LED 光源照射及PI3K 抑制劑對人視網膜色素上皮細胞自噬和凋亡的影響

師若迪 徐晨 李娟 俞洋

光是生命活動所必需的，隨著社會的發展，人造光的出現使人類在沒有自然光的情況下依然能夠繼續進行社會活動[1]。LED 燈由于其優異的光照效率、低耗能、可控性強、使用便利、壽命長等諸多優點，已成為主流照明光源之一[2]。與傳統照明燈相比，LED燈在較短的波長下可以發出更多的能量。隨著LED燈的普及和越來越多的人暴露于LED 燈的時間延長，LED 光源能量會被更多的傳輸到視網膜上，對視網膜細胞造成的光化學損傷也相應增加[3]。視網膜色素上皮（retinal pigment epithelial, RPE）細胞是單層上皮細胞，分布于神經視網膜下方，它與光感受器和下面的脈絡膜密切接觸和相互作用，RPE 細胞在視網膜中具有多種功能，其中包括光感受器外節的吞噬作用[4]。研究表明光感受器變性是最常見的致盲原因之一，它可以導致視網膜病變和不可逆性的視力喪失[5]，加速遺傳性疾病的發生，如年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）[6]。隨著人口老齡化進程的加快，AMD 患病率呈現逐年上升趨勢，預計到2040 年全球AMD 患病人數將增至2.88 億[7]。AMD 是一種由多因素引起的視網膜神經退行性疾病，其中暴露在短波長的光下可能會導致該病的發生[8]。目前AMD 確切的發病機制尚不明確，已知自噬參與調控AMD 發病機制中的所有細胞死亡途徑[9]，且光損傷是導致AMD 的重要危險因素[8]。為進一步探討LED 光源照射及磷脂酰肌醇3 激酶（phosphaticylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑對RPE 細胞自噬和凋亡的影響，本研究使用PI3K 抑制劑LY294002 對RPE 細胞進行預處理，再觀察RPE細胞的自噬和凋亡的變化，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 人RPE 細胞ARPE-19（貨號：iCell-h020，中國北納生物公司）。FBS、DMEM/F12（貨號：10099141、11330032，美國Gibco 公司）；紅色熒光蛋白（monomeric red fluorescent protein，mRFP）-綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）-微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）雙熒光質粒（貨號：SGXM2022LA879，生工生物工程上海股份有限公司）；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（貨號：C0009S，上海碧云天生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：BB-4101，上海貝博生物科技有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒（貨號分別為P0100、89900，賽默飛世爾科技有限公司）；LY294002（規格：5 mg/瓶，貨號：HY-10108，美國MCE公司）；Mouse Anti-LC3Ⅰantibody、LC3Ⅱantibody、芐氯素1（Beclin 1）antibody（貨號分別為bsm-33309M、bs-4843R、bsm-33323M，北京博奧森生物技術有限公司）；SQSTM1/p62 antibody（貨號：AF5384，中國Affinity公司）。TES-1332A 數位式照度計（中國臺北泰仕電子工業）；酶標儀（型號：RT-6000，深圳雷杜生命科學股份有限公司）；分選型流式細胞儀（型號：BD FACS Aria Ⅱ，美國BD 公司）；透射電子顯微鏡（型號：JEM-1400Flash，日本電子株式會社）；奧林巴斯熒光倒置顯微鏡（型號：IX73，日本Olympus 公司）；奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡（型號：FV3000，日本Olympus 公司）。

1.2 細胞培養 取3 代人ARPE-19 細胞復蘇，配置含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12 的完全培養基，將細胞種于25T 培養瓶，隨后放進37 ℃、5% CO2培養箱中培養，間隔1～2 d 換液1 次，等到細胞融合度達到90%時消化細胞，進行1∶3 傳代，取4～5 代對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞分組與人RPE 細胞光損傷模型的建立 體外培養人ARPE-19 細胞隨機分為6 h 對照組、6 h 模型組、6 h LY294002 組，12 h 對照組、12 h 模型組、12 h LY294002 組，24 h 對照組、24 h 模型組、24 h LY294002組。對照組避光培養；模型組進行光照刺激；LY294002組中加入10 mmol/L LY294002 后進行光照刺激。將LED 冷光燈作為光源，懸掛在培養箱內頂端，垂直照射細胞，使用TES-1332A 數位式照度計監測光照強度，控制被照細胞光照強度在（16 500±500）lx 范圍內，分別照射細胞6、12 和24 h。細胞在接受光照時，需要控制表面溫度在36.5～37.5 ℃，以防止細胞光熱損傷的發生。

1.4 細胞存活率檢測 采用MTT 法。取對數生長期的ARPE-19 細胞用胰酶消化后，按每孔約5 000 個細胞密度接種于96 孔板中，細胞貼壁后，按照分組分別光照6、12 和24 h，光照結束后每孔加入10 mL MTT 溶液，培養箱內孵育4 h，吸取上清液后每孔加入100 mL Formazan 溶解液，繼續培養箱內孵育4 h，顯微鏡下觀察紫色結晶全部溶解，使用酶標儀測定570 nm 波長處吸光度值并計算細胞存活率。

