沙庫(kù)巴曲纈沙坦對(duì)慢性心力衰竭模型小鼠心功能的影響及其作用機(jī)制*

陳靜靜，吉秋霞

（南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院，江蘇 南通 226600）

慢性心力衰竭（CHF）是心肌病、炎癥等多種原因造成的心肌損傷與心功能下降，臨床表現(xiàn)為呼吸困難、體液潴留等，屬終末期心臟疾病，嚴(yán)重影響患者的健康［1-3］。沙庫(kù)巴曲纈沙坦為復(fù)合藥物，其中纈沙坦為血管緊張素受體拮抗劑，沙庫(kù)巴曲為腦啡呔酶抑制劑，可擴(kuò)張血管，利尿，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，降低心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)［4-5］。沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶類1（Sirt1）屬酰基轉(zhuǎn)移酶家族，通過(guò)去乙酰化作用影響多種基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，與細(xì)胞的存活、抗氧化應(yīng)激、抗炎反應(yīng)等密切相關(guān)。Sirt1 通常被認(rèn)為是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸前體（NAD+）依賴性去乙酰化酶，其活性受NAD+/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)（NADH）比例的調(diào)控，其調(diào)節(jié)作用涉及組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、代謝相關(guān)蛋白等多種底物。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一種細(xì)胞能量感應(yīng)激酶，當(dāng)細(xì)胞感知到能量不足時(shí)，AMPK 被磷酸化激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種代謝途徑，以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生成，并減少ATP 消耗，以維持能量平衡。Sirt1 通過(guò)與AMPK 相互作用，可互相影響其活性［6-7］。過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體γ 輔助激活因子-1α（PGC-1α）是AMPK 的關(guān)鍵下游因子，通過(guò)調(diào)控線粒體生物合成和氧化磷酸化等途徑，促進(jìn)心肌細(xì)胞的能量代謝，從而維持心臟的正常功能，同時(shí)可增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)，在心肌細(xì)胞中提供更強(qiáng)的抗氧化保護(hù)作用，有助于應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激和減少氧化損傷［8］。既往研究顯示，激活Sirt1/AMPK/PGC-1α 信號(hào)通路可改善慢性心力衰竭模型大鼠的心功能［9］。目前，臨床研究主要集中于沙庫(kù)巴曲沙坦對(duì)體液調(diào)節(jié)的機(jī)制上，心肌炎癥、細(xì)胞凋亡也是CHF 的重要表現(xiàn)。故本研究中探討了沙庫(kù)巴曲纈沙坦對(duì)CHF 模型小鼠心功能的影響及其作用機(jī)制，為其防治心力衰竭提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：vevo 3100 型超聲成像系統(tǒng)（云南萊博科技有限公司）；V5800型熒光顯微鏡（天津微儀光學(xué)儀器有限公司）；CFX Opus 96 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司）；iBright ?FL1500型蛋白凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

試藥：沙庫(kù)巴曲纈沙坦鈉片（商品名諾欣妥，Nobartis公司，批號(hào)為J20171054，規(guī)格為每片100 mg）；肌酸激酶MB 型同工酶（CK-MB）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（批號(hào)為ml037724），心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）ELISA試劑盒（批號(hào)為ml001932），白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA 試劑盒（批號(hào)為ml06159），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（批號(hào)為ml002095），均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)為S0101S），丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)為S0131S），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號(hào)為S0056），均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Sirt1抑制劑EX-527（批號(hào)為HY-15452），AMPK 抑制劑Compound C（批號(hào)為HY-13418A），均購(gòu)自美國(guó)Med-ChemExpress 公司；兔抗鼠胱天蛋白酶3（caspase-3，批號(hào)為ab13847），Sirt1（批號(hào)為ab110304），磷酸化AMPK（p-AMPK，批號(hào)為ab131357），AMPK（批號(hào)為ab32047），磷酸化PGC-1α（p-PGC-1α，批號(hào)為ab180235），PGC-1α（批號(hào)為ab191838），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號(hào)為ab8245），山羊抗兔二抗（批號(hào)為ab6721），均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

動(dòng)物：SPF級(jí)C57/BL6雌性小鼠62只，8周齡，購(gòu)自廣東萊迪生物醫(yī)藥研究院有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（粵）2022-0064。小鼠飼養(yǎng)于指定的無(wú)病原體隔離設(shè)施中，環(huán)境溫度為22～24 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，12 h/12 h明暗交替，正常進(jìn)食、飲水。本研究方案經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)為JSN2020-01201號(hào)）。

