逍遙散對胃癌荷瘤共病抑郁小鼠程序性死亡受體1抑制劑治療的增敏作用及機(jī)制探討

陳軍 張兆星 米婧 屈紅艷 胡蓉 李靜

2022年國家癌癥中心發(fā)布了最新一期的全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù),2016年新發(fā)病例406.4萬,其中胃癌占比39.7%,位列第三,且在農(nóng)村胃癌發(fā)病人數(shù)最多。總死亡人數(shù)241.1萬,其中胃癌占比28.9%,也位列第三,不可否認(rèn),胃癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人民健康的疾病之一。盡管程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)負(fù)性檢查點(diǎn)免疫治療的部分?jǐn)?shù)據(jù)提示改善了患者晚期生存[1],然而其有效率仍不到30%,其中大約63.2%的有效人群對PD-1抑制劑干預(yù)后均會迅速誘發(fā)免疫治療耐藥[2]。同時,研究發(fā)現(xiàn)在胃癌的免疫治療失應(yīng)答群體中,大概率的存在著疲勞、心境低落等抑郁核心癥狀[3]。抑郁的影響不僅僅局限于情緒和認(rèn)知,甚至能夠?qū)е路暖煛K類、內(nèi)分泌藥物、分子靶向藥物等多種治療耐受[4]。因此,抑郁可能參與了免疫治療的負(fù)反饋調(diào)控。在前期的動物實(shí)驗(yàn)中,本研究小組也證實(shí)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)可誘導(dǎo)出荷瘤小鼠的抑郁樣行為并顯著促進(jìn)腫瘤的增殖[5]。逍遙散是中醫(yī)治療“郁證”的代表方劑,療效確切[6]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建胃癌荷瘤共病抑郁小鼠模型,來探究逍遙散對PD-1抑制劑是否有增敏作用及相關(guān)機(jī)制,為探尋胃癌的中西醫(yī)綜合治療提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞株

6周齡BALB/c雄性野生小鼠共70只(其中成功構(gòu)建胃癌荷瘤小鼠63只,滿足60只的分組要求),體質(zhì)量20～25 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006;飼養(yǎng)于26～27℃、12/12小時光照/黑暗交替的環(huán)境中;小鼠MFC胃癌細(xì)胞株購自于武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號:CL-0156。

1.2 主要試劑與儀器

鼠源PD-1抑制劑(MedChemExpress公司,目錄號:HY-P99144),小鼠吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)ELISA試劑盒(TSZ,德國,貨號:LM-IDO-Mu);小鼠犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)ELISA檢測試劑盒(菲恩生物,中國,貨號:EM1862);小鼠芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)ELISA檢測試劑盒(ZIKER,中國,貨號:ZK-M5467)。

逍遙散按《太平惠民和劑局方》的原方抓取,當(dāng)歸30 g、白芍30 g、柴胡30 g、白術(shù)30 g、茯苓30 g、甘草15 g、煨生姜10 g、薄荷10 g,其中藥比例為3∶3∶3∶3∶3∶1.5∶1∶1,按標(biāo)準(zhǔn)方法制備逍遙散水提物[7],并濃縮至每毫升0.385 g生藥,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

超聲波破碎儀(JY98-IIIDN,新芝,中國);小鼠灌胃針(HL-GWQ,合力科創(chuàng),中國);高速低溫離心機(jī)(TGL-20M,湘儀,中國);電子天平(JET1003G,Metter,美國);酶標(biāo)儀(MK3,Thermo,美國);光學(xué)顯微鏡(BX53M,奧林巴斯,日本)。

1.3 胃癌荷瘤小鼠模型的構(gòu)建

將小鼠MFC胃癌細(xì)胞株液氮中取出,常規(guī)復(fù)蘇,并放在含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),并放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代至3～4代,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個/mL制成細(xì)胞懸液。小鼠常規(guī)消毒,仰臥位固定,在小鼠的右腋窩下接種0.2 mL的細(xì)胞懸液,并用無菌棉簽按壓10秒。接種第14天,小鼠皮下腫瘤體積達(dá)到50 mm3時,提示荷瘤小鼠造模成功。小鼠皮下腫瘤體積計算公式:體積(mm3)=1/2(長徑×短徑×短徑)。

1.4 分組

接種第15天,將荷瘤成功的小鼠60只,隨機(jī)分為荷瘤對照組、荷瘤共病抑郁組、PD-1抑制劑組、逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組,每組15只,各組采用的干預(yù)方式見圖1。CUMS具體是以關(guān)燈、擁擠、束縛、食物剝奪、頻閃、18℃游泳等進(jìn)行刺激,為了確保實(shí)驗(yàn)的不可預(yù)測性,所有的壓力源都是隨機(jī)給予。小鼠灌胃以3.85 g/kg為標(biāo)準(zhǔn)[7],小鼠尾靜脈注射以3 mg/kg為標(biāo)準(zhǔn)[8]。其中,荷瘤對照組只與荷瘤共病抑郁組進(jìn)行小鼠行為學(xué)比較,以判斷胃癌荷瘤共病抑郁小鼠模型是否構(gòu)建成功。

