明顯下降,Bcl-2顯著升高(P<0.05,圖3)。

圖3 辛伐他汀對各組大鼠心肌細胞凋亡的影響1為對照組;2為模型組;3為辛伐他汀組。A為各組大鼠凋亡相關蛋白Western blotting結果;B為各組大鼠凋亡相關蛋白相對表達水平的柱狀圖。a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.4 辛伐他汀對各組心肌組織HMGB1/RAGE信號通路相關蛋白的影響

模型組小鼠心肌組織HMGB1、RAGE表達較對照組明顯升高(P<0.05)。辛伐他汀組大鼠心肌組織HMGB1、RAGE表達較模型組明顯降低(P<0.05,圖4)。

圖4 辛伐他汀對各組心肌組織HMGB1/RAGE信號通路相關蛋白的影響1為對照組;2為模型組;3為辛伐他汀組。A為各組大鼠HMGB1及RAGEWestern blotting結果;B為各組大鼠HMGB1及RAGE蛋白相對表達水平的柱狀圖。a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

3 討 論

川崎病是兒童常患的一種出疹性急癥,為兒童免疫性疾病中的診療難點[10]。非特異性血管炎癥是川崎病的主要臨床病理特點,對冠狀動脈及其周圍心肌組織損害更為嚴重,最終將導致心功能下降和冠狀動脈瘤。本研究利用干酪乳酸桿菌提取物制備大鼠川崎病模型,通過觀察辛伐他汀對川崎病誘發的心肌損傷的影響及相關分子機制,證實辛伐他汀可明顯增強川崎病大鼠的心肌功能,提升LVEF與LVSF占比,同時抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應,從而實現保護心肌的作用。

辛伐他汀能降低膽固醇及低密度脂蛋白水平[11],也可緩解脂多糖誘發的全身炎癥反應[12]。在心肌肥厚、糖尿病心肌病或心肌缺血再灌注損傷中通過調控腺苷酸活化蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶、核因子E2相關因子2等蛋白起到保護心肌的作用[13]。目前,辛伐他汀抑制炎癥的作用機制尚存在爭議。本研究結果顯示,辛伐他汀可以顯著抑制心肌細胞凋亡,同時也能減輕炎癥細胞浸潤和降低炎癥因子水平。Bax、Bcl-2及Caspase-3是經典的線粒體途徑介導的細胞凋亡相關蛋白,反映細胞凋亡的進程。辛伐他汀可調控內源性凋亡途徑抑制成骨細胞凋亡,促進線粒體功能和成骨效果[14]。因此,線粒體凋亡途徑可能是辛伐他汀發揮生理作用的重要機制。

HMGB1是促炎關鍵蛋白,和其特異性受體RAGE結合后會開啟促炎信號通路,因此靶向二者的表達及結合能力為抗炎藥物開發提供了全新的有效位點。研究發現,利用HMGB1的抗體可以有效緩解非酒精性脂肪肝中的肝臟炎癥反應[15]。本研究結果顯示,辛伐他汀能顯著降低川崎病大鼠心肌組織中HMGB1及RAGE的表達量,降低炎癥因子的表達和減少心肌細胞凋亡;提示辛伐他汀對心肌細胞損傷的保護作用可能與抑制HMGB1/RAGE信號通路功能有關。

綜上所述,辛伐他汀可抑制川崎病導致的大鼠心肌損傷,其機制可能與抑制HMGB1/RAGE信號通路有關。