1.5 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。生長狀態良好的ARPE-19 細胞按照分組處理并光照后，吸出舊液，用PBS 洗2 遍，用不含EDTA 的胰酶消化后收集各組細胞于離心管中，加冷PBS 洗滌細胞2 次，用400 mL Annexin V 結合液重新懸浮細胞，隨后加入5 mL Annexin V-FITC 染色液，混勻后4 ℃避光孵育15 min，再加入5 mL PI 染液后避光孵育5 min，使用流式細胞儀檢測。

1.6 細胞超微結構觀察 采用透射電子顯微鏡。光照結束后收集各組細胞，2.5%電鏡用戊二醛500 mL 避光固定，室溫1 h，4 ℃冰箱放置3 h 后，吸出戊二醛，用冷PBS 洗3 遍，再4 ℃冰箱放置30 min。用1%鋨酸固定1 h，PBS 洗2 次，通過梯度乙醇脫水，環氧樹脂滲透包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，隨后在透射電子顯微鏡下觀察細胞超微結構。

1.7 雙熒光mRFP-eGFP-LC3 質粒轉染及自噬流變化觀察 將mRFP-eGFP-LC3 雙熒光質粒轉染ARPE-19細胞中，感染48 h 后，400 倍激光共聚焦顯微鏡下觀察紅色和綠色LC3 的熒光點變化，隨機選取一個視野下所有細胞進行拍照，分析自噬流變化。

1.8 細胞自噬相關蛋白Beclin l、LC3、p62 表達水平檢測 采用Western blot 法。用蛋白裂解液提取各組細胞蛋白，利用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。通過計算機調整后變性，50 mg 上樣，經SDS-PAGE 電泳后，用PVDF 轉膜，加入一抗，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃封閉過夜，TBST 洗滌10 min 3 次，加入HRP 標記的二抗，暗室中加發光液并進行曝光。采用Image J 軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

1.9 統計學處理 采用Graphpad Prism 9.0 統計軟件。計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異統計學意義。

2 結果

2.1 光照對ARPE-19 細胞存活率的影響 與對照組比較，6、12、24 h 模型組細胞存活率均下降（P＜0.05），12、24 h LY294002 組細胞存活率均下降（均P＜0.01）；與模型組比較，12、24 h LY294002 組細胞存活率均升高（均P＜0.05），見圖1。

圖1 光照6、12、24 h 后各組ARPE-19 細胞存活率比較

2.2 光照對ARPE-19 細胞凋亡率的影響 與對照組比較，6、12、24 h 模型組和LY294002 組細胞凋亡率均升高（均P＜0.05），且隨時間增加細胞凋亡率增多；與模型組比較，6、12 h LY294002 組細胞凋亡率均下降（均P＜0.05），見圖2。

圖2 光照對ARPE-19 細胞凋亡率的影響（A：ARPE-19 細胞凋亡的流式圖；B：各組ARPE-19 細胞凋亡率比較）

2.3 光照對ARPE-19 細胞超微結構的影響 與24 h對照組比較，24 h 模型組ARPE-19 細胞在經過光照24 h 后，胞內可見較多的自噬泡，LY294002 干預后也可見聚集性分布的自噬囊泡，提示光照誘導自噬發生，LY294002 可促進自噬的發生，見圖3。

圖3 光照24 h 后各組細胞超微結構比較（A：24 h 對照組；B：24 h 模型組；C：24 h LY294002 組）

2.4 光照對ARPE-19 細胞自噬流變化的影響 在光照6、12、24 h 后，對照組少見自噬溶酶體（紅色亮點）。與對照組比較，模型組于光照6、12、24 h 后，紅色亮點熒光亮度增加，且數量逐漸增多，Merge 圖中從光照12 h 開始黃色亮點（自噬小體）數量增多明顯，提示隨光照時間延長，ARPE-19 細胞中的自噬溶酶體和自噬小體數量開始增加，說明光照可以促進自噬發生。同樣，ARPE-19 細胞經LY294002 干預后，與對照組比較，紅色亮點與黃色亮點呈增多趨勢，說明LY294002 可以誘導自噬，見圖4（插頁）。

圖4 光照對ARPE-19 細胞自噬流變化的影響

2.5 光照對APRE-19 細胞Beclin 1、LC3、p62 蛋白表達的影響 與對照組比較，6、12、24 h 模型組和LY294002組細胞中Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平均升高，p62蛋白表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，6、12、24 h LY294002 組細胞中Beclin 1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表達均升高，12、24 h LY294002 組細胞中p62 蛋白表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。提示隨光照時間的遞增，ARPE-19 細胞的自噬會加強，通過使用LY294002 干預后可能上調ARPE-19細胞自噬，見圖5。

圖5 光照對ARPE-19 細胞自噬相關蛋白的影響（A：電泳圖；B：各組細胞Beclin 1 蛋白表達水平比較；C：各組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對蛋白表達水平比較；D：各組細胞p62 蛋白表達水平比較）

