闊葉十大功勞抗炎作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

付朝舉 成果 林登梅 李軍 張楠楠

摘要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究苗藥闊葉十大功勞抗炎的有效成分及作用機(jī)制。用二甲苯、角叉菜膠分別制作小鼠及大鼠的炎癥模型，并灌胃闊葉十大功勞（小鼠劑量為1.950 mg/kg；大鼠劑量為1.350 mg/kg）。通過(guò)TCMSP、SymMap、SwisstargetPrediction、SEA、STICH等數(shù)據(jù)庫(kù)，以口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18獲取闊葉十大功勞的活性成分及其相應(yīng)靶點(diǎn)；通過(guò)GeneCards、DisGeNET、TTD、DrugBank、OMIM等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取炎癥相關(guān)靶點(diǎn)；通過(guò)Venny 2.1.0獲取疾病和藥物的交集靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape的MCODE、CytoHubba插件得到10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，并構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖；對(duì)10個(gè)Hub gene進(jìn)行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes ）和GO （gene ontology）富集分析以及分子對(duì)接。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，闊葉十大功勞能夠減輕小鼠和大鼠的炎癥癥狀。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析獲得28個(gè)闊葉十大功勞活性化合物，753個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，1 025個(gè)炎癥靶點(diǎn)，闊葉十大功勞-炎癥交集靶點(diǎn)225個(gè)，Hub gene 10個(gè)。GO及 KEGG富集分析結(jié)果顯示，闊葉十大功勞主要參與JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Th17細(xì)胞分化和一些癌癥通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示，小檗堿、異博爾定等11個(gè)活性成分與JUN、JAK3等8個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接成功。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明闊葉十大功勞具有抗炎作用，抗炎的主要成分為槲皮素、小檗堿等化合物，抗炎的機(jī)制可能是通過(guò)作用于IL-2、JAK1等靶點(diǎn)，參與JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Th17細(xì)胞分化等通路抗炎，初步揭示了闊葉十大功勞發(fā)揮抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞：闊葉十大功勞；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；炎癥；分子機(jī)制；有效成分

中圖分類號(hào)：R285?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1002-4026（2024）01-0024-08

Experimental study and network pharmacological analysis of the anti-inflammatory action mechanism of ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr.

Abstract∶The aim of this study was to investigate the active ingredients and mechanism of action of the anti-inflammatory effect of ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr. in Hmong medicine based on network pharmacology and animal experiments. Inflammation models of mice and rats were generated using xylene and carrageenan gum， respectively， and ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr. was gavaged （dose of 1.950 mg/kg for mice; 1.350 mg/kg for rats）. The active ingredients and their corresponding targets of ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr. were obtained using TCMSP， SymMap， SwisstargetPrediction， SEA， and STICH， among other databases， with oral bioavailability ≥30% and drug-likeness ≥0.18. Inflammationrelated targets were obtained through GeneCards， DisGeNET， TTD， DrugBank， OMIM and other databases. The intersection targets of diseases and drugs were determined using Venny 2.1.0， and 10 hub gene were obtained through Cytoscape′s MCODE， CytoHubba plug-in and constructed drug-component-target network diagram; Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）， and Gene Ontology （GO） enrichment analysis and molecular docking were performed for the 10 Hub gene. The results of animal experiments showed that ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr. could be used to reduce the inflammatory symptoms in mice and rats. The network pharmacological analysis revealed 28 ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr. active ingredients， 753 drug action targets，1 025 inflammatory targets， 225 ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr. inflammatory crossover targets and 10 hub genes. The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr. top ten utilities were predominantly involved in the JAK-STAT signaling pathway， Th17 cell differentiation and some cancer pathways. The molecular docking results demonstrated that 11 active ingredients， including berberine and isoboridine， were successfully docked with 8 targets， including JUN and JAK3. The results of animal experiments showed that ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr. has anti-inflammatory effects， and the main ingredients of anti-inflammation include quercetin and berberine， among other compounds， and the mechanism of anti-inflammation may be through the action onIL-2， JAK1 and other targets， involved in JAK-STAT signaling pathway， Th17 cell differentiation， and other pathways of anti-inflammation. The present study initially revealed the material basis and mechanism of action of the anti-inflammatory effect of ‘Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr.

