雷酚內酯通過NF-κB 途徑逆轉肺氣管上皮細胞上皮間充質轉化進程的研究

岑夢姣 翁鵬程

哮喘是一種高發病率的慢性病，主要癥狀為氣喘、胸悶等。預計到2025 年，哮喘患者將達到4 億人[1]。氣道重塑是慢性哮喘最典型的病變，其特征是上皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[2]。轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是上皮纖維化的主要介質，在哮喘性支氣管組織中上調，并引發哮喘氣道上皮損傷和EMT 誘導的氣道纖維化[3]。而TNF-α 的存在會破壞抗炎平衡并加重哮喘進展[4]。轉錄因子NF-κB 在過敏性哮喘中被持續激活，抑制NF-κB 可顯著緩解卵清蛋白誘導的哮喘[5]。目前已有許多研究將NF-κB 通路作為哮喘氣道性炎癥的關鍵治療靶點，如鄭巖等[6]發現溴結構域蛋白4 可介導NF-κB/RelA 通路調控EMT 參與哮喘氣道重塑。另外，Huang 等[7]通過氣道平滑肌細胞證明TGF-β 能夠激活NF-κB p65（p65）及其磷酸化水平，并促進細胞遷移及EMT。根據以上研究結果，推測NFκB 在哮喘疾病氣道重塑過程中可能起到關鍵作用。

雷酚內酯是從雷公藤中分離得到的二萜類成分，具有較強的免疫抑制活性。已有研究報道雷酚內酯能夠緩解大鼠腎間質纖維化并抑制炎癥因子的釋放[8]。這與哮喘疾病的治療機制不謀而合。因此，本研究利用TGF-β 及TNF-α 聯合誘導人支氣管肺上皮細胞氣道重塑模型，觀察雷酚內酯的治療效果，同時探討雷酚內酯對NF-κB 通路及EMT 的調控作用，為治療哮喘早期的氣道重塑提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑和儀器 人支氣管肺上皮細胞系Beas-2b 購自浙江如耀生物科技有限公司。10% FBS（批號：10099-141）、DMEM 培養基（批號：12491015）均購自美國Gibco 公司；雷酚內酯（5 mg 粉劑裝，Cas 號：74285-86-2，純度：98%，溶解于二甲基亞砜）、TGF-β1試劑盒（批號：H980365）均購自上海麥克林試劑有限公司；TNF-α 試劑盒（批號：SEKH-0047）購自北京索萊寶有限公司；1st Strand cDNA Synthesis Kit gDNA Purge 試劑盒（批號：E042）、SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（批號：E096）均購自蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司；細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）（批號：CK04）購自日本Dojindo 公司；兔抗人α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）（批號：ab124964）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin，批號：ab40772）、波形蛋白（Vimentin，批號：ab92547）、p65（批號：ab32536）、磷酸化p65（phosphorylated- p65，p-p65）（批號：ab76302）、Twist 家族BHLH 轉錄因子1（twist family BHLH transcription factor 1，TWIST1）（批號：ab50581）、鋅指E-Box 綁定同源盒1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）（批號：ab203829）、Snail 家族鋅指1（snail family zinc finger 1，SNAI1）（批號：ab180714）、山羊抗兔IgG-HRP 二抗（批號：ab6721）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號：ab181602）抗體均購自美國Abcam 生物公司；化學發光底物試劑盒（批號：SB-WB001）購自上海圣爾生物；倒置熒光顯微鏡（型號：CKX53）購自日本Olympus 公司；相差顯微鏡（型號：DMIL LED）和熒光正置顯微鏡（型號：DM500）均購自德國Leica 公司；實時熒光定量PCR 儀（型號：7500F）購自美國ABI公司；多功能酶標儀（型號：Varioskan LUX）購自美國Thermo 公司；蛋白成像儀（型號：ChemiDoc-It Imaging System）購自美國UVP 公司。

1.2 細胞培養和處理 Beas-2b 細胞接種于含10% FBS 的DMEM 培養基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。分別用10 ng/mL TGF-β1和10 ng/mL TNF-α處理Beas-2b 細胞進行模型誘導[9]。

