姜黃素調(diào)控miR-134對(duì)癲癇海馬突觸重塑的實(shí)驗(yàn)研究

徐春強(qiáng) 林青 劉素芝

癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）是神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)的急危重癥，癲癇反復(fù)發(fā)作可造成腦組織和腦功能?chē)?yán)重?fù)p害，其中苔蘚纖維出芽[1]和突觸重塑是最普遍的病理學(xué)改變。miRNA 是一種具有轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用的保守的內(nèi)源性非編碼RNA，在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)豐富[2]。miR-134 作為特異性表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA，與樹(shù)突棘形態(tài)改變、突觸的重塑和突觸蛋白合成關(guān)系密切[3]。SE 小鼠海馬組織中miR-134 表達(dá)水平明顯上調(diào)，抑制miR-134 表達(dá)后，可明顯控制癲癇發(fā)作，發(fā)揮明顯的抗癲癇發(fā)作以及神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]。姜黃素是來(lái)源于植物根莖的多酚化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用[6-9]，且這些作用的機(jī)制與姜黃素調(diào)控miRNA 表達(dá)密切相關(guān)[10-12]。大量研究均提示姜黃素在多種癲癇動(dòng)物模型中有明確的神經(jīng)保護(hù)及潛在的抗癲癇作用，但其作用機(jī)制復(fù)雜多樣且未完全闡明，miRNA 可能是姜黃素治療癲癇的一個(gè)重要靶點(diǎn)[13-15]。本實(shí)驗(yàn)主要研究姜黃素治療SE 大鼠后其miR-134 及靶蛋白LIM 激酶1（LIM kinase 1，LIMK1）表達(dá)規(guī)律及海馬突觸重塑情況，探討姜黃素通過(guò)調(diào)控miR-134 發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)及潛在抗癲癇作用的機(jī)制，為姜黃素的臨床應(yīng)用提供新的理論方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD 雄性大鼠48 只，6～8 周齡，體重180～220 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2019-0030。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：TZY-2022153）。

1.2 主要試劑 氯化鋰（粉劑，批號(hào)：310468）、匹羅卡品（粉劑，批號(hào)：P6503）和姜黃素（粉劑，批號(hào)：MKCD2451）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；溴化甲基阿托品（批號(hào)：H41021257）購(gòu)自天津藥業(yè)集團(tuán)；Timm 染色液配制相關(guān)試劑、miR-134 引物和U6 引物均購(gòu)自上海生工公司；Trizol 試劑（批號(hào)：G3013-100ML）、qRT-PCR 試劑盒（批號(hào)：G3330-50）均購(gòu)自武漢賽維爾生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：K1622）購(gòu)自美國(guó)Biomiga 公司；兔抗LIMK1 多克隆抗體（批號(hào)：PB0756）購(gòu)自武漢博士德公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗以及蛋白免疫印跡相關(guān)試劑購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、癲癇組和姜黃素組3 組，每組16 只。姜黃素組：腹腔注射氯化鋰（125 mg/kg，2.5 g 溶于20 mL 0.9%氯化鈉注射液中，1 mL/kg），18～20 h 后腹腔注射溴化甲基阿托品（10 mg/kg，300 mg 溶于30 mL 0.9%氯化鈉注射液中，1 mL/kg），30 min 后腹腔注射匹羅卡品（20 mg/kg，400 mg 溶于20 mL 0.9%氯化鈉注射液中，1 mL/kg），10～30 min 后大鼠出現(xiàn)反復(fù)強(qiáng)直陣攣發(fā)作并最終形成SE（根據(jù)Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，4 級(jí)以上發(fā)作即認(rèn)為處于SE），建立大鼠SE 模型，進(jìn)行行為學(xué)觀察，持續(xù)1 h 后腹腔注射溴化甲基阿托品1 mL/kg 和10%水合氯醛3 mL/kg 終止發(fā)作。第2 天開(kāi)始每天固定時(shí)間腹腔注射姜黃素[100 mg/kg，0.5 g 溶于10 mL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，2 mL/kg]，持續(xù)給藥10 d。癲癇組：建模及終止發(fā)作方法同上，第2天開(kāi)始每天固定時(shí)間腹腔注射DMSO 溶液（2 mL/kg），持續(xù)給藥10 d。對(duì)照組：腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（1 mL/kg），18～20 h 后腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（1 mL/kg），30 min 后腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（1 mL/kg），1 h 后分別予腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（1 mL/kg）和0.9%氯化鈉注射液（3 mL/kg）；第2 天開(kāi)始每天固定時(shí)間腹腔注射DMSO 溶液（2 mL/kg），持續(xù)給藥10 d。每日觀察大鼠活動(dòng)情況。在造模后第14 天，通過(guò)頸椎脫臼法處死3 組大鼠，每組隨機(jī)各取10 只制備冰凍海馬組織切片用于Timm 染色，每組剩余6 只留取海馬組織及血清用于qRT-PCR 及Western blot 檢測(cè)。

