Kartogenin促進肩袖損傷修復小鼠模型腱-骨愈合的作用及機制

徐天波 劉德國 張頡鴻 鄭宇翔 侯振海

肩袖損傷（rotator cuff tear，RCT）是導致肩關節疼痛、活動受限最常見的原因，嚴重影響患者的生活質量[1]。研究表明，RCT 的發病率可達13%～32%，與人的年齡增長密切相關[2]。盡管肩關節鏡手術的發展改善了RCT 修復的臨床療效，但術后腱-骨結合部難以恢復正常的組織結構，肩袖再次撕裂的發生率仍居高不下，如何促進腱-骨界面愈合、增加其生物學強度，一直是運動醫學的研究熱點[3]。Kartogenin（KGN）最早在骨關節炎軟骨修復研究中發現，是一種人工合成的低水溶性小分子雜環類化合物，具有誘導內源性間充質干細胞成軟骨分化的特性，且無需添加外源性種子細胞和支架，在再生醫學中具有廣闊的應用前景[4-6]。但目前有關KGN 促進RCT 中腱-骨愈合的研究尚不多見。因此，本研究通過纖維蛋白構建KGN 釋放體系，并通過小鼠RCT 修復模型探究KGN對腱-骨愈合的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取12 周齡雄性C57BL/6j 野生型小鼠72 只，體重25～30 g，購自廣東南模生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（粵）2022-0062。本研究經本院醫學倫理委員會審查通過（批準文號：DW20210325-53），所有動物實驗操作均遵循3R 原則。

1.2 主要試劑及儀器 KGN 粉劑（貨號：S765802）購自美國Sigma-Aldrich 公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（貨號：D8371）、蘇木素-伊紅染液（貨號：G1120）、阿爾新藍染液（貨號：G1560）、天狼星紅染液（貨號：G1472）均購自中國Solarbio 公司；纖維蛋白封閉劑（貨號：80FZ00M3-7）購自美國OMRIX Biopharmaceuticals 公司；Trizol 裂解液（貨號：15596-026）購自美國Invitrogen 公司；腱調蛋白（tenomodulin，TNMD）一抗（貨號：ab203676）、血小板衍生生長因子-AA（platelet-derived growth factor-AA，PDGFAA）一抗（貨號：ab203911）、Y 染色體性別決定區盒轉錄因子9（sexdeterming region of Y chromosome box transcription factor 9，SOX9）一抗（貨號：ab185966）、SP7 轉錄因子（SP7 transcription factor，SP7）一抗（貨號：ab22552）及兔二抗（貨號：ab6702）均購自英國Abcam 公司；PCR 引物由中國上海生工合成；Evo M-MLV 反轉錄試劑盒Ⅱ（貨號：AG11728）、Evo M-MLV 一步法qRT-PCR 試劑盒（貨號：AG11732）均購自中國Accurate Biology 公司。Waters2695 液相色譜儀購自美國Waters 公司；CKX31 級雙目生物顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；KR4i大容量冷凍離心機購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；Leica EM UC7 冷凍超薄切片機購自德國徠卡公司；ABI 7500實時熒光定量PCR 購自美國Applied Biosystems 公司。

1.3 KGN 釋放體系的構建和體外檢測 參考文獻[7]構建KGN 釋放體系。將250 mg KGN 溶解于16.7 μL DMSO 溶液，制成KGN 原液；將纖維蛋白封閉劑置于37 ℃水浴加熱10 min，使其充分融化；將上述16.7 μL KGN 原液加入233.3 μL 纖維蛋白封閉劑中，充分混勻，制成纖維蛋白-KGN 釋放體系。直接將不含KGN的16.7 μL DMSO 加入233.3 μL 的纖維蛋白封閉劑中，建立纖維蛋白空載體系作為對照。為了模擬體內環境中KGN 在纖維蛋白體系中的釋放情況，向制備好的纖維蛋白-KGN 釋放體系中加入凝血酶5 μL，形成凝膠狀的KGN 釋放體系，浸泡于含有10%FBS 的0.5 mL PBS 中，37 ℃搖床孵育，每24 h 更換1 次浸泡液，并用高效液相色譜法檢測KGN 體外釋放效率。