Key words∶Mahonia bealei ‘（Fort.） Carr.; network pharmacology; inflammation; molecular mechanism; active ingredient

闊葉十大功勞Mahonia bealei （‘Fort.） ‘Carr.屬小檗科（Berberidaceae），灌木或小喬木，主要生長(zhǎng)于廣西、四川、貴州、湖北、江西、浙江等地，是我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物[1]，在《中國(guó)苗族藥物彩色圖集》[2]和《苗族醫(yī)藥學(xué)》[3]等苗藥相關(guān)著作中均有記載。闊葉十大功勞有清熱燥濕、瀉火解毒之效，可用于治療濕熱瀉痢、黃疸尿赤等癥，該中藥以根莖入藥稱為功勞木，以葉入藥稱為功勞葉?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，闊葉十大功勞具有抗氧化、抗炎、抗菌的作用[4]。

近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制等方面的研究中發(fā)揮著重要的作用。炎癥是人體對(duì)微生物感染、組織損傷和毒素等刺激因素的一種高度協(xié)同反應(yīng)，中等程度的炎癥反應(yīng)對(duì)人體有利，但過(guò)度炎癥反應(yīng)可引起糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化及高血壓病等許多疾病，而抑制炎癥反應(yīng)可減少一些疾病的發(fā)生[5-7]。本文主要采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)闊葉十大功勞抗炎作用進(jìn)行研究，旨在尋找闊葉十大功勞中具有成藥性、口服吸收較好的成分，并預(yù)測(cè)這些成分的抗炎作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，為闊葉十大功勞抗炎作用的深入研究提供參考，為闊葉十大功勞的二次開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物制備

KM小鼠30只，雄性，4～5周齡，體重（25±5）g。SD大鼠18只，雄性，6～8周齡，體重（250±20） g，均購(gòu)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黔）2021-0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2021-0005。闊葉十大功勞木采集于貴州省開(kāi)陽(yáng)縣，樣本存放于貴州苗醫(yī)藥博物館，編號(hào)GZT2020121021530306，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)肖承鴻高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為小檗科十大功勞屬植物闊葉十大功勞 Mahonia bealei（ Fort．） Carr.。闊葉十大功勞根莖干燥粉碎，取藥物粉末100 g轉(zhuǎn)移到2 L圓底燒瓶，加95%乙醇1 L，浸泡0.5 h后采用超聲提取0.5 h，所得溶液過(guò)濾并濃縮，制得質(zhì)量濃度4 g/mL的醇提液25 mL，并用蒸餾水稀釋成0.4 g/mL的水提液備用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理審查委員會(huì)審查，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查表編號(hào)20220130。

1.1.2 抗炎實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分別采用二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致大鼠足腫脹的方法，研究闊葉十大功勞的抗炎作用。闊葉十大功勞用量參照臨床每日15 g的給藥量，以體重70 kg為準(zhǔn)，換算為小鼠和大鼠的給藥劑量。

二甲苯致小鼠耳腫脹法：將KM雄性小鼠隨機(jī)分為3組，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、闊葉十大功勞組，每組10只，分別給予0.9%生理鹽水、1%阿司匹林、95%闊葉十大功勞醇提稀釋水提液。各組小鼠分別給藥1次，0.5 h后用二甲苯50 μL涂抹于小鼠右耳正、反面，左耳作為對(duì)照不予處理，0.5 h后處死小鼠，用打孔器在小鼠的左右耳同一部位打下圓耳片，稱重。同一小鼠的右耳與左耳質(zhì)量之差即為小鼠耳腫脹度，并計(jì)算小鼠耳廓腫脹抑制率。耳廓腫脹度抑制率（%）=（右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量）/左耳質(zhì)量×100%。

角叉菜膠致足腫脹法：將SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、闊葉十大功勞組，每組6只，分別給予0.9%生理鹽水、1%阿司匹林、95%闊葉十大功勞醇提稀釋水提液。各組大鼠分別給藥1次，0.5 h后每只大鼠均在其右后足足跖皮下注射1%角叉菜膠致炎，每只0.1 mL。于注射后0.5、1.0、1.5 h時(shí)測(cè)量大鼠右后足足跖厚度，致炎前后足跖厚度之差作為腫脹度（mm），并計(jì)算大鼠的足跖腫脹率。足跖腫脹率（%）=（致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度）/致炎前足跖厚度×100%。

1.1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)采用GraphPad Prism 9.4.1軟件分析，GraphPad Prism是一種高效且易于使用的科學(xué)研究繪圖分析軟件，結(jié)合了科學(xué)圖形、綜合曲線擬合（非線性回歸）、可理解的計(jì)算數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)組織，能夠準(zhǔn)確對(duì)各種數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，然后可視化形成各種圖表[8]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用（‘x±s）表示。使用GraphPad Prism 9.4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)站