1.2 方法

造模、分組與給藥：將62 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（13 只）和模型組（49 只）。通過(guò)主動(dòng)脈縮窄術(shù)構(gòu)建CHF模型，小鼠經(jīng)30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，打開左前胸暴露心臟，游離腹主動(dòng)脈，結(jié)扎主動(dòng)脈，抽離手術(shù)針，確認(rèn)腹主動(dòng)脈暢通，復(fù)位心臟，縫合胸腔［10］。術(shù)后3 d，小鼠腹腔注射青霉素預(yù)防感染，以主動(dòng)脈弓縮窄處血液流速大于2 400 mm/s為造模成功。對(duì)照組小鼠僅開胸，不進(jìn)行縮窄操作。造模過(guò)程中，小鼠死亡12 只，其中對(duì)照組3 只，模型組9 只。將造模成功的40 只小鼠隨機(jī)分為模型組（B 組）、沙庫(kù)巴曲纈沙坦組（C 組）、沙庫(kù)巴曲纈沙坦+EX-527 組（D 組）、沙庫(kù)巴曲纈沙坦+Compound C組（E組），各10只；將10只對(duì)照組小鼠設(shè)為A組。C 組、D 組、E 組小鼠均灌胃68 mg/kg 沙庫(kù)巴曲纈沙坦［11］，連續(xù)4 周；D 組、E 組小鼠除灌胃沙庫(kù)巴曲纈沙坦外，另外分別腹腔注射1 次5 mg/kg Sirt 抑制劑EX-527［12］、20 mg/kg AMPK 抑制劑Compound C［13］，C組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。A 組和B 組小鼠均分別灌胃、腹腔注射等量生理鹽水。

心臟超聲檢測(cè)：末次給藥后，采用超聲成像系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，包括左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd），連續(xù)記錄3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

血漿心肌酶、炎性因子、氧化應(yīng)激水平測(cè)定：超聲心動(dòng)圖測(cè)定結(jié)束后，麻醉小鼠，取心臟血，抗凝，離心，取血漿，凍存。按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定CK-MB，cTnⅠ，IL-6，TNF-α，SOD，MDA，GSH-Px水平。

心肌組織病理形態(tài)觀察：各組隨機(jī)處死5 只小鼠，取心臟，用生理鹽水沖洗干凈心臟殘血，將心臟左室前壁組織固定于4%多聚甲醛中，用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，2μm 切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，封片，觀察小鼠心肌組織病理形態(tài)。

心肌凋亡情況測(cè)定：將小鼠心肌組織包埋于石蠟，4μm切片，脫蠟至水，用蛋白酶K（不含DNA 酶）工作液處理15 min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，加TUNEL 反應(yīng)液，在PBS配制的3%過(guò)氧化氫溶液（溫度為37 ℃）中孵育20 min，用PBS 漂洗，加50 μL TUNEL 檢測(cè)液（紅色），37 ℃遮光孵育60 min，用PBS 漂洗，用抗熒光淬滅封片液封片，并于熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

心肌組織基因測(cè)定：分離各組另5只小鼠的心肌組織，一部分凍存，一部分采用TRIzol 法提取心肌組織總RNA，用無(wú)核糖核酸酶的水溶解，采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的濃度。用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃凍存，用SYBR Green Master Mix 進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增，使用不同的引物特異性擴(kuò)增相應(yīng)的DNA 片段，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

小鼠心肌組織蛋白測(cè)定：取凍存的小鼠心肌組織，勻漿，離心，提取總蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）；電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入兔抗鼠caspase-3，Sirt1，p-AMPK，AMPK，p-PGC-1α，PGC-1α，GAPDH 一抗（稀釋比GAPDH 為1∶5 000，其余均為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋液（稀釋比為1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRTPCR）法和免疫印跡（Western blot）法測(cè)定小鼠caspase-3，Sirt1，AMPK，PGC-1α mRNA 和蛋白表達(dá)水平，蛋白凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Image Pro Plus 6.0圖像軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 超聲心動(dòng)圖指標(biāo)

與A組比較，B組小鼠的LVEF水平顯著降低（P<0.05），LVEDd 和LVESd 水平均顯著升高（P<0.05）；與B 組比較，C 組小鼠的LVEF 水平顯著升高（P<0.05），LVEDd和LVESd水平均顯著降低（P<0.05）；與C組比較，D組、E 組小鼠的LVEF 水平均顯著降低（P<0.05），LVEDd和LVESd水平均顯著升高（P<0.05）。詳見表2。

表2 各組小鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較（，n=10）Tab.2 Comparison of echocardiographic indicators of mice in each group（，n=10）

表2 各組小鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較（，n=10）Tab.2 Comparison of echocardiographic indicators of mice in each group（，n=10）

注：與A 組比較，aP <0.05；與B 組比較，bP <0.05；與C 組比較，cP <0.05。表3至表6、圖3同。Note：Compared with those in group A，aP <0.05；Compared with those in group B，bP <0.05；Compared with those in group C，cP <0.05（for Tab.2-6，and Fig.3）.

