β淀粉樣蛋白受體PirB對小鼠星形膠質(zhì)細胞增殖及反應(yīng)性增生的影響

趙沅杰，拓振杰，尚培駿，楊錦雯，張曉華

1西安醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，陜西西安 710021；2廈門大學神經(jīng)科學研究所/福建省神經(jīng)退行性疾病及衰老研究重點實驗室，福建廈門 361005

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，以漸進性記憶障礙、失語、失用、人格行為改變等癥狀為主要表現(xiàn)[1‐3]。AD 病程緩慢，呈進行性發(fā)展，隨著患病時間增加，疾病嚴重程度也不斷加深[4‐5]。AD的典型病理特征主要為β淀粉樣蛋白(amyloid β，Aβ)沉積引起的細胞外老年斑、Tau蛋白過度磷酸化導致的神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)元突觸丟失和星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生等[4]。AD的發(fā)病機制尚不明確，也缺少有效的治療和預(yù)防手段。隨著人口老齡化的加重，AD逐漸成為威脅老年人身心健康的疾病之一[6]。星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛[7‐9]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷時常反應(yīng)性增生[7‐10]。反應(yīng)性增生的星形膠質(zhì)細胞可能對神經(jīng)元產(chǎn)生“保護”或“毒性”兩種不同效應(yīng)[9,11]，調(diào)節(jié)其增生過程可能成為治療AD的潛在路徑。成對免疫球蛋 白 樣 受 體B(paired immunoglobulin‐like receptor B，PirB)屬于I 型跨膜糖蛋白，是Aβ1‐42寡聚體的受體。既往研究顯示，PirB 可抑制神經(jīng)元軸突再生和樹突棘修剪[12]；PirB 過表達可在 LPS 誘導的大鼠腦內(nèi)炎癥中導致突觸減少，損害學習記憶功能[13]。上述研究提示PirB可能成為AD的潛在治療靶點，但其在星形膠質(zhì)細胞中的作用尚不清楚。本研究觀察PirB 對小鼠星形膠質(zhì)細胞增殖和反應(yīng)性增生的影響，旨在為探索PirB作為AD潛在治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 D‐Hanks 液(無Ca2+、無Mg2+)、甘氨酸溶液(G8200，北京索萊寶科技有限公司)；4%多聚甲醛(G1101‐500 ml，武漢賽維爾生物)；異丙醇溶液(天津天力化學試劑有限公司)；DEPC水(B501005‐0500，上海生工生物工程)；DMEM‐高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；DMEM/F12完全培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)；聚‐D‐賴氨酸氫溴酸鹽(PDL，美國Sigma‐Aldrich 公司)；兔抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP) 多 克 隆 抗 體(ab68428)、兔抗GFAP 單克隆抗體、山羊抗兔辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)抗體(英國Abcam 公司)；山羊抗兔Fluo488 抗體(SA00003‐1，美國Proteintech 公司)；4',6‐二脒基‐2‐苯基吲哚(DAPI)(BD5010，美國Bioworld 公司)；無水二甲亞砜(DMSO)(D2650‐100ml，美 國Sigma 公 司)；重 組 人Aβ1‐42、HFIP(AG968‐1MG)、化 學 發(fā) 光HRP 底 物(WBKLS0100)(美國Millipore 公司)；Trizol、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ、TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa qPCR 試劑盒(日本Takara公司)；EdU試劑盒[Cell‐Light EdU Apollo567 In Vitro Kit(100T)，廣州銳博生物]；0.1 ml 八連管(KG2541，美國Kirgen 公司)；10%磷酸酶抑制劑(4906845001，德國Roche 公司)；1%蛋白酶抑制劑(36978，美國賽默飛世爾科技公司)；RIPA裂解液(P0013B，上海碧云天)；H‐7650透射電子顯微鏡(日本日立公司)；eStain2.0蛋白快染儀(美 國GenScript 生 物 科 技 公 司)；RTCA 分 析 儀(xCElligence RTCA DP，杭州艾森生物)；SDS‐PAGE膠電泳(蛋白marker)、NanoDrop One(ND‐ONEC‐W)、PCR 儀 (Veriti96 PCR)、 Real‐Time PCR 儀(StepOnePlus) ( 美國賽默飛世爾科技公司)；ChemiDoc Touch 化 學 發(fā) 光 成 像 系 統(tǒng)(美 國Bio‐Rad公司)。