依托網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)及在線作圖網(wǎng)站進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)、在線作圖網(wǎng)站有TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）、Symma（https：//www.symmap.org）、SEA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//sea.bkslab.org）、STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//stitch.embl.de/）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/predict.php）、DrugBank（https：//go.drugbank.com）、TTD（https：//db.idrblab.net）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）、STRING（https：//cn.string-db.org/）、DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）、PubMed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、PDB（https：//www.rcsb.org/）、微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）。

1.2.2 收集闊葉十大功勞靶點(diǎn)和炎癥靶點(diǎn)

通過(guò) TCMSP和Symmap數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)闊葉十大功勞化學(xué)成分進(jìn)行檢索，根據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18篩選出滿足條件的化合物為候選化合物。將藥物成分SMILES結(jié)構(gòu)從PubChem中下載到SwissTargetPrediction、SEA和STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，剔除重復(fù)的靶基因，獲取闊葉十大功勞成分的潛在目標(biāo)基因。將關(guān)鍵詞“inflammation”輸入到 OMIM、GeneCards、 DrugBank、TTD和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中，搜索與炎癥有關(guān)的基因，提取GeneCards檢索結(jié)果中score≥5的基因和DisGeNET、OMIM、DrugBank、TTD的所有“Human”基因，去重匯總后，得到與炎癥相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.3 篩選交集靶點(diǎn)并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)Venny 2.1.0對(duì)藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行在線作圖，數(shù)據(jù)取交集即闊葉十大功勞潛在的抗炎靶點(diǎn)。將闊葉十大功勞潛在的抗炎靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將“Minimum required interaction score” 設(shè)置為“highconfidence （0.900）”，其他參數(shù)保持默認(rèn)，將tsv.格式的數(shù)據(jù)結(jié)果上傳至Cytoscape（3.9.1版），構(gòu)建目標(biāo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)利用 Cytoscape軟件插件MCODE及Cytohubba在PPI網(wǎng)絡(luò)上搭建分子相互作用模塊，篩選出核心靶點(diǎn)。

1.2.4 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)Cytoscape 3.9.1軟件，將1.2.2獲得的225個(gè)靶點(diǎn)與闊葉十大功勞藥效成分相對(duì)應(yīng)，構(gòu)建出闊葉十大功勞藥物-成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 GO和KEGG功能富集分析

將1.2.3中得到的10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)里，選擇“Homo sapiens”物種，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。通過(guò)微生信在線繪圖軟件，將GO和KEGG分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.6 分子對(duì)接

將闊葉十大功勞藥對(duì)活性成分與10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)并進(jìn)行分子對(duì)接，活性化合物小分子配體的2D結(jié)構(gòu)從PubMed中獲取，Hub蛋白結(jié)構(gòu)文件從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取，并將活性化合物配體和Hub蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入DS BIOVIA Discovery Studio 2016 v16.1進(jìn)行分子對(duì)接模擬，對(duì)接分?jǐn)?shù)表明配體與受體間親和能力的大小。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 闊葉十大功勞對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

小鼠抗炎結(jié)果如圖1所示，與生理鹽水組（空白對(duì)照組）比較，闊葉十大功勞組（實(shí)驗(yàn)組）、阿司匹林組（陽(yáng)性對(duì)照組）小鼠耳腫脹明顯減輕，且均能有效降低小鼠兩耳片質(zhì)量的差值（‘p＜0.01，表1）。

2.1.2 闊葉十大功勞對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響

大鼠抗炎結(jié)果如圖2所示，與生理鹽水組（空白對(duì)照組）相比，闊葉十大功勞組（實(shí)驗(yàn)組）與阿司匹林組（陽(yáng)性對(duì)照組）均能有效降低角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足腫脹率（‘p＜0.05，見(jiàn)表2） ，但是闊葉十大功勞組效果不如陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林組。

2.2.1 闊葉十大功勞成分與靶點(diǎn)

在TCMSP、Symmap數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)中查閱檢索闊葉十大功勞化學(xué)成分，按OB值≥30%和DL值≥0.18篩選，總共篩選出闊葉十大功勞成分31個(gè)，除去無(wú)靶點(diǎn)的化合物，獲得闊葉十大功勞成分28個(gè)，主要藥效成分見(jiàn)表3，全表見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。采用“Homo sapiens”作為物種篩選的條件，去重匯總后獲得闊葉十大功勞成分753個(gè)潛在靶點(diǎn)。

