仙茅苔黑酚龍膽二糖苷調控NF-κB/Nrf2 通路抑制破骨細胞氧化應激及其骨吸收的研究

李鶴鳴，劉夢琴, ，虞艷瑋，沈 燚，杜金蔓，胡思婧，徐金龍，張泉龍，秦路平*，張巧艷*

1. 浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053

2. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350108

3. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六九醫院，內蒙古自治區 呼和浩特 010051

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種常見的老年性疾病，是參與骨代謝的成骨細胞的骨形成作用和破骨細胞（osteoclasts，OCs）的骨吸收作用失衡，導致骨量減少、骨組織微結構退化、骨脆性增加，以致易于發生骨折的骨骼疾病[1]。OCs 是唯一具有骨吸收功能的細胞，由骨髓單核細胞在巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和核因子-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的刺激下形成的多核細胞，其活性受絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的調控[2]。隨著機體的衰老，體內雌激素水平降低，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，導致氧化應激，造成OCs 活性增強，致使骨量減少和OP 的發生[3-4]。核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是調節機體氧化應激的關鍵機制[5]，激活OCs 的Nrf2 通路，增強其抗氧化能力，抑制其形成分化和骨吸收活性，可以減緩OP 的發生發展。目前，一些抗氧化劑如維生素E、維生素C，尤其是N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）被發現能夠作為ROS 清除劑抑制OCs 在骨形成作用中的負面影響[6]。而天然藥物含有豐富的抗氧化成分，從中尋找能夠抑制OCs 骨吸收的活性成分，研究其抑制OCs 形成分化的機制，可為中藥新產品的開發及臨床應用提供科學依據。

仙茅為石蒜科植物仙茅CurculigoorchioidesGaertn. 的干燥根莖[7]，含有酚苷、木脂素和環阿爾廷醇型三萜皂苷等多種結構類型的化學成分，具有補腎陽及與之相關的調節免疫、抗氧化、抗抑郁、保肝、保護心血管、抗骨質疏松及植物雌激素樣作用[8-9]，應用于二仙湯、黃芪三仙湯、調經促孕丸、更年安片、骨仙片、益氣固本片等多個中藥方劑和中成藥中，顯示出了良好的應用前景。仙茅酚苷類成分為其主要活性成分，具有良好的抗氧化以及抗骨質疏松作用[10]，其結構類型包括苯甲酸酯類酚苷如仙茅苷、仙茅苷乙；苔黑酚類酚苷如苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龍膽二糖苷；含氯苯酚衍生物類酚苷如仙茅素A[11-12]。課題組前期研究發現，仙茅苷能夠通過對抗氧化應激增加鐵超載和表達嵌合小鼠/人淀粉樣蛋白前體蛋白（Mo/HuAPP695swe）和突變人早老蛋白1（PS1-dE9）雙轉基因小鼠的骨形成[13-14]，并發現其通過對抗氧化應激抑制OCs 骨吸收的機制[15]。仙茅苷在《中國藥典》2020 年版規定的質量分數≥0.10%，而研究發現苔黑酚類酚苷在仙茅中質量分數高達1.0%[16]，也具有抗氧化和抗骨質疏松的作用[17]，但其深入的機制尚不清楚。苔黑酚龍膽二糖苷（orcinol gentiobioside，OGB）為仙茅中主要的苔黑酚類酚苷，其是否通過抗氧化發揮抗OP 作用值得進一步探討。因此，本研究以sRANKL 聯合H2O2誘導RAW264.7細胞分化的OCs 為模型，觀察OGB 對OCs 形成分化和骨吸收作用的影響，研究其通過NF-κB 和Nrf2通路減緩OCs 氧化應激和骨吸收的機制，以期為仙茅的臨床應用及資源開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 細胞