1.3 細胞活性檢測 采用CCK-8 法。將Beas-2b 細胞以3 000 細胞/孔的密度接種到96 孔板中，貼壁24 h后，分別給予終濃度為0、0.5、1、10、20、30、40 μmol/L的雷酚內酯處理細胞，每個濃度5 個復孔。48 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃避光孵育2 h。使用多功能酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度（optical density，OD）值。細胞活性（%）=（OD加藥-OD空白）/（OD零加藥-OD空白）×100%。根據雷酚內酯對Beas-2b 的活性影響，選擇1 和10 μmol/L 雷酚內酯作為后續細胞實驗的藥物處理濃度。

1.4 細胞分組 將Beas-2b 細胞分為對照組、模型組、1 μmol/L 雷酚內酯組和10 μmol/L 雷酚內酯組4 組。對照組：Beas-2b 細胞不作任何處理；模型組：Beas-2b 細胞給予10 ng/mL TGF-β1 聯合10 ng/mL TNF-α 處理48 h；1 和10 μmol/L 雷酚內酯組：Beas-2b 細胞在模型組基礎上，再分別添加終濃度為1、10 μmol/L 雷酚內酯共孵育48 h，然后使用相差顯微鏡觀察各組細胞形態變化。

1.5 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。將Beas-2b細胞以1×106個接種在6 cm 培養皿中，待細胞長滿后，在細胞培養皿中按照直線采用200 μL的槍頭進行細胞劃痕，槍頭經過的部位細胞被去除，按照上述實驗分組進行細胞處理。在培養皿蓋上標記3 個點，并在0 和48 h后通過相差顯微鏡觀察標記部位細胞遷移距離。

1.6 EMT 相關蛋白α-SMA、E-cadherin、Vimentin 熒光強度檢測 采用免疫熒光實驗。將Beas-2b 細胞接種到6 孔板中，完全貼壁后按照實驗分組進行處理。用4%多聚甲醛在室溫下固定細胞15 min。然后，將細胞在0.5% Triton X-100 中孵育10 min。再用1% BSA 封閉30 min。然后使用兔抗人α-SMA、E-cadherin 及Vimentin抗體在4 ℃下孵育過夜。第2天將細胞與FITC標記的山羊抗兔二抗在黑暗中孵育1 h，再使用0.1 μg/mL DAPI 孵育細胞10 min。在熒光顯微鏡下拍攝細胞熒光圖，曝光時長控制在35 ms。通過Image Pro Plus 6.0 軟件對細胞熒光圖熒光強度進行量化統計。

1.7 EMT相關基因α-SMA、E-cadherin、Vimentin mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR 法。通過Trizol 法提取細胞總RNA 后，使用1st Strand cDNA Synthesis Kit gDNA Purge 試劑盒將2 μg mRNA 反轉錄成cDNA。RT-PCR 采用SYBR qPCR SuperMix Plus 試劑盒構建體系，并在實時熒光定量PCR 儀運行程序，反應條件如下：95 ℃變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，共40 個循環；72 ℃延伸30 s。以GAPDH 為內參，使用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。擴增引物通過NCBI 在線網站設計，引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列（5'-3'）

1.8 EMT 相關蛋白α-SMA、E-cadherin、Vimentin 及EMT 相關轉錄因子p65、p-p65、TWIST1、ZEB1、SNAI1蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。收集細胞用PBS 洗滌3 次，然后用含有1%蛋白酶抑制劑混合物的100 μL RIPA 裂解液在冰上裂解30 min。13 000 r/min離心20 min 后，收集上清液，用BCA 檢測試劑盒檢測每個樣品的蛋白質濃度。5 μg 變性蛋白質在SDSPAGE 凝膠中電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，將膜與一抗α-SMA、E-cadherin、Vimentin、p65、p-p65、TWIST1、ZEB1、SNAI1 及GAPDH 抗體在4 ℃孵育過夜。用TBST 清洗3 次后再與山羊抗兔IgG-HRP 二抗在室溫下孵育1 h。再用TBST 清洗3 次后，使用化學發光底物試劑盒和蛋白成像儀對蛋白條帶進行顯影和曝光拍攝。使用Image J 軟件計算各個條帶的光密度值。