1.2 方法 選用小鼠星形膠質(zhì)細胞，采用PirB 抑制劑氟司必林(Fluspirilene)[14]或可溶性的PirB 胞外段PirBex(PEP)[15]抑制PirB與Aβ的結(jié)合，并采用慢病毒轉(zhuǎn)染純化的星形膠質(zhì)細胞、過表達PirB基因，觀察PirB對小鼠星形膠質(zhì)細胞增殖和反應(yīng)性增生的影響。本研究經(jīng)西安醫(yī)學院倫理審查委員會審核(20180309)。

1.2.1 細胞分組與給藥 將小鼠星形膠質(zhì)細胞分為對 照 組、 Aβ 組、 Aβ +0.2 μmol/L PEP 組、 Aβ+0.4 μmol/L PEP 組、Aβ+Fluspirilene 組、Aβ+GFP‐LV組和Aβ+mPirB‐LV 組。(1)Aβ 組，當細胞融合率達60%時給予2 μmol/L Aβ 處理。(2)Aβ+0.2 μmol/L PEP組、Aβ+0.4 μmol/L PEP 組和Aβ+Fluspirilene 組，分別在Aβ 給 藥 前1 h 加 入0.2、0.4 μmol/L 的PEP 或2 μmol/L Fluspirilene。(3)Aβ+GFP‐LV 組和Aβ+mPirB‐LV 組，當細胞融合率達到50%時將培養(yǎng)基換液至原來體積的一半，加入10 μl/ml 慢病毒進行轉(zhuǎn)染，4 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h 后加入2 μmol/L Aβ。(4)對照組給予相同體積的DMSO 處理。病毒為漢恒生物科技(上海)有限公司包裝，滴度為108TU/ml。

1.2.2 小鼠星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)、純化和傳代 原代星形膠質(zhì)細胞取自C57BL/6 新生小鼠的大腦皮層和海馬(出生24 h 以內(nèi))。培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細胞融合率達到90%后進行搖床純化。將細胞懸液接種于若干PDL包被的T25培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，傳代培養(yǎng)。采用GFAP 免疫熒光法鑒定小鼠星形膠質(zhì)細胞的純度。選 取10 個 視 野，采 用Image Pro Plus 軟 件 對GFAP和DAPI陽性細胞分別計數(shù)，計算細胞GFAP陽性率。

1.2.3 Aβ1‐42寡聚體的制備 將Aβ1‐42配成1 mmol/L的DMSO 溶 液。加 入0.01 mol/L PBS 緩 沖 液 制 成0.1 mmol/L Aβ1‐42儲存液。置于22 ℃孵育16 h，4 ℃孵育24 h，12 000 r/min 離心10 min，取上清即為Aβ儲備液。儲備液分裝凍存于-20 ℃。BCA 法定量并在透射電鏡下觀察。Aβ1‐42寡聚體采用非變性SDS‐PAGE 膠電泳，eStain2.0 蛋白快染儀進行考馬斯亮藍染色。

1.2.4 PirB 胞外段原核表達與純化 (1) PirB 胞外段基因擴增及引物設(shè)計。采用PAS(PCR‐based Accurate Synthesis)方法，根據(jù)PirB 胞外段序列(mPirB)設(shè)計全長拼接引物，正義序列：5'‐ATCGCCGAAAGGCACA CTTA‐3'；反義序列：5'‐GCAGGGATCTTAGATTCT GTGCT‐3'。引物序列由西安邁博睿生物技術(shù)有限公司合成。(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。使用兩個限制性內(nèi)切酶對NdeⅠ(酶切位點CATATG)和Hind Ⅲ(酶切位點AAGCTT)分別對pCZN1載體和PCR回收產(chǎn)物進行酶切處理。(3)重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。(4)IPTG 誘導重組菌融合蛋白的表達。(5)包涵體蛋白的變性。(6)融合蛋白的Ni柱親和純化。