RAW264.7 細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 藥品與試劑

OGB（批號P23M10S84022，質量分數≥98%）、NAC（批號L17O9X7236，質量分數≥98%）、Nrf2抑制劑ML385（批號L17JD9L77422，質量分數≥98%）、NF-κB 抑制劑 BAY 11-7082（批號K10J10D92650，質量分數≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；重組小鼠可溶性核因子-κB 受體活化因子配基（soluble receptor activator of nuclear factor-κB ligand，sRANKL，批號0715612J1217）購自美國PeproTech 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco 公司；CCK-8 增殖檢測試劑盒（批號MA0218）購自大連美倫生物醫藥有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；4%多聚甲醛（批號XS185001）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；ROS 測定試劑盒（批號20200520）、鈣測定試劑盒（批號 20201121）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（gamma-glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS）測定試劑盒（批號20200529）、小鼠I 型膠原C 末端肽（cross-linked carboxy-terminal telopeptide of type I collagen，CTX-I）ELISA 試劑盒（批號20201130）、小鼠I 型前膠原氨基端前肽（procollagen type I intactNterminal propeptide，PINP）ELISA 試劑盒（批號20201130）、小鼠醌氧化還原酶 1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）ELISA 試劑盒（批號20200601）、小鼠血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）ELISA 試劑盒（批號20200601）、小鼠還原型輔酶 II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶1（NADPH oxidase 1，NOX1）ELISA 試劑盒（批號20200601）、小鼠NADPH 氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）ELISA試劑盒（批號20200601）購自南京建成生物工程研究所；組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）抗體（批號ab19027）、腫瘤壞死因子受體相關蛋白6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）抗體（批號ab33915）購自英國Abcam 公司；活化T-細胞核因子1（nuclear factor of activated T-cells，NFATc1）抗體、Nrf2 抗體、Kelch 樣ECH 關聯蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）抗體、磷酸化p65（p-p65）抗體、p65 抗體、山羊抗兔IgG二抗購自美國CST 公司（批號分別為8032、12721、8047、3033、8242、7074）；核因子-κB 抑制因子α（inhibitor of NF-κB-α，IκBα）抗體、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP9）抗體、c-Fos抗體（批號分別為BM3932、BA2202、BA0207-2）購自武漢博士德生物工程有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號AT0010）購自上海維景生物科技有限公司。

1.3 儀器

DMi1 型顯微鏡（德國Leica 公司）；Axio Imager 2 型正置顯微鏡、LSM880 型激光共聚焦顯微鏡（卡爾蔡司股份公司）；1510 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 H2O2 誘導OCs 模型的建立

將RAW264.7 細胞在含25 ng/mL sRANKL 的α-MEM 完全培養基中誘導36 h 后，再用含20 μmol/L H2O2的α-MEM 完全培養基繼續誘導36 h，即可得到H2O2誘導的OCs。

2.2 CCK-8 法檢測細胞活力

將RAW264.7 細胞接種于96 孔板中，貼壁過夜，用20 μmol/L NAC 以及不同劑量（0、1、5、10 μmol/L）的OGB 處理36 h，在給藥基礎上再加入20 μmol/L H2O2，并單獨設置H2O2組，繼續處理36 h，CCK-8 法檢測細胞活力。

2.3 TRAP 染色及活性測定

設置sRANKL 和H2O2誘導的OCs 模型組、NAC 處理的陽性藥組以及OGB（1、5、10 μmol/L）給藥組，給藥處理36 h 后，在給藥基礎上再加入20 μmol/L H2O2處理36 h，收集上清，按照課題組前期建立的方法[18]測定TRAP 活性，并按照試劑盒說明書進行TRAP 染色，顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 F-actin 環的免疫熒光染色

將RAW264.7 細胞接種于玻底細胞培養皿中，分組給藥處理24 h，再加入H2O2并給藥處理12 h，用PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛室溫固定30 min 后，采用鬼筆環肽和DAPI 對OCs 細胞核及F-actin 環進行免疫熒光染色，最后于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 ELISA 檢測OCs 骨吸收作用

將無菌的牛皮質骨切片置于96 孔板，然后將RAW264.7 細胞接種于板中，培養8 h 后分組給藥處理36 h，再加入H2O2并給藥處理36 h，按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中Ca2+、PINP、CTX-I 的含量。

2.6 ROS 水平檢測

以sRANKL 誘導RAW264.7 細胞得到的OCs為對照組，細胞分組處理后用PBS 清洗，每孔加入含10 μmol/L DCFH-DA 的無血清培養基，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗后，于485 nm 激發波長和528 nm 發射波長下檢測其熒光值。

