烏拉爾甘草懸浮細胞培養物有效成分的提取

孟婷婷　彭艷玲　王鈺璽等

摘要：甘草為豆科多年生草本植物，化學成分復雜，具有多種生物學活性與藥理學活性，廣泛應用于臨床、食品、保健品、化妝品等行業。以懸浮培養的烏拉爾甘草細胞為研究對象，采用雙因素無重復試驗法對懸浮細胞的有效成分提取方法進行優化，結果表明：選取70%乙醇作為提取劑，在料液比 1 g ∶10 mL的提取條件下，烏拉爾甘草中的2大類有效成分——三萜皂苷類化合物、黃酮類化合物都得到充分析出；在此提取條件下，懸浮細胞中黃酮類化合物的含量為0.020 0 g/g，大約是野生烏拉爾甘草根粉中黃酮類化合物含量的23%。

關鍵詞：烏拉爾甘草；懸浮細胞；有效成分；提取；黃酮類化合物

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0063-03

收稿日期：2014-10-21

基金項目：國家自然科學基金（編號：31460064）；內蒙古自然科學基金（編號：2013MS051）；內蒙古自治區高等學校科學研究項目（編號：NJZY13152）。

作者簡介：孟婷婷（1991—），女，河南開封人，碩士研究生，主要從事藥用植物生物技術研究。E-mail：wymtt1991@163.com。

通信作者：李雅麗，博士，教授，主要從事植物次生代謝調控研究。E-mail：btliyali@126.com。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）被稱為“眾藥之王”，有廣泛的藥理學活性，是多種中成藥與配方制劑的主要成分，同時也因為其特有的甜味而作為食品添加劑（低熱值甜味劑）廣泛應用在食品行業，國內外市場需求量很大[1-4]。近些年來，由于無序采挖、生態環境惡化，造成甘草主產區野生資源瀕臨枯竭[5]，表現在栽培品種收獲期過長、病蟲害嚴重、質量低下，導致甘草資源面臨危機。植物細胞培養技術因具備不占用土地、培養周期短、培養條件和環境人工可控等優勢，成為現有的植物資源替代生產天然藥物途徑中最有潛力的方法之一[6-7]。在對甘草細胞進行離體懸浮培養的過程中，細胞內有效成分的提取是一個主要的研究內容，充分高效地分離出細胞培養物中的有效成分是下一步應用的保證[8]。本研究以產自內蒙古鄂爾多斯市達拉特旗的烏拉爾甘草種子獲得的離體懸浮培養細胞為材料，通過雙因素無重復試驗篩選懸浮細胞有效成分的提取工藝，以期促進甘草細胞大規模培養，加快工業化生產天然藥物的進程。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗材料為烏拉爾甘草種子，購自內蒙古鄂爾多斯市達拉特旗。主要試劑為蕓香苷標準品，購自中國藥品生物制品檢定所，純度92.5%；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

BRANSON超聲波清洗器，必能信超聲（上海）有限公司；722可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械廠；YP502N電子天平，上海精密科學儀器有限公司；SynergyTM HT多功能酶標儀，BioTek。

1.3試驗設計

對烏拉爾甘草懸浮培養細胞有效成分的提取采用全面試驗設計法進行優化，全面試驗設計法是對所選取的試驗因素的所有水平組合全部實施1次以上試驗，此方法適用于單因素和雙因素試驗，可獲得全面試驗信息，準確地估計各試驗因素主效應的大小及各因素之間各級交互作用效應的大小[9]。從有效成分提取的影響因素中抽取2個主要因素設置均勻水平，本試驗分別以甲醇、乙醇作為提取劑，采用超聲提取法，選擇提取劑質量分數（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、料液比（g ∶mL，1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1 ∶50） 2個主要影響因素，分別設計10個水平，進行雙因素無重復試驗。

1.4烏拉爾甘草懸浮細胞供試樣品的制備

將生長1個周期（21 d）的烏拉爾甘草懸浮細胞用布氏漏斗抽濾后，用無菌水沖洗，去除表面殘留的培養基，置于37 ℃恒溫烘箱中烘干至恒質量，研磨成粉末后過100目篩得烏拉爾甘草細胞粉末。準確稱取180份0.5 g的甘草粉末于180個100 mL的三角瓶中，依據所設計的雙因素無重復試驗，按不同料液比（影響因素A）加入不同濃度提取劑（影響因素B），放置24 h過夜后，置于超聲清洗器中超聲提取30 min，超聲后的料液立即置于漏斗過濾得濾液，靜置，取上清樣于4 ℃冰箱中保存[10]。