1.9 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0 統計軟件。所有實驗均重復3 次。符合正態分布的計量資料以表示，方差齊時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗；方差不齊時，組間比較采用Welch 方差分析，兩兩比較采用t'檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷酚內酯對細胞活性的影響 與0 μmol/L 雷酚內酯組比較，1 和10 μmol/L 雷酚內酯處理后，細胞活性均提高（均P＜0.05），而20 μmol/L 以上濃度雷酚內酯處理后，細胞活性呈現下降趨勢，且在30 和40 μmol/L時候細胞活性明顯抑制（均P＜0.05），見表2。因此，使用1和10 μmol/L雷酚內酯作為后續實驗主要濃度。

表2 不同濃度雷酚內酯對Beas-2b 細胞活性的影響（%）

2.2 雷酚內酯對細胞形態學的影響 在相差顯微鏡觀察下，對照組細胞呈典型的上皮樣細胞形態，而其他3 組細胞呈長梭形間充質樣細胞形態，見圖1。

圖1 雷酚內酯處理后4 組細胞形態的比較

2.3 雷酚內酯對細胞遷移能力的影響 與對照組的（128±36）μm 比較，模型組細胞遷移距離（748±65）μm 變長，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L 雷酚內酯組和10 μmol/L 雷酚內酯組細胞遷移距離[（388±42）和（366±51）μm]均變短，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖2。

圖2 雷酚內酯處理后4 組細胞遷移能力的比較

2.4 雷酚內酯對EMT 相關蛋白熒光強度的影響 與對照組比較，模型組細胞α-SMA 和Vimentin 蛋白熒光強度均上調，而E-cadherin 蛋白熒光強度下調，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L雷酚內酯組和10 μmol/L 雷酚內酯組α-SMA、Vimentin蛋白熒光強度均下調，而E-cadherin 蛋白熒光強度上調，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表3 和圖3（插頁）。

圖3 雷酚內酯處理后4 組EMT 相關蛋白的免疫熒光圖

表3 雷酚內酯對EMT 相關蛋白熒光強度的影響

2.5 雷酚內酯對EMT 相關基因表達水平的影響 與對照組比較，模型組細胞α-SMA 和Vimentin mRNA 表達水平均上調，而E-cadherin mRNA 表達水平下調，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L 雷酚內酯組和10 μmol/L 雷酚內酯組α-SMA和Vimentin mRNA 表達水平均下調，而10 μmol/L 雷酚內酯組E-cadherin mRNA 表達水平上調，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表4。

表4 雷酚內酯對EMT 相關基因表達水平的影響

2.6 雷酚內酯對EMT 相關蛋白表達水平的影響 與對照組比較，模型組細胞α-SMA 和Vimentin 蛋白表達水平均上調，而E-cadherin 蛋白表達水平下調，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L雷酚內酯組和10 μmol/L 雷酚內酯組α-SMA、Vimentin蛋白表達水平均下調，而E-cadherin 蛋白表達水平上調，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表5 和圖4。

圖4 雷酚內酯處理后4 組細胞EMT 相關蛋白表達的電泳圖

表5 雷酚內酯對EMT 相關蛋白表達水平的影響

2.7 雷酚內酯對EMT 相關轉錄因子的影響 與對照組比較，模型組細胞p-p65、TWIST1、ZEB1、SNAI1 蛋白表達水平均上調，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與模型組比較，1 μmol/L雷酚內酯組和10 μmol/L雷酚內酯組p-p65、TWIST1、ZEB1、SNAI1 蛋白表達水平均下調，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表6和圖5。

圖5 雷酚內酯處理后4 組細胞EMT 相關轉錄因子蛋白表達的電泳圖

表6 雷酚內酯對EMT 相關轉錄因子的影響

3 討論

哮喘是一種常見的氣道炎癥疾病，目前的治療方法多是針對氣道炎癥和惡化，并不針對氣道重塑，導致部分患者的病情仍會繼續發展并出現不可逆轉的氣道損傷，引起氣流受限、氣道狹窄和氣道高反應[10]。EMT 是一個與組織重塑相關的復雜過程，表現為上皮細胞喪失細胞黏附功能和細胞極性，從而獲得間充質樣細胞遷移和侵襲能力，在此過程中，上皮細胞的生物標志物（如E-cadherin）受到抑制，而間充質標志物（如Vimentin 和α-SMA）被上調[11]。有研究表明，氣道重塑在哮喘的發病機制中發揮重要作用，而EMT 則積極參與哮喘的氣道重塑，抑制EMT 過程可能減緩哮喘患者的氣道重塑[12-14]。據此，本研究主要針對哮喘患者氣道重塑特征進行探索性治療，并通過細胞層面驗證雷酚內酯對氣道上皮細胞EMT 的抑制作用，從而探究雷酚內酯在哮喘治療中的潛在功效。