2.7 NADPH 氧化酶及抗氧化酶活性測定

將sRANKL 誘導的RAW264.7 細胞分化的OCs分組給藥處理36 h，再加入H2O2并給藥處理24 h，PBS 清洗后低溫裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清并按照試劑盒說明書檢測NOX2、NOX4、HO-1、NQO1 和γ-GCS 活性。

2.8 Western blotting 檢測蛋白表達

設置對照組、模型組、給藥組以及ML385（5 μmol/L）或BAY 11-7082（1.5 μmol/L）處理的抑制劑組，分組處理后，收集并裂解細胞獲得蛋白，通過BCA 法測定總蛋白濃度，并定量為等濃度等體積的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min 使蛋白變性，蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，置于5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉2 h，分別加入c-Fos、CTSK、MMP9、NFATc1、TRAF6、IκBα、p-p65、p65、Nrf2、Keap1及GAPDH 抗體，于4 ℃孵育過夜后TBST 洗膜；加入二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜，用ECL 化學發光法進行顯影，采用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.9 p65 及Nrf2 免疫熒光染色

將RAW264.7 細胞接種于玻底細胞培養皿中，分組給藥處理48 h，再加入H2O2并給藥處理4 h，PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，繼續用PBS 清洗2 次，加入5%牛血清白蛋白于37 ℃封閉1 h，分別加入p65 和Nrf2 抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜，PBS 清洗2 次，加入熒光二抗室溫避光孵育30 min，PBS 清洗2 次后加入DAPI 室溫避光染色10 min，用PBS 清洗2 次后再加入200 μL PBS，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2.10 統計學分析

3 結果

3.1 OGB 對RAW264.7 細胞活力及H2O2 誘導的OCs 形成和分化的影響

如圖1-A 所示，與對照組比較，20 μmol/L NAC以及1、5、10 μmol/L OGB 處理36 h 后，在藥物處理的同時加入 20 μmol/L H2O2再處理 36 h，RAW264.7 細胞的活力均無明顯變化。TRAP 特異性地分布于OCs 中，如圖1-B、C、D 所示，NAC顯著減少TRAP 陽性細胞數量（P＜0.01），OGB 可劑量相關性地顯著降低OCs 的TRAP 活性（P＜0.05、0.01），減少TRAP 陽性細胞數目（P＜0.01），表明OGB 可顯著抑制OCs 的形成和分化。

圖1 OGB 對sRANKL 和H2O2 誘導的RAW264.7 細胞活力 (A)、TRAP 活性 (B)、TRAP 陽性細胞數 (C、D) 的影響(±s, n = 6)Fig.1 Effect of OGB on RAW264.7 cells activity (A), TRAP activity (B), number of TRAP positive cells (C, D) induced by sRANKL and H2O2 (±s, n = 6)

3.2 OGB 對H2O2誘導的OCs 的F-actin 環形成和骨吸收的影響

F-actin 環是OCs 發揮骨吸收功能的重要結構，如圖2-A 所示，H2O2誘導的OCs 的F-actin 環厚且完整，不同濃度的OGB 處理后，OCs 的F-actin 環變薄、缺失，甚至消失，表明OGB 可抑制OCs 的F-actin 構建。

圖2 OGB 對H2O2 誘導的OCs 的F-actin 環形成 (A) 及骨吸收活性 (B) 的影響 (±s, n = 4)Fig.2 Effect of OGB on construction of F-actin ring (A) and bone resorption activity (B) of OCs induced by H2O2(±s, n = 4)

OCs 能夠分泌骨基質降解酶，降解骨基質，釋放Ca2+以及膠原降解產物如CTX-I 和PINP，因此，培養OCs 的培養基中Ca2+及CTX-I 和PINP 的水平可用于表征其骨吸收活性。如圖2-B 所示，NAC 顯著降低培養基中Ca2+、CTX-I 和P1NP 的水平（P＜0.05、0.01）；OGB 能夠劑量相關性地顯著降低培養基中Ca2+的含量（P＜0.05、0.01），降低培養基中CTX-I 和P1NP 的水平（P＜0.05、0.01），顯示出顯著抑制OCs 骨吸收活性的作用。