1.4 大鼠海馬組織苔蘚纖維出芽程度檢測(cè) 采用Timm 染色。將大鼠海馬組織切片染色前通風(fēng)櫥內(nèi)過(guò)夜晾干，把新鮮配制的Timm 染色液倒入染色盒中，放入切片，在26 ℃恒溫?fù)u床中孵育60～120 min，避光環(huán)境下孵育60～120 min，蒸餾水中沖洗15 min，常規(guī)脫水、透明及封片。光鏡下進(jìn)行齒狀回及CA3 區(qū)苔蘚纖維出芽評(píng)分。（1）齒狀回顆粒細(xì)胞上層評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0 分，嵴和尖端間無(wú)顆粒；1 分，偶見(jiàn)散在的棕黃色或棕褐色斑片狀顆粒；2 分，較多的棕黃色或棕褐色斑片狀顆粒；3 分，接近幾乎連續(xù)分布的棕黃或棕褐色顆粒；4分，連續(xù)或幾乎連續(xù)分布的高密度棕黃色或棕褐色顆粒；5 分，嵴到尖端連續(xù)分布的高密度棕黃色或棕褐色顆粒。（2）CA3 區(qū)錐體細(xì)胞層或始層評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，錐體細(xì)胞層及始層無(wú)明顯顆粒分布；1 分，偶見(jiàn)稀疏的散在棕黃色或棕褐色顆粒；2 分，偶見(jiàn)至中等數(shù)量的棕黃色或棕褐色顆粒；3 分，明顯的棕黃色或棕褐色顆粒分布；4 分，可見(jiàn)明顯棕黃色或棕褐色顆粒，接近于沿整個(gè)CA3 區(qū)連續(xù)分布；5 分，濃密的棕黃色或棕褐色顆粒沿整個(gè)CA3 連續(xù)分布[16]。

1.5 大鼠海馬組織及血清中miR-134 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。使用Trizol 試劑從3 組大鼠海馬組織及血清中分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以U6 為內(nèi)參；miR-134 的引物序列：上游引物5'-CCGCGTGTGACTGGTTGACCA-3'，下游引物5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；U6 的引物序列：上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應(yīng)體系：SYBR Green I Master 10.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，DNA 模板2.0 μL，RNase-Free H2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃15 s、60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。qRT-PCR 反應(yīng)根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每組均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-134 相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 大鼠海馬組織中LIMK1 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。從-80 ℃冰箱取出部分海馬組織勻漿后，4 ℃、13 000 r/min 離心5 min，取上清液。然后用BCA 法檢測(cè)上清液中蛋白質(zhì)的濃度，將上清液與5×SDS 樣品緩沖液混合，在沸水浴中加熱5 min，使蛋白變性；之后將變性蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，與LIMK1 一抗（1∶1 000）在4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST 沖洗膜3 次，10 min/次，室溫下在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）中孵育1 h。TBST 洗滌后在暗室中曝光顯影，使用Quantity One 凝膠分析軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）條帶的灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠海馬組織苔蘚纖維出芽程度評(píng)分比較對(duì)照組大鼠海馬組織苔蘚纖維出芽不明顯，齒狀回顆粒細(xì)胞上層及CA3 區(qū)錐體細(xì)胞層及始層偶見(jiàn)或未見(jiàn)少許苔蘚纖維染色顆粒。癲癇組大鼠CA3 區(qū)苔蘚纖維出芽明顯，染色纖維形成致密濃染條帶，齒狀回苔蘚纖維出芽亦存在。姜黃素組大鼠CA3 區(qū)苔蘚纖維出芽程度較癲癇組減輕，染色顆粒濃密程度減輕，偶見(jiàn)散在的棕黃色或棕褐色斑片狀顆粒；齒狀回的苔蘚纖維出芽程度亦較癲癇組減輕，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。與對(duì)照組比較，癲癇組大鼠齒狀回和CA3 區(qū)苔蘚纖維出芽程度評(píng)分均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與癲癇組比較，姜黃素組大鼠齒狀回和CA3 區(qū)苔蘚纖維出芽程度評(píng)分均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 3 組大鼠海馬組織病理學(xué)Timm 染色圖