1.4 小鼠模型的構建及分組 采用隨機數字表法將小鼠分為KGN 組和對照組，每組36 只。構建肩袖損傷修復小鼠模型，每只小鼠均接受單側岡上肌腱分離和經骨修復，對照組在腱-骨修復部位應用纖維蛋白空載體系，KGN 組在腱-骨修復部位應用纖維蛋白-KGN 釋放體系。單側岡上肌修復術參考文獻[8]，具體操作如下：使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠；切開皮膚后，辨認并抬高肩峰，分離三角肌，暴露肩袖肌腱；分離岡上肌，雙縫線穿過岡上肌腱，然后將岡上肌從其在肱骨頭上的附著點分離，并使用解剖刀輕輕摩擦附著點；使用30G 針交叉鉆孔，穿過先前備好的縫線；在重新附著肌腱前，在腱-骨界面涂抹按照上述1.3 中的方法構建的250 μL 纖維蛋白-KGN 釋放體系（KGN 組）或250 μL 的纖維蛋白空載體系（對照組），等待10 s 使體系在體內凝血酶的作用下凝固，然后使用縫線固定KGN 釋放體系，通過在肱骨近端皮質橋上打結縫合肌腱；逐層關閉切口，皮下注射0.05 mg/kg 丁丙諾啡止痛。術后皮下注射抗生素3 d，籠養，期間保證小鼠可在飼養環境中自由活動，術后4 周使用CO2處死小鼠并進行后續檢測。

1.5 小鼠肩關節中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 mRNA相對表達水平檢測 采用qRT-PCR 法。小鼠處死后，解剖肩關節，取肌腱及周圍的骨和軟骨組織，加入Trizol裂解，并在液氮中超聲破碎組織。依次加入氯仿、異丙醇提取組織總RNA，并使用75%乙醇洗滌RNA 沉淀。使用反轉錄試劑盒合成cDNA，使用qRT-PCR 試劑盒檢測肌腱重塑和成熟基因。反應體系：2×SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL，共20 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min，隨后95 ℃5 s 變性，60 ℃30 s 擴增，共循環40 次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，使用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達水平。qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.6 小鼠肩關節TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 蛋白表達檢測 采用免疫組化染色。小鼠處死后解剖暴露肩部，去除多余組織，保留肱骨、肩胛骨、4 個相連的肩袖肌腱單位和喙肩弓，使用10%中性甲醛浸泡固定。依次使用乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，將蠟塊切成5～8 μm 的薄片，45 ℃烘干。將切片置于二甲苯中脫蠟，然后使用高濃度到低濃度的乙醇梯度復水。使用3%H2O2孵育5～10 min，5%山羊血清孵育10 min封閉抗原。分別滴加TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 一抗工作液孵育2 h，然后滴加兔二抗工作液孵育30 min。滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，按照1 mL PBS+50 μL DAB 顯色液A+50 μL DAB 顯色液B 充分混勻配制DAB 顯色劑工作液，滴加到切片上室溫顯色5～15 min。使用蒸餾水充分沖洗，蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片，鏡下觀察并采集影像。

1.7 小鼠肩關節組織學觀察 按照上述方法進行切片處理。采用HE 染色及阿爾新藍染色觀察纖維軟骨面積時，使用蘇木素染色10 min，蒸餾水洗去浮色后滴加伊紅染色1 min，蒸餾水沖洗后阿爾新藍染色10 min，沖洗、快速脫水、透明，中性樹膠封固，鏡下觀察并采集影像。采用天狼星紅染色觀察膠原纖維密度時，使用天狼星紅染色10 min 后，沖洗、快速脫水、透明，中性樹膠封固、鏡下觀察結果。

1.8 統計學處理 采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KGN 體外釋放結果 KGN-纖維蛋白體系中的KGN 可釋放5 d，以前3 天為主，可釋放（85.72±0.88）mg，占釋放體系中KGN 總量的34.29%，見表2；釋放量隨時間遞減，見圖1。

圖1 釋放體系中KGN 總量百分比隨時間變化的折線圖

表2 KGN 體外釋放實驗結果

2.2 KGN 對小鼠肩關節中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 mRNA 相對表達水平的影響 與對照組比較，KGN組小鼠肩關節中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 mRNA相對表達水平均上調，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖2。

圖2 兩組小鼠肩關節中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 mRNA 相對表達水平比較

2.3 KGN 對小鼠肩關節中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 蛋白表達的影響 與對照組比較，KGN 組小鼠腱-骨界面TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 蛋白表達增加，表明使用KGN 可上調腱-骨界面與肌腱、軟骨和骨重塑相關的關鍵蛋白在組織局部的表達，見圖3（插頁）。

2.4 KGN 對腱-骨愈合端膠原纖維和纖維軟骨生成的影響 術后4 周，HE 染色和阿爾新藍染色顯示，KGN組小鼠纖維軟骨面積較對照組減小，見圖4（插頁）；天狼星紅染色顯示，KGN 組小鼠膠原纖維密度較對照組增加，見圖5（插頁）。結果表明，KGN 的使用抑制腱-骨愈合端纖維軟骨的生成、促進膠原纖維的生成。