3.3 OGB 對H2O2 誘導的OCs 骨吸收相關蛋白表達的影響

轉錄因子NFATc1 和c-Fos 介導OCs 的形成分化，促進骨吸收相關蛋白MMP9 和CTSK 的表達，使OCs 發揮骨吸收作用。如圖3 所示，與模型組比較，OGB 能夠顯著下調H2O2誘導的OCs 的c-Fos、CTSK 和MMP9 的表達（P＜0.05、0.01），但對NFATc1 的表達無顯著影響。

圖3 OGB 對H2O2 誘導的OCs 骨吸收相關蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Fig.3 Effect of OGB on expressions of bone resorption related proteins in OCs induced by H2O2 (±s, n = 3)

3.4 OGB 對H2O2 誘導的OCs 的ROS 水平及NADPH 氧化酶和抗氧化酶活性的影響

H2O2誘導增加OCs 的ROS 水平，促進OCs 的形成、分化和骨吸收活性。ROS 的產生由NADPH氧化酶調控，HO-1、NQO1、γ-GCS 等抗氧化酶可對抗ROS 對細胞產生的氧化應激。如圖4-A 所示，H2O2處理顯著增加OCs 內ROS 的水平（P＜0.05），NAC 和OGB 可顯著降低H2O2誘導的OCs 內ROS的水平（P＜0.05、0.01）。如圖4-B、C 所示，H2O2的誘導使OCs 的NOX4 活性顯著增加（P＜0.01），NAC 和高劑量的OGB 可以顯著抑制OCs 的NOX4活性（P＜0.05、0.01），但H2O2及NAC 和OGB 對OCs 的NOX2 活性均無明顯的影響。如圖4-D、E、F 所示，H2O2顯著降低OCs 內HO-1 和NQO1 的活性（P＜0.05、0.01），NAC 和OGB 處理后，HO-1、NQO1 的活性顯著增加（P＜0.05、0.01）；H2O2處理顯著增加OCs 的γ-GCS 活性（P＜0.01），相較模型組，NAC 和OGB 處理對OCs 的γ-GCS 活性沒有顯著的影響，表明OGB 可減緩H2O2引起的OCs氧化應激。

3.5 OGB 對H2O2誘導的OCs 中Nrf2 通路的調控作用

Nrf2 是調控氧化應激的關鍵轉錄因子。如圖5所示，OGB 能夠增加H2O2誘導的OCs 的Nrf2 表達（P＜0.05）及其核轉位，但對其Keap1 的表達沒有顯著的影響，Nrf2 通路抑制劑ML385 在一定程度上逆轉OGB 對OCs 的Nrf2 核轉位的促進作用，表明OGB 能夠通過激活Nrf2 通路減緩H2O2誘導的OCs 的氧化應激。

圖5 OGB 對H2O2 誘導的OCs 中Nrf2 通路 (A) 和Nrf2 核轉位 (B) 的調控作用 (±s, n = 3)Fig.5 Regulatory effect of OGB on Nrf2 pathway (A) and nucleus translocation of Nrf2 (B) in OCs induced by H2O2(±s, n = 3)

3.6 OGB 對H2O2誘導的OCs 中NF-κB 通路的調控作用

進一步研究了OGB 對H2O2誘導的OCs 中NFκB 通路的調控作用。如圖6 所示，OGB 能夠顯著抑制TRAF6 的募集（P＜0.05），降低IκBα 的降解（P＜0.05），抑制p65 的磷酸化（P＜0.05），阻止p65的入核，進而抑制NF-κB 通路的激活。當OGB 與NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082 聯用后，OGB 對IκBα 降解的抑制作用增強（P＜0.05），表明OGB 能夠通過抑制NF-κB 通路的激活，抑制OCs 的形成和分化。

圖6 OGB 對H2O2 誘導的OCs 中NF-κB 通路 (A) 和p65 核轉位 (B) 的調控作用 (±s, n = 3)Fig.6 Regulatory effect of OGB on NF-κB pathway (A) and nucleus translocation of p65 (B) in OCs induced by H2O2(±s, n = 3)