2.2.2 炎癥靶點(diǎn)

以“inflammation”在GeneCards、OMIM等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與炎癥有關(guān)的靶點(diǎn)，去重匯總后，得到1 054個(gè)靶點(diǎn)基因。通過(guò)Venny 2.1.0對(duì)2.2.1得到的753個(gè)闊葉十大功勞靶點(diǎn)基因和炎癥靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，獲得藥物和疾病的共同靶點(diǎn)225個(gè)，見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。

2.2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

將2.2.2節(jié)的225個(gè)交集靶點(diǎn)，通過(guò)創(chuàng)建屬性文件整理成分-靶點(diǎn)，得到藥物-成分-靶點(diǎn)文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1得到藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2）。附圖2體現(xiàn)了闊葉十大功勞藥物-成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，圖中藍(lán)色圓形為成分對(duì)應(yīng)的基因，橙色三角形表示闊葉十大功勞中能與這些基因反應(yīng)的有效成分，共28個(gè)。

2.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將2.2.2節(jié)225個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析，以置信度最大（0.900）為條件篩選，將數(shù)據(jù)結(jié)果上傳至Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行分析，去除游離蛋白，得到PPI圖，見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3。蛋白連接的線越多，表明該蛋白degree值越高，是關(guān)鍵蛋白。利用插件Cytoscape 3.9.1軟件中MCODE 和 CytoHubba 插件篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白，得到了PIK3CA、SRC、EGFR、MAPK1、IL-2、STAT3、JUN、JAK3、JAK1、MAPK14等10個(gè)蛋白，表明這些蛋白與闊葉十大功勞抗炎作用有著更為直接的關(guān)系。

2.2.5 GO和KEGG功能富集分析

將2.2.4節(jié)得到的10個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行功能富集分析，其結(jié)果如OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4（a）所示，主要富集的細(xì)胞成分包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架等；主要富集的生物過(guò)程有白細(xì)胞介素-6介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)，STAT蛋白的酪氨酸磷酸化等；主要富集的分子功能包括蛋白激酶結(jié)合，蛋白酪氨酸激酶活性，跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。在 KEGG 通路富集分析結(jié)果中（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4（b）），富集的通路有新型冠狀病毒感染、麻疹、人類巨細(xì)胞病毒感染、JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Th17細(xì)胞分化、Th1和Th2細(xì)胞分化等。

2.2.6 分子對(duì)接

為了測(cè)試化合物-靶點(diǎn)相互作用的可靠性，根據(jù)2.2.4的結(jié)果對(duì)選取的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。對(duì)接分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明蛋白與配體的結(jié)合能越低，越容易結(jié)合。結(jié)果顯示，11個(gè)活性成分與8個(gè)蛋白對(duì)接成功，其山茱萸苷H、異博爾定、硫唑胺、異鼠李素、鴉膽子苷M、鴉膽子苷J(rèn)、槲皮素、不列顛寧、弗拉辛、小檗堿、與 JUN、JAK3、IL-2、MAPK14、EGFR、MAPK1、SRC、JAK1等蛋白有較好的親和力。部分分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表4，全表見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表2。部分分子對(duì)接結(jié)果示意圖見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5。

3 討論

炎癥是人體對(duì)致炎因子的損傷作用所引起的反應(yīng)，能引起人體充血、腫脹、滲出和變性，局部組織缺血缺氧并伴有代謝機(jī)能的變化，嚴(yán)重者可引起多種疾病[9]。因此，控制過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)于機(jī)體的功能恢復(fù)非常關(guān)鍵。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，闊葉十大功勞具有良好的抗炎效果。在對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)中，闊葉十大功勞與陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林表現(xiàn)出同等的抗炎效果；在對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)中，闊葉十大功勞的抗炎效果相對(duì)陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林較弱，其原因可能是大、小鼠之間的種屬差異所致。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，構(gòu)建了闊葉十大功勞的藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，探索了闊葉十大功勞抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制。