2.2 心肌酶水平

與A 組比較，B 組小鼠血漿CK-MB 和cTnⅠ水平均顯著升高（P<0.05）；與B組比較，C組小鼠血漿CK-MB和cTnⅠ水平均顯著降低（P<0.05）；與C組比較，D組、E組小鼠血漿CK-MB和cTnⅠ水平均顯著升高（P<0.05）。詳見表3。

表3 各組小鼠血漿心肌酶水平比較（，n=10）Tab.3 Comparison of plasma myocardial enzyme levels of mice in each group（，n=10）

表3 各組小鼠血漿心肌酶水平比較（，n=10）Tab.3 Comparison of plasma myocardial enzyme levels of mice in each group（，n=10）

2.3 炎性因子水平

與A 組比較，B 組小鼠血漿IL-6 和TNF-α 水平均顯著升高（P<0.05）；與B組比較，C組小鼠血漿IL-6和TNF-α 水平均顯著降低（P<0.05）；與C 組比較，D 組、E 組小鼠血漿IL-6 和TNF-α 水平均顯著升高（P<0.05）。詳見表4。

表4 各組小鼠炎性因子水平比較（，pg/mL，n=10）Tab.4 Comparison of inflammatory factor levels of mice in each group（，pg/mL，n=10）

表4 各組小鼠炎性因子水平比較（，pg/mL，n=10）Tab.4 Comparison of inflammatory factor levels of mice in each group（，pg/mL，n=10）

2.4 氧化應(yīng)激水平

與A組比較，B組小鼠MDA水平顯著升高（P<0.05），SOD 和GSH-Px 水平均顯著降低（P<0.05）；與B 組比較，C 組小鼠MDA 水平顯著降低（P<0.05），SOD 和GSH-Px水平均顯著升高（P<0.05）；與C組比較，D組、E組小鼠MDA水平均顯著升高（P<0.05），SOD和GSH-Px水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表5。

表5 各組小鼠氧化應(yīng)激水平比較（，n=10）Tab.5 Comparison of oxidative stress levels of mice in each group（，n=10）

表5 各組小鼠氧化應(yīng)激水平比較（，n=10）Tab.5 Comparison of oxidative stress levels of mice in each group（，n=10）

2.5 心肌組織病理

A 組小鼠心肌結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；B組小鼠心肌存在局灶性壞死，肌纖維間隔變大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；C 組小鼠心肌細(xì)胞變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較B 組減輕；D 組、E 組小鼠心肌損傷程度較C組加重。詳見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織病理蘇木精-伊紅染色圖（×200，n=5）Fig.1 HE images of myocardial pathology of mice in each group（×200，n=5）

2.6 心肌細(xì)胞凋亡情況

與A組比較，B組小鼠細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與B組比較，C組小鼠細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；與C組比較，D組、E組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05）。詳見表6和圖2。

圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（×200，n=5）Fig.2 Apoptosis of cardiomyocyte of mice in each group（×200，n=5）

表6 各組小鼠細(xì)胞凋亡率比較（，%，n=5）Tab.6 Comparison of apoptosis rate of mice in each group（，%，n=5）

表6 各組小鼠細(xì)胞凋亡率比較（，%，n=5）Tab.6 Comparison of apoptosis rate of mice in each group（，%，n=5）

2.7 心肌組織caspase-3，Sirt1，AMPK，PGC-1α mRNA 和蛋白表達(dá)水平

與A 組比較，B 組小鼠心肌組織caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），Sirt1，AMPK，PGC-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）；與B 組比較，C 組小鼠心肌組織caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），Sirt1，AMPK，PGC-1α mRNA和蛋白水平均顯著升高（P<0.05）；與C組比較，D 組、E 組小鼠心肌組織caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），Sirt1，AMPK，PGC-1α mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。詳見圖3。

A1'-A2'.mRNA表達(dá) B1'-B4'.蛋白表達(dá)圖3 各組小鼠心肌組織caspase-3，Sirt1，AMPK，PGC-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（n=5）A1'-A2'.mRNA expression B1'-B4'.Protein expressionFig.3 Comparison of expression levels of caspase-3，Sirt1，AMPK，and PGC-1α mRNA and protein in myocardial tissue of mice in each group（n=5）