氣道重塑的典型特征是氣道平滑肌層增厚，氣道上皮下方基質沉積，導致上皮下纖維化，整個細胞呈現明顯的長梭形間充質樣形態[15]。在本研究中，通過給予氣管上皮細胞TGF-β 及TNF-α 刺激后，可使得細胞發生長梭形變化，這與既往研究結果一致，提示氣道重塑模型誘導成功。氣道重塑的另一重要表征是細胞遷移能力增強，在哮喘與肺上皮細胞EMT 導致的氣道重塑研究中，發現劃痕實驗中細胞的遷移距離有所增加，這是因為在EMT 過程中，E-cadherin 的下調以及Vimentin 上調，讓細胞間的黏附性降低，使其獲得了較高的運動能力[16-18]。本研究結果也證實了這一現象，即Beas-2b 細胞在TGF-β 和TNF-α 誘導下，EMT進程加劇，并獲得較高遷移能力；但在雷酚內酯處理后，其遷移能力受到顯著抑制，并且雷酚內酯濃度越高，抑制程度越強。進一步通過免疫熒光、RT-PCR 及Western blot 驗證EMT 相關蛋白發現，雷酚內酯處理后Vimentin 和α-SMA 表達水平明顯下調，而E-cadherin表達水平則有一定程度上調，這說明雷酚內酯可以緩解由TGF-β 及TNF-α 誘導的Beas-2b 的EMT 進程，即可能減輕哮喘患者氣道重塑病理癥狀。而雷酚內酯對上述蛋白的調控可能是通過影響其上游的轉錄因子的表達實現的，但這仍需要進一步的實驗驗證。

NF-κB 是一類重要的核轉錄調控因子，能調節TNF 和多種與哮喘發病機制關系密切的促炎因子的轉錄和表達。Ijaz 等[19]發現NF-κB 是TGF-β 誘導上皮細胞EMT 的主要介質，TGF-β 可通過激活NF-κB，致使絲氨酸276 磷酸化，進而介導NF-κB 發生核易位。在細胞核中，NF-κB 通過與EMT 核心調節因子（包括SNAI1、Twist1 家族和ZEB1）結合并激活其表達，直接上調其基因表達水平[20]。上述轉錄因子被激活時能夠使維持上皮狀態基因的表達受到抑制，如E-cadherin基因；同時，隨著α-SMA 和Vimentin 的激活，細胞則會獲得部分間充質表型[21-22]。研究表明，當NF-κB 失活時，氣道平滑肌細胞的遷移和增殖均會受到抑制，從而抑制氣道重塑和氣道炎癥[23]。本研究發現，雷酚內酯對NF-κB 的磷酸化水平以及ZEB1、SNAI1 和TWIST1蛋白的表達水平具有下調作用，這與Chen 等[24]的結果類似，他們在利用從雷公藤中提取的另一種化合物雷公藤甲素，治療卵清蛋白致敏小鼠時，發現雷公藤甲素可降低p65 的磷酸化，抑制氣道內壁增厚。因此，筆者推測雷酚內酯對TGF-β 聯合TNF-α 誘導的細胞EMT 抵抗作用可能是通過抑制NF-κB 來調控EMT 相關轉錄因子的活性實現的。

綜上所述，本研究證實雷酚內酯可防止由TGF-β和TNF-α 引起的EMT 進程，但仍存在一些不足之處，例如并未在哮喘動物模型中作進一步的驗證；同時，缺少較為合適的NF-κB 激動劑進行功能回復實驗，因此，本課題組在下一步將考慮構建過表達NF-κB細胞系作進一步的機制探索，以彌補實驗中存在的欠缺。