本研究結(jié)果展示了闊葉十大功勞中小檗堿、槲皮素、不列顛寧、異博爾定等化合物具有抗炎活性，IL-2、SRC、EGFR、MAPK14等是闊葉十大功勞抗炎的核心靶點(diǎn)。IL-2是一種刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，在免疫細(xì)胞中，IL-2與IL-2受體共同作用可導(dǎo)致Jak/STAT信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路和MEK/ERK信號(hào)通路活化，這些通路與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)[10]。EGFR是上皮生長(zhǎng)因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體，降低 EGFR的含量，能有效控制其前期炎癥發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)EGFR抑制PI3K-AKT信號(hào)通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。MAPK14是4個(gè)p38 MAPKs家族之一，p38 MAPKs 調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)過(guò)程中，相關(guān)促炎細(xì)胞因子IL-β 和 TNF-α?xí)a(chǎn)生，炎癥反應(yīng)有關(guān)的酶會(huì)激活[12]。

分子對(duì)接結(jié)果表明JUN、JAK3、IL-2、MAPK14、EGFR等8個(gè)蛋白能夠與小檗堿、槲皮素、不列顛寧、黃連素等11種有效成分穩(wěn)定地結(jié)合。研究表明，異博爾定是林氏基（TARL）總生物堿中的主要生物活性成分之一，能夠減輕小鼠膠原蛋白引起的關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷[13]。不列顛寧是一種倍半萜化合物，具有顯著的抗氧化和抗炎活性，能夠減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和黏液分泌的增加。研究表明，不列顛寧抑制HMC-1中促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)和分泌，口服給予不列顛寧（10～20 mg/kg）能夠降低IgE致敏小鼠肥大細(xì)胞介導(dǎo)的PCA反應(yīng)[14-15]。小檗堿可通過(guò)調(diào)控NF-κB、MAPK、PPARγ信號(hào)及其他途徑來(lái)影響免疫細(xì)胞中Treg與Th17細(xì)胞間的平衡，并抑制IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α及ICAM-1等炎癥因子的分泌及表達(dá)，能阻礙白細(xì)胞黏附，遷移內(nèi)皮，減少中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，促使細(xì)胞凋亡及減少組織損傷[16-18]。槲皮素能通過(guò)沉默Toll樣受體（TLR），進(jìn)而抑制細(xì)菌脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的細(xì)胞膜表面黏附分子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[19]。因此，結(jié)合靶點(diǎn)與成分分析，推測(cè)闊葉十大功勞中的小檗堿等成分通過(guò)抑制MAPK14等使IL-β與TNF-α等促炎細(xì)胞因子釋放減少，達(dá)到抗炎作用。

炎癥作為機(jī)體對(duì)于刺激的一種保護(hù)性反應(yīng)，免疫細(xì)胞、血管和多種分子介質(zhì)均有參與。KEGG 信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，闊葉十大功勞發(fā)揮抗炎的作用通路主要與癌癥中途徑、JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Th17細(xì)胞分化、Th1和Th2細(xì)胞分化等有關(guān)。研究表明炎癥反應(yīng)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素，可誘發(fā)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[20]。JAK-STAT信號(hào)通路通過(guò)負(fù)調(diào)控因子（SOCS和PIAS）功能失調(diào)使得JAK/STAT信號(hào)通路持續(xù)激活，導(dǎo)致體內(nèi)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、生長(zhǎng)因子等水平顯著升高，而JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑是細(xì)胞因子分泌的運(yùn)輸樞紐，因此對(duì)于炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[21]。Th17和Th1免疫應(yīng)答是一種促炎反應(yīng)[22]，TH2免疫應(yīng)答是一種抗炎反應(yīng)，通過(guò)促進(jìn)特應(yīng)性中的IgE和嗜酸性粒細(xì)胞反應(yīng)并產(chǎn)生抗炎作用[23-25]。結(jié)合成分與通路分析，推測(cè)闊葉十大功勞中槲皮素、不列顛寧等成分作用于Th1、Th2和Th17等免疫細(xì)胞，參與JAK-STAT信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。此外，KEGG結(jié)果中顯示硫唑胺、鴉膽子苷等成分作用于乙型肝炎、新型冠狀病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒感染、病毒性癌癥的發(fā)生、麻疹等通路，這表明闊葉十大功勞中可能含有治療癌癥、麻疹、肺炎、肝炎的成分靶點(diǎn)，當(dāng)然還有待于今后進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本研究利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了闊葉十大功勞的抗炎作用，同時(shí)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接對(duì)闊葉十大功勞抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)。研究結(jié)果表明，闊葉十大功勞能夠有效減輕小鼠及大鼠的炎癥反應(yīng)，抗炎的主要成分可能為小檗堿、槲皮素、不列顛寧等，抗炎的機(jī)制可能是通過(guò)作用于IL-2、MAPK14、EGFR等靶點(diǎn)參與JAK-STAT信號(hào)通路。

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