3 討論

AMD 是一種引起黃斑區改變的復雜眼部疾病，黃斑區位于視網膜中部，主要負責中央和精細視力，AMD 會因為光感受器和RPE 細胞的功能下降或死亡而導致視力下降[10]。自噬是一種進化上保守的“自食”過程，在維持細胞內穩態方面起著至關重要的作用。在RPE 中，自噬是動態的過程，是由多種應激刺激引起的重要促進生存的一部分，光誘導損傷就是應激刺激之一，而自噬介導的降解可以是一種降低光吸收能力的手段，從而使光感受器細胞不被光誘導損傷[11]。本研究通過透射電子顯微鏡發現，給予一定時間的光照刺激后，RPE 細胞出現數量多的自噬囊泡，說明光照可誘導自噬的發生。

細胞自噬由自噬相關基因（autophagy-related gene，ATG）調控，LC3（ATG8）蛋白對自噬體的形成至關重要，是一種廣泛使用的自噬泡標志物，最初在酵母中被發現，是吞噬細胞擴張和關閉所必需的。在自噬小體形成中，可溶性LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合將所得LC3Ⅱ束縛在膜上。LC3Ⅱ獨特地定位于自噬泡，從LC3Ⅰ到LC3Ⅱ的轉換是吞噬泡關閉以產生自噬體的關鍵步驟[12]。LC3 的這種轉化，可以通過熒光顯微鏡或Western blot 法進行觀察和檢測。除LC3 外，反映自噬的相關蛋白還有Beclin 1 和p62。Beclin 1 主要的功能是調節自噬，它參與自噬溶酶體形成的初始階段，反映了自噬的誘導水平[13]。p62 作為另一個自噬標志物，可用于確定自噬狀態。自噬激活與p62 蛋白的較低水平有關，而自噬抑制則與p62 的較高水平有關[14]。本研究采用將mRFP-eGFP-LC3 慢病毒質粒轉染人RPE 細胞中，通過激光共聚焦顯微鏡觀察光照后RPE 細胞自噬流的變化，結果發現，將光照時間延長后，mRFP 標記的LC3 的紅色熒光亮點是逐漸增多的，mRFP 紅色熒光與eGFP 綠色熒光融合形成的黃色熒光點的數量也是增多的，說明光照刺激自噬發生，且自噬流是通暢的。結合Western blot 自噬相關蛋白發現，經光照6、12、24 h 后模型組Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平均增加，p62 蛋白表達水平均減少，進一步反映了光照可誘導自噬的發生。

LY294002 是Ⅰ類PI3K 抑制劑，有研究表明抑制Ⅰ類PI3K 有助于自噬的啟動[15-16]，提示LY294002 是自噬的關鍵調節因子。本研究使用LY294002 對RPE 細胞進行預處理，通過透射電子顯微鏡觀察發現光照后RPE 細胞中可見聚集性分布的自噬囊泡；觀察免疫熒光自噬流發現光照后紅色亮點和黃色亮點呈遞增趨勢；Western blot 結果顯示LY294002 組Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ較對照組的表達水平增多，較模型組的表達水平也呈上升趨勢，p62 的表達水平均呈遞減趨勢。表明LY294002 能夠激活并上調自噬，這與前面的研究結果相符。

細胞凋亡是程序化細胞死亡的一種典型機制，在功能上不同于自噬，在許多細胞類型和疾病條件下，自噬的激活會抑制細胞凋亡介導的細胞死亡，而自噬的抑制會激活細胞凋亡過程[17]。然而，在特殊的情況下，細胞凋亡或壞死可能會受到自噬或自噬相關蛋白的誘導[18]。已知病理性的細胞凋亡與AMD 有關[19]。本研究發現RPE 細胞光照6、12、24 h 后，細胞凋亡率要比對照組細胞高，說明光照對RPE 細胞是有損傷的，在給予LY294002 干預后，RPE 細胞的凋亡率雖然較對照組的凋亡率高，但對比模型組的凋亡率要低，說明加入PI3K 抑制劑LY294002 后，RPE 細胞凋亡程度要輕于光損傷所造成的凋亡，這與其他學者的研究結果相類似[20-21]。此外，也有研究發現LY294002 既可以上調自噬水平，同時也可以誘導凋亡[22]。一般來說，相似的刺激似乎可以誘導細胞凋亡或自噬，有的時候雖然可檢測到自噬和凋亡的混合表型對一些常見刺激的反應，但是在許多情況下，自噬和凋亡是以相互排斥的方式發展的，這可能是這兩個過程可變閾值的結果，或者可能是與兩種現象相互抑制有關的兩種反應之間細胞“決定”的結果[23]。

綜上所述，PI3K 抑制劑LY294002 對光照后RPE 細胞自噬和凋亡的影響，探討了在LED 光源照射下RPE細胞的自噬和凋亡之間的關系，結果表明自噬對于AMD 的發生、發展是有一定調節作用的，通過上調自噬，能夠延緩RPE 細胞由于應激刺激所造成的損傷。本研究希望能夠為預防或治療AMD 提供新的觀點和研發思路。