1.2.5 RTCA 實驗檢測細胞生長率 取10 μl 細胞懸液進行細胞計數(shù)，并按照1∶1.5 接種于16 孔板(每孔約2000 個細胞)，置于RTCA 分析儀內(nèi)。18 h 后，細胞給藥處理，置于RTCA 儀內(nèi)繼續(xù)檢測細胞生長情況。

1.2.6 EdU 檢測細胞增殖情況 采用EdU 試劑盒檢測細胞增殖情況。隨機選擇熒光顯微鏡下10 個視野，計算EdU 陽性細胞率。EdU 陽性細胞率(%)=EdU 陽性細胞數(shù)/Hoechst33342 標記的總細胞數(shù)×100%。

1.2.7 Real‐time PCR 檢 測S‐100 鈣 結(jié) 合 蛋 白B(S‐100β)、波形蛋白(vimentin)、巢蛋白(nestin)、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的mRNA表達水平 Trizol 法提細胞RNA。用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用TaKaRa qPCR試劑盒進行擴增。以小鼠GAPDH為內(nèi)參，引物及引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.2.8 Western blotting 檢測小鼠星形膠質(zhì)細胞 GFAP蛋白表達水平 細胞給藥后48 h 提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。以肌動蛋白(β‐actin)為內(nèi)參蛋白。配置SDS‐PAGE 膠，12%分離膠，5%濃縮膠，每個梳孔上20 μg蛋白樣品，80 V電泳30 min，110 V電泳1.5～2.0 h。恒流180 mA濕轉(zhuǎn)120 min。5%脫脂奶粉封閉60 min。采用兔抗GFAP多克隆抗體 4℃孵育過夜。次日，37 ℃孵育30 min。1×TBST 溶液漂洗3 次，每次10 min。采用山羊抗兔HRP 抗體室溫搖床孵育2 h。1×TBST 溶液漂洗3 次，每次10 min。最后加入Immobilon Western 化學發(fā)光HRP 底物反應(yīng)液進行化學發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD‐t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠星形膠質(zhì)細胞形態(tài)觀察 在光學顯微鏡下觀察培養(yǎng)的小鼠原代(P0)和P1代星形膠質(zhì)細胞，P0代星形膠質(zhì)細胞胞體呈多邊形或三角形，胞體呈暗背景，周圍有光暈。相較原代細胞，P1代星形膠質(zhì)細胞胞體扁平，分枝明顯，細胞之間建立了更加密切的聯(lián)系(圖1)。

2.2 小鼠星形膠質(zhì)細胞純度鑒定 免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，小鼠顯形膠質(zhì)細胞GFAP 陽性率＞98%(圖2)。

圖2 免疫熒光法檢測小鼠星形膠質(zhì)細胞GFAP陽性率Fig.2 Immunofluorescence assay for GFAP positive rate of mouse astrocytes

2.3 Aβ1‐42寡聚體形態(tài)觀察和分子量驗證 電鏡下觀察結(jié)果顯示，大部分Aβ1‐42寡聚體直徑＜100 nm(圖3)。采用梯度SDS‐PAGE 膠對Aβ1‐42寡聚體進行電泳、考馬斯亮藍染色和脫色處理，最終得到清晰的藍色條帶(圖4)。大部分Aβ1‐42寡聚體分子量為50～75 kD，少部分＞75 kD。

圖3 Aβ1‐42寡聚體電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy observation of Aβ1‐42 oligomer