4 討論

雌激素缺失和衰老導致的機體氧化應激已被證實是OP 發生的關鍵因素[19]，減緩機體的氧化應激狀態成為調控骨代謝、減少骨丟失的新策略。抗氧化劑NAC 能夠阻止RANKL 介導的NF-κB、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）以及細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路的激活，抑制OCs 的形成分化[20]。許多中藥及天然化合物如白藜蘆醇、紅景天苷等也被證實能夠調控機體氧化應激，具有減少骨丟失的作用[6]。課題組前期發現仙茅酚苷類成分對去卵巢大鼠和快速老化小鼠的骨丟失具有確切的防治作用[17,21]，并可通過對抗氧化應激降低ROS 對成骨細胞功能的損傷作用和對OCs 功能的激活作用[22]，仙茅苔黑酚葡萄糖苷也被證實可通過與p38 結合，促進成骨細胞活性，減緩糖皮質激素所致OP 小鼠的骨丟失[23]。本研究進一步發現OGB 抑制氧化應激OCs 的形成分化和骨吸收的作用，并揭示了OGB 發揮這一作用的機制。

OCs 作為唯一進行骨吸收的功能細胞，其形成分化受轉錄因子NFATc1 和c-Fos 的調節[24]。OCs通過F-actin 環附著在骨基質上，分泌TRAP、MMP9和CTSK，降解骨礦物質和骨膠原，進行骨吸收[25]。研究發現，抗氧化劑NCA 以及OGB 可顯著減少H2O2誘導的OCs 的TRAP 活性及TRAP 陽性細胞的數目，抑制其轉錄因子c-Fos 的表達、F-actin 環的形成及骨基質降解酶MMP9 和CTSK 的活性，降低骨基質降解產物Ca2+、CTX-I 和PINP 的釋放，顯示出良好的抑制H2O2誘導的OCs 形成分化和骨吸收活性作用，與陽性藥NAC 相比，OGB 具有相同甚至更好的抗OP 作用。

氧化應激誘導OCs 的形成和分化。NADPH 氧化酶，如NOX1、NOX2 和NOX4 參與調控OCs 中ROS 產生，骨骼中過多的ROS 將直接增加OCs 活性[26]。氧化應激狀態下，ROS 激活的OCs 骨吸收作用是由轉錄因子Nrf2 調控的[27]，穩態條件下，Nrf2被細胞質中的Keap1 結合，進行泛素介導的降解，而氧化應激則導致Keap1 釋放，阻止了Nrf2 的降解，此時Nrf2 被激活并轉位到細胞核中，促進HO-1、NQO1、γ-GCS 和G6PD 等抗氧化基因的轉錄和表達，調節OCs 內ROS 水平，調控RANKL 依賴的OCs 形成和分化，減緩骨質的破壞[28]。研究發現，OGB 能夠降低H2O2誘導的OCs 中NOX4 水平，促進Nrf2 的表達和核轉位，進而提高抗氧化酶HO-1、NQO1 和γ-GCS 的水平，清除ROS，表明OGB可激活Nrf2 通路減緩OCs 的氧化應激。

氧化應激狀態下，ROS 還將作為第二信使激活OCs 的NF-κB 信號通路[29]。在OCs 分化和成熟的過程中，RANKL 和ROS 促進TRAF6 的募集，激活下游NF-κB 通路，IκB 被IκB 激酶復合物磷酸化并從三聚體解離，p65 表現出核轉位的活性，入核后誘導OCs 轉錄因子c-Fos 的表達，調節MMP9、CTSK 以及TRAP 的表達和活性，促使OCs 的骨吸收作用[30]。本研究證實OGB 能夠抑制氧化應激OCs的TRAF6 募集，抑制IκBα 的降解、p65 的磷酸化及其核轉位，表明OGB 可通過抑制H2O2誘導OCs的NF-κB 通路激活，抑制OCs 的形成分化和骨吸收作用。

綜上，本研究闡明了OGB 通過調節NF-κB 和Nrf2 通路減緩H2O2誘導的OCs 氧化應激和骨吸收的機制，結合前期文獻報道可為仙茅酚苷類成分的開發利用，以及仙茅防治OP 的臨床應用提供科學依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突