1.5酶標儀法檢測

采用酶標儀檢測供試樣品。分別吸取5 μL樣品溶液，點入96孔點樣板中，加入245 μL超純水混勻，依次放入酶標儀檢測槽中。分別在254、377、410 nm波長下檢測樣品的吸光度D254 nm、D377nm、D410 nm，以不加樣品組為對照。

1.6細胞培養物中黃酮類化合物測定

1.6.1蕓香苷標準樣品的制備準確稱取干燥至恒質量的蕓香苷標準品并用甲醇溶解，配成0.1 mg/mL的蕓香苷標準品溶液。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蕓香苷標準品溶液置于7支試管中，添加5 mL甲醇、0.5 mL 10% KOH溶液，充分搖勻顯色5 min后，用甲醇定容至10 mL，搖勻，用分光光度計檢測410 nm處的吸收度D410 nm。

1.6.2黃酮類化合物測定各取出0.2 mL制備好的5批烏拉爾甘草懸浮細胞供試樣品溶液，分別置于5支10 mL試管中，各加5 mL甲醇、0.5mL 10% KOH顯色劑，顯色5 min后，定容到10 mL，用分光光度計檢測其在410 nm處的吸光度D410 nm。同時制備1份野生甘草根粉樣品作為對照[11]。

2結果與分析

2.1不同提取劑條件所得提取液的D254 nm

254 nm是甘草中主要成分——以甘草酸為代表的三萜皂苷類化合物的主要檢測波長。如圖1所示，采用60%甲醇、90%甲醇作為提取劑，料液比為1 g ∶10 mL時，在254 nm處有較大吸光度；以70%～90%乙醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL時，在254 nm處有較大吸光度。

2.2不同提取劑條件所得提取液的D377nm、D410 nm

377、410 nm是甘草中另外一大類主要成分——以甘草苷為代表的黃酮類化合物的主要檢測波長，如圖2所示：以80%甲醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL時，在377 nm處有最大吸光度；以70%乙醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL時，在377 nm處有最大吸光度。如圖3所示，以80%、90%甲醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL時，在410 nm處有較大吸光度；以70%乙醇作為提取劑，料液比1 g ∶10 mL時，在410 nm處有最大吸光度。

綜合以上3個波長下所測的樣品光吸光度，確定選取70%乙醇作為提取劑，在料液比1 g ∶10 mL條件下，提取液在254、377、410 nm處均有較大吸光度，表明甘草懸浮細胞中的主要有效成分無論是三萜皂苷類化合物還是黃酮類化合物都能被充分地析出。

2.3細胞培養物中黃酮類化合物的測定

2.3.1蕓香苷標準曲線的繪制以蕓香苷溶液濃度為橫坐標、對應的吸光度為縱坐標，用Origin 8.0繪制標準曲線，并得到標準方程D=4.125 7C+0.082 98，r2=0.998（D為吸光度，C為蕓香苷標準品濃度），詳見圖4，表明蕓香苷標準品濃度與D410 nm呈良好的線性關系。

2.3.2烏拉爾甘草懸浮細胞中黃酮類化合物的含量5份烏拉爾甘草懸浮細胞供試樣品溶液經分光光度計檢測后結果如表1所示，根據懸浮培養的“2.3.1”節所得標準品的回歸方程計算，烏拉爾甘草細胞中黃酮類化合物的含量是 0.020 0 g/g，同法測得野生烏拉爾甘草根粉中黃酮類化合物的含量是0.088 0 g/g，懸浮烏拉爾甘草細胞中黃酮類化合物含量大約是野生烏拉爾甘草根粉中黃酮類化合物含量的23%。

3結論

以產自內蒙古鄂爾多斯市達拉特旗的烏拉爾甘草種子通過植物組織培養技術獲得的離體懸浮細胞為研究對象，通過雙因素無重復試驗篩選了烏拉爾甘草懸浮細胞培養物有效成分提取的最佳工藝。甘草具有多種生物學活性與藥理學活性，而起主要作用的有效成分通常被認為是三萜皂苷類和黃酮類化合物。試驗結果表明，以70%乙醇為提取劑、料液比1 g ∶10 mL 的條件下超聲提取，甘草中的主要有效成分得到充分析出。

分析了懸浮烏拉爾甘草離體細胞中黃酮類化合物的含量，結果表明：懸浮培養的烏拉爾甘草細胞中的黃酮類化合物含量是野生烏拉爾甘草中黃酮類化合物含量的23%。雖然懸浮培養的烏拉爾甘草細胞中黃酮類化合物總含量遠低于野生烏拉爾甘草，但懸浮培養周期短，僅需3周，而野生甘草生長周期長達4～5年；此外，懸浮培養方便、快捷、易人工控制，避免了病蟲害等其他自然因素的影響。因此，利用甘草細胞大規模培養生產黃酮類化合物為緩解甘草野生資源危機提供了可行的途徑[12]。

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