圖1 各組小鼠干預(yù)流程示意圖

1.5 指標(biāo)觀測

1.5.1 小鼠行為學(xué)檢測 分組后第57天,荷瘤對照組(存活小鼠6只)與荷瘤共病抑郁組(存活小鼠3只)進(jìn)行糖水偏好測試、陌生環(huán)境攝食實(shí)驗(yàn),分析兩組小鼠的行為學(xué)變化。

1.5.2 荷瘤小鼠生存曲線 分組后,以第57天為結(jié)點(diǎn),每天觀察、記錄荷瘤共病抑郁組、PD-1抑制劑組、逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組三組小鼠生存情況,采用GraphPad Prism 9軟件繪制小鼠生存曲線。

1.5.3 腫瘤增殖測定 分組后第57天,剝離小鼠皮下瘤體獲得樣本,電子天平稱取瘤重,單位(mg);測量瘤體體積,單位(mm3);計算PD-1抑制劑組、逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組的抑瘤率[9],抑瘤率(%)=(1-治療組平均瘤質(zhì)量/荷瘤共病抑郁組平均瘤質(zhì)量)×100%。

1.5.4 使用ELISA對腫瘤組織IDO、Kyn、AhR進(jìn)行檢測 腫瘤組織IDO檢測:切取腫瘤組織,用超聲波破碎儀將標(biāo)本勻漿,以3 000 r/min離心20分鐘,收集上清進(jìn)行檢測;在已包被好的ELISA反應(yīng)板內(nèi),每孔加入100 μL待測樣品,將反應(yīng)板置37℃120分鐘,用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次,向?yàn)V紙上印干,每孔中加入第一抗體工作液50 μL,將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘,每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL,將反應(yīng)板置37℃60分鐘,每孔加入底物液100 μL,置37℃暗處反應(yīng)10分鐘,每孔加入50 μL終止液混勻,在450 nm處測吸光值。腫瘤組織Kyn、AhR的ELISA檢測按試劑盒說明書進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)操作同上。

1.5.5 免疫組化法檢測小鼠腫瘤組織叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box P3,Foxp3) 收集小鼠腫瘤組織,使用10%甲醛溶液進(jìn)行固定,石蠟包埋,將制備好的蠟塊切片,厚度為2 μm,二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)后,對處理好的切片進(jìn)行一抗染色,37℃孵育3小時,經(jīng)梯度乙醇與二甲苯脫水后封片,使用光學(xué)顯微鏡采圖,以細(xì)胞核或胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽性,并用Image-Pro Pus軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠生存率的情況

荷瘤共病抑郁組存活小鼠3只,生存率為20%,PD-1抑制劑組存活小鼠4只,生存率為26.7%,逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組存活小鼠6只,生存率為40%。逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組生存率高于PD-1抑制劑組(P<0.05),PD-1抑制劑組高于荷瘤共病抑郁組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠生存曲線

2.2 各組小鼠行為學(xué)的比較

糖水偏好率:與荷瘤對照組比較,荷瘤共病抑郁組顯著降低(P<0.01)。攝食潛伏時間:與荷瘤對照組比較,荷瘤共病抑郁組顯著延長(P<0.01)。說明胃癌荷瘤共病抑郁小鼠模型構(gòu)建成功。見表1。

表1 兩組小鼠糖水偏好率、攝食潛伏時間的比較

2.3 各組小鼠瘤體體積、重量及抑瘤率的比較

如表2所示,瘤體體積:與荷瘤共病抑郁組比較,PD-1抑制劑組和逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組均明顯減小(P<0.05,P<0.01);與PD-1抑制劑組比較,逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組明顯減小(P<0.05)。瘤體重量:與荷瘤共病抑郁組比較,PD-1抑制劑組、逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組均顯著降低(P<0.01);與PD-1抑制劑組相比,逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組顯著降低(P<0.01)。剝離各組實(shí)體瘤比較見圖3。提示逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組抑瘤率優(yōu)于PD-1抑制劑組。

表2 各組小鼠腫瘤體積、重量、抑瘤率比較

注:A為荷瘤共病抑郁組,B為PD-1抑制劑組,C為逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組。

2.4 各組小鼠腫瘤組織IDO、Kyn、AhR的表達(dá)

如表3所示,逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組IDO水平顯著低于荷瘤共病抑郁組、PD-1抑制劑組(P<0.01);PD-1抑制劑組Kyn 水平低于荷瘤共病抑郁組(P<0.05),逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組Kyn水平顯著低于荷瘤共病抑郁組和PD-1抑制劑組(P<0.01);與荷瘤共病抑郁組、PD-1抑制劑組比較,逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組AhR水平顯著下降(P<0.01)。