3 討論

CHF 患者心肌結(jié)構(gòu)與功能均發(fā)生改變，心臟泵血不足，無(wú)法為全身提供能量。沙庫(kù)巴曲纈沙坦可作用于腦啡肽酶、腎素-血管緊張素系統(tǒng)，發(fā)揮利尿、擴(kuò)張血管、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)作用。心室重構(gòu)是CHF 發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，故沙庫(kù)巴曲纈沙坦可用于治療CHF，降低患者心血管死亡的風(fēng)險(xiǎn)。目前，沙庫(kù)巴曲纈沙坦對(duì)CHF 的治療機(jī)制仍不完善，故本研究中對(duì)此展開探討。本研究中成功構(gòu)建CHF 小鼠模型，表現(xiàn)為主動(dòng)脈弓縮窄處血液流速大于2 400 mm/s。小鼠心肌組織病理HE 染色圖顯示，小鼠心肌組織存在大量壞死與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞凋亡率升高，與既往研究［14］結(jié)果一致。經(jīng)沙庫(kù)巴曲纈沙坦治療后，小鼠心肌損傷程度減輕，心肌細(xì)胞凋亡率降低，提示沙庫(kù)巴曲纈沙坦可抑制CHF 模型小鼠心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)小鼠的心肌組織，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

炎性反應(yīng)在CHF 的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。HANNA等［15］的研究結(jié)果顯示，促炎因子TNF-α 和IL-6 廣泛參與心力衰竭的發(fā)病機(jī)制，可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞表型與功能，抑制心肌細(xì)胞收縮，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥激活。PENA等［16］的研究結(jié)果顯示，通過(guò)減輕氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)，可消除缺氧誘導(dǎo)的右心衰竭。TNF-α和IL-6水平升高與機(jī)體免疫所誘導(dǎo)的全身炎性反應(yīng)相關(guān)，本研究中經(jīng)沙庫(kù)巴曲纈沙坦治療后，C 組小鼠血漿TNF-α和IL-6水平降低，提示沙庫(kù)巴曲纈沙坦可通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子的分泌而減輕小鼠的炎性反應(yīng)。心力衰竭時(shí)室壁張力升高，刺激氧自由基產(chǎn)生，內(nèi)源性抗氧化物活性降低又進(jìn)一步影響氧自由基的清除，氧自由基可誘發(fā)心律失常，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心室重構(gòu)［17］。本研究結(jié)果顯示，沙庫(kù)巴曲纈沙坦可降低C 組小鼠血漿MDA 水平，并升高SOD 和GSH-Px 水平，提示沙庫(kù)巴曲纈沙坦可增加心肌清除氧自由基的能力，降低細(xì)胞凋亡能力，從而保護(hù)心肌組織免受損傷，但保護(hù)心肌組織的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

AMPK可被Sirt1去乙酰化激活，又可激活Sirt1，二者屬正反饋循環(huán)，從而抑制炎性反應(yīng)［18］。PGC-1α屬AMPK的重要下游因子，可被AMPK直接磷酸化，在心肌損傷疾病的發(fā)生中發(fā)揮作用［19］。p-AMPK 可作用于多種下游底物，抑制ATP 的消耗，啟動(dòng)生成ATP 的途徑，維持機(jī)體能量代謝平衡，增加細(xì)胞內(nèi)NAD+含量，進(jìn)而使NAD+依賴性Sirt1耗竭［20］。干擾Sirt1/PGC-1α去乙酰化通路可增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)線粒體功能障礙［21］。張城林等［22］的研究結(jié)果顯示，激活A(yù)MPK/PGC-1α 通路可通過(guò)促進(jìn)線粒體合成途徑，減輕心肌細(xì)胞缺氧損傷。李闖等［23］的研究結(jié)果顯示，AMPK/PGC-1α通路可反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，在心肌細(xì)胞線粒體生物合成與氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，B組小鼠的心肌組織Sirt1，AMPK，PGC-1α mRNA 和蛋白表達(dá)水平均降低，提示CHF 發(fā)病過(guò)程中Sirt1/AMPK/PGC-1α通路處于阻滯狀態(tài)；經(jīng)沙庫(kù)巴曲纈沙坦灌胃后，C 組小鼠Sirt1，AMPK，PGC-1α mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，提示沙庫(kù)巴曲纈沙坦可能通過(guò)激活Sirt1/AMPK/PGC-1α 通路而抑制CHF 小鼠的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷與心肌凋亡，保護(hù)心肌組織。在沙庫(kù)巴曲纈沙坦灌胃基礎(chǔ)上添加Sirt1 或AMPK 抑制劑時(shí)，保護(hù)作用減弱，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。

綜上所述，沙庫(kù)巴曲纈沙坦可能通過(guò)激活Sirt1/AMPK/PGC-1α 信號(hào)通路而影響CHF 模型小鼠的心功能，但沙庫(kù)巴曲纈沙坦影響CHF 的信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。