圖4 KGN 對小鼠腱-骨愈合端纖維軟骨生成的影響（A：對照組；B：KGN 組）

圖5 KGN 對小鼠腱-骨愈合端膠原纖維的影響（A：對照組；B：KGN 組）

3 討論

肩袖損傷修復后的腱-骨愈合對于臨床醫生和科研人員均具有一定的挑戰性。盡管已研發多種生物材料、器械和術式以促進腱-骨愈合，但患者愈合失敗的風險仍高達60%[9-10]。RCT 修復并非恢復生理狀態下的腱-骨連接，而是以一種瘢痕介導的方式愈合，從肌腱過渡到未鈣化的纖維軟骨，再到鈣化的纖維軟骨，最后過渡到骨[11]。因此，改善腱-骨愈合的主要目標為減少修復部位未成熟的纖維、血管和組織，并重建肌腱附著點。既往研究通過動物RCT 模型檢驗了多種生物學強化方法，但大多通過添加生長因子以加速或加強肩袖修復，如血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、轉化生長因子等，已被證實可改善小鼠或大鼠肩袖修復術后的組織學和生物力學特性[12-16]，但目前，該類方法的效果仍然有限。研究表明，KGN 可誘導間充質干細胞和肌腱干細胞向軟骨分化，因而具有保護軟骨、促進微骨折愈合、修補全層軟骨缺損的潛力[6，17]，這在RCT 修復的腱-骨愈合過程中至關重要。因此，本研究構建纖維蛋白-KGN 釋放體系，探究其促進肩袖損傷修復小鼠模型腱-骨愈合的作用及機制，以期通過KGN 的軟骨誘導能力，更好地恢復肩袖的生理結構、強度和功能。

本研究構建的纖維蛋白-KGN 釋放體系可釋放5 d，前3 天可釋放總量的34.29%，具有較高的釋放效率。在肩袖損傷修復小鼠模型中，將纖維蛋白-KGN釋放體系應用于腱-骨界面處，在4 周后修復的腱-骨界面的膠原纖維組織得到改善，KGN 可促進愈合處的結締組織微結構成熟。這與此前報道的注射KGN-富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）的兩項研究結果相一致[7，18]，研究發現KGN-PRP 組的肌腱移植物從骨隧道中的拔出強度顯著高于PRP 組和0.9%氯化鈉溶液對照組，KGN-PRP 注射治療的動物腱-骨界面有排列良好的膠原纖維和成熟的軟骨細胞，而PRP 和0.9%氯化鈉溶液處理的肌腱膠原纖維組織較少、軟骨細胞缺乏。與其他模型研究的結果一致，本研究發現應用KGN 可導致軟骨形成、肌腱調節和成骨相關的基因和蛋白表達增加，提示KGN 可能促進骨生成、血管生成和肌腱的重塑與成熟。

與既往研究相反[19-20]，本研究發現，在KGN 處理的肩袖修復中，阿爾新藍染色區域變小，纖維軟骨生成減少。造成這種差異的原因可能是：（1）本研究使用的模型不同于該研究使用的跟腱穿孔活檢模型，而是完全切斷岡上肌腱在肱骨上的附著，模擬了急性全層岡上肌撕裂，如果不進行手術修復，幾乎沒有內在的愈合能力，在固有愈合能力較低的組織中，可能需要KGN 刺激外源性祖細胞以實現軟骨生成，而跟腱具有更大的愈合潛力，因此修復部位有豐富的祖細胞[21]。（2）有證據表明，KGN 發揮治療作用的分子機制具有組織特異性，在關節軟骨中，KGN 可上轉化生長因子-β/Smads 通路的表達[22]，但在人真皮成纖維細胞中，KGN 通過激活Smad4/5 通路增加Ⅰ型膠原的合成[23]，對于KGN 在肩袖發揮作用的分子機制尚需進一步的深入探索。（3）在本研究中，組織切片染色顯示，與對照組相比，KGN 治療導致愈合末端的細胞密度略有下降，祖細胞數量的減少可能導致KGN 無法誘導形成軟骨樣組織。因此，計劃在接下來的研究中，進一步對KGN 促進RCT 修復后腱-骨愈合的分子通路進行挖掘，同時嘗試補充局部祖細胞，進一步促進KGN 對局部愈合的療效。

綜上所述，纖維蛋白負載KGN 可以促進肩袖損傷修復小鼠模型腱-骨愈合。應用KGN 可導致軟骨形成、肌腱調節和成骨相關的基因和蛋白表達增加，提示KGN 可能促進骨生成、血管生成和肌腱的重塑與成熟。KGN 的使用可促進腱-骨愈合端膠原纖維生成、抑制纖維軟骨的生成，關于其分子機制，有待于未來的研究進一步探索。