表3 各組小鼠腫瘤組織中IDO、Kyn、AhR水平的比較

2.5 各組小鼠腫瘤組織Foxp3的變化

免疫組化結(jié)果如圖4、表4,PD-1抑制劑組、逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組腫瘤組織中Foxp3表達(dá)均低于荷瘤共病抑郁組(P<0.01);逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑組腫瘤組織中Foxp3表達(dá)低于PD-1抑制劑組(P<0.01)。

表4 各組小鼠腫瘤組織中Foxp3表達(dá)的比較

圖4 各組腫瘤組織Foxp3蛋白表達(dá)情況(×400)

3 討論

3.1 IDO與抑郁癥

色氨酸(tryptophan,Trp)是人體的必需氨基酸,其代謝途徑包括參與蛋白質(zhì)合成;生成5-羥色胺并代謝為褪黑素;在IDO的催化下代謝為Kyn及其衍生物。IDO廣泛分布于大腦、免疫器官、肺、腎等,是犬尿氨酸通路的重要限速酶,正常條件下呈低活性,當(dāng)機(jī)體處于炎癥或應(yīng)激狀態(tài)時,均可引起下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸激活、血清皮質(zhì)醇上調(diào),導(dǎo)致白介素(interleukin,IL)-6釋放,促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)IDO活性增加,促使Trp代謝為Kyn,導(dǎo)致5-HT、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成減少進(jìn)而誘發(fā)抑郁的發(fā)生[10]。另一方面,Kyn/Trp比值也是犬尿氨酸通路激活的第一步,研究發(fā)現(xiàn),血漿Kyn/Trp比值與炎癥因子有關(guān)[11],并且關(guān)聯(lián)于快感缺乏及抑郁嚴(yán)重程度[12]。本課題小組在前期的動物實(shí)驗(yàn)中也證明IDO信號通路與抑郁癥密切相關(guān)[5]。

3.2 IDO與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)

IDO在健康組織中表達(dá)水平極低,但在腫瘤組織中表達(dá)顯著增強(qiáng),導(dǎo)致局部Trp耗竭,同時產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物L(fēng)-犬尿酸和吡啶甲酸,形成了Trp耗竭和毒性產(chǎn)物堆積的“腫瘤微環(huán)境”[13],在這種微環(huán)境中,大量Trp在IDO的作用下分解成Kyn,而Kyn可激活A(yù)hR,AhR進(jìn)而誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的增殖[14]及大量分化,Treg細(xì)胞可通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子等直接抑制效應(yīng)T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞活性;同時,Treg細(xì)胞通過穿孔素、顆粒酶等途徑介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸[15];另外,Treg細(xì)胞高表達(dá)的CD25可與T細(xì)胞競爭性的結(jié)合IL-2,而IL-2是促進(jìn)T細(xì)胞活化的重要因子,從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化與增值[16]。又能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞中PD-1的表達(dá),進(jìn)而影響CD8+T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[17],最終導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。另一方面,Treg細(xì)胞通過細(xì)胞膜表面?zhèn)鬟f抑制信號CTLA-4分子和分泌干擾素-γ等再次刺激樹突狀細(xì)胞上調(diào)IDO,自此形成一個惡性循環(huán),即以IDO為核心的,抑郁與腫瘤免疫逃逸共存的一個發(fā)病機(jī)制[18]。Foxp3是Treg細(xì)胞的標(biāo)志性分子,本實(shí)驗(yàn)顯示逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑較單純PD-1抑制劑能更好的降低小鼠腫瘤組織內(nèi)的Foxp3水平,抑制Treg細(xì)胞的分化與活性,從而有可能打破該惡性循環(huán)。

本次研究選用治療“郁證”的代表方劑逍遙散作為PD-1抑制劑的增敏劑,發(fā)現(xiàn)逍遙散聯(lián)合PD-1抑制劑較單純使用PD-1抑制劑能更有效提高胃癌荷瘤共病抑郁小鼠的生存率,減少小鼠瘤體體積及重量,其增敏機(jī)制應(yīng)與逍遙散可降低IDO、Kyn、AhR水平從而抑制Treg細(xì)胞活性有關(guān)。本項目組成員在長期的腫瘤臨床治療工作中,發(fā)現(xiàn)許多治療效果欠佳的患者絕大部分都存在情志問題,從中醫(yī)七情致病觀點(diǎn)出發(fā),腫瘤的發(fā)病轉(zhuǎn)歸一定參雜諸多情志因素。因此,我們認(rèn)為腫瘤也屬于心身疾病,其情志通過影響腫瘤免疫進(jìn)而影響病情轉(zhuǎn)歸。此研究初步闡明了抑郁與腫瘤之間纏綿的關(guān)系,提示人們在臨床決策中應(yīng)重視情志因素,該思路具有潛在和廣闊的臨床運(yùn)用前景。