表1 3 組大鼠海馬苔蘚纖維出芽程度評(píng)分（分）

2.2 3 組大鼠海馬組織中miR-134 表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，癲癇組大鼠海馬組織中miR-134 表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與癲癇組比較，姜黃素組大鼠海馬組織中miR-134 水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 3 組大鼠海馬組織中miR-134 表達(dá)水平比較

2.3 3 組大鼠血清中miR-134 表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，癲癇組和姜黃素組大鼠血清中miR-134 表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；癲癇組和姜黃素組大鼠血清中miR-134 表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 3 組大鼠血清中miR-134 表達(dá)水平比較

2.4 3 組大鼠海馬組織中LIMK1 蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，癲癇組大鼠海馬組織中LIMK1 蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與癲癇組比較，姜黃素組大鼠海馬組織中LIMK1 蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 3 組大鼠海馬組織中LIMK1 蛋白表達(dá)水平比較（A：電泳圖；B：柱狀圖，與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與癲癇組比較，bP＜0.05）

3 討論

SE 是神經(jīng)內(nèi)科較常見(jiàn)的急癥，如何有效治療SE是目前亟待解決的難題。苔蘚纖維出芽越過(guò)齒狀回顆粒細(xì)胞層進(jìn)入內(nèi)分子層，大多在此與顆粒細(xì)胞的樹(shù)突棘形成單突觸聯(lián)系，這些異位突觸引起的突觸重塑導(dǎo)致海馬內(nèi)回返性的興奮性環(huán)路形成，并以正反饋的形式出現(xiàn)，最終導(dǎo)致癲癇長(zhǎng)期自發(fā)性反復(fù)發(fā)作[1，17]。以苔蘚纖維出芽為主要形式的突觸重塑及異常神經(jīng)環(huán)路形成可能與癲癇發(fā)作互為因果，形成惡性循環(huán)導(dǎo)致癲癇發(fā)作。miRNA 是內(nèi)源性非編碼RNA，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)豐富，抑制或者降解目標(biāo)mRNA，進(jìn)而抑制靶蛋白的翻譯，最終產(chǎn)生基因調(diào)控作用[18]。研究顯示miRNA 在神經(jīng)元的增殖、分化、遷移，樹(shù)突棘的形成和成熟，軸突引導(dǎo)，突觸可塑性調(diào)節(jié)等方面參與神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能改變[19]。因此，通過(guò)靶向調(diào)控miRNA及其通路可能成為新的治療靶點(diǎn)。

miR-134 是定位于樹(shù)突的大腦特異性miRNA，在神經(jīng)元增殖、分化、凋亡及神經(jīng)元微觀結(jié)構(gòu)改變中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-134 在大鼠海馬神經(jīng)元中高表達(dá)，通過(guò)LIMK1 對(duì)樹(shù)突棘大小起負(fù)向調(diào)節(jié)作用[3]。小鼠模型中miR-134 特異性拮抗劑增大樹(shù)突棘體積，減輕癲癇發(fā)作程度，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[5]。隨后在其他動(dòng)物模型及癲癇患者中也檢測(cè)到miR-134 水平的上調(diào)[20]。在無(wú)鎂細(xì)胞外液誘導(dǎo)癲癇細(xì)胞模型中miR-134 表達(dá)升高，miR-134 抑制劑預(yù)處理后可以減輕神經(jīng)元高興奮性，神經(jīng)元樹(shù)突棘密度減少[21]。上述實(shí)驗(yàn)表明抑制miR-134，能夠減輕SE 發(fā)作程度，降低發(fā)作頻率，具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)制備的SE 大鼠模型中，大鼠海馬組織中miR-134 水平升高，靶蛋白LIMK1 水平下降，這與多數(shù)研究結(jié)果相符。但本實(shí)驗(yàn)也存在不足之處：未進(jìn)行樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察，無(wú)法直接證明miR-134 是否通過(guò)LIMK1 影響樹(shù)突棘的大小、密度等結(jié)構(gòu)及功能改變；未行miR-134 特異性拮抗來(lái)證明其與下游靶點(diǎn)之間的直接關(guān)系，需后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。

綜上所述，姜黃素治療可抑制大鼠SE 后海馬組織中miR-134 表達(dá)，上調(diào)LIMK1 蛋白表達(dá)水平，影響突觸重塑，可能因而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)及潛在的抗癲癇作用。