圖4 Aβ1‐42寡聚體蛋白電泳后考馬斯亮藍染色Fig.4 Coomassie blue staining of Aβ1‐42 oligomer protein

2.4 PirB 胞外段原核表達與蛋白純化 為得到大量的目的蛋白，將編碼PirB 胞外段蛋白的核酸序列導入大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行原核表達、純化和鑒定。經(jīng)SDS‐PAGE 電泳分析和Western blotting 檢測，PirB胞外段蛋白分子量為69.9 kD，與其理論分子量一致(圖5)。

圖5 PirB胞外段蛋白的原核表達、純化與鑒定Fig.5 Prokaryotic expression, purification and identification of PirB extracellular protein

2.5 PEP 對小鼠星形膠質(zhì)細胞生長速率的影響 采用RTCA 法72 h 實時監(jiān)測星形膠質(zhì)細胞標準化細胞指數(shù)(normalized cell index，NCI)值。18 h 時分別給藥，給藥后的起始階段，各組的NCI值表現(xiàn)為驟降，再逐步升高；隨著細胞孵育時間增加，細胞的增殖曲線趨于平穩(wěn)(圖6)。

圖6 PEP 對給予Aβ 的小鼠星形膠質(zhì)細胞增殖影響的RTCA檢測結(jié)果Fig.6 RTCA detection of the effect of PEP on the proliferation of mouse astrocytes given Aβ

2.6 不同藥物處理對星形膠質(zhì)細胞增殖的影響 EdU染色法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Aβ組細胞增殖活性明顯增強(P＜0.05)；與Aβ 組比較，Aβ+0.2 μmol/L PEP 組(P=0.0037)、Aβ+0.4 μmol/L PEP 組(P=0.0002)和Aβ+Fluspirilene 組(P=0.0021)細胞增殖活性均明顯降低(P＜0.01或P＜0.001，圖7)。

圖7 不同給藥情況下小鼠星形膠質(zhì)細胞增殖的EdU檢測結(jié)果Fig.7 Proliferation of mouse astrocytes detected by EdU under different drug conditions

2.7 各組小鼠星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生相關(guān)基因GFAP、S-100β、Vimentin、Nestin、APP表達水平比較 Real‐time PCR 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Aβ 組GFAP(P=0.0060)、S-100β(P=0.0339)、Vimentin(P=0.0282)、Nestin(P=0.0004)、APP(P=0.0080)和PirB(P=0.0091)mRNA 相對表達量均明顯增高；與Aβ 組比較，Aβ+0.4 μmol/L PEP 組GFAP(P=0.0084)、S-100β(P=0.0024)、Vimentin(P=0.0064)、Nestin(P=0.0014)、APP(P=0.0012)和PirB(P=0.0239)mRNA 相對表達量均明顯下降(圖8)。

圖8 各組小鼠星形膠質(zhì)細胞GFAP、S-100β、Vimentin、Nestin、APP、PirB的mRNA表達水平比較(Real‐time PCR)Fig.8 Comparison of mRNA levels of GFAP, S-100β, Vimentin, Nestin, APP and PirB in each group of mouse astrocytes (Real‐time PCR)

與Aβ+GFP‐LV 組比較，Aβ+mPirB‐LV 組GFAP(P=0.0015)、S-100β(P=0.0043)、Vimentin(P=0.0003)、Nestin(P=0.0374)、APP(P=0.0424) 和PirB(P＜0.0001)mRNA相對表達量均明顯增高(圖8)。

2.8 PirB 對小鼠星形膠質(zhì)細胞 GFAP 蛋白表達的影響 Western‐blotting 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Aβ 組GFAP 表達明顯增高(P＜0.05)；與Aβ 組比較，Aβ+0.4 μmol/L PEP 組GFAP 表達明顯下降(P＜0.05，圖9)。

圖9 各組小鼠星形膠質(zhì)細胞GFAP表達水平比較(Western blotting)Fig.9 Comparison of GFAP expression in each group of mouse astrocytes (Western blotting)

3 討 論

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣、數(shù)量多、高度分化的細胞，對神經(jīng)系統(tǒng)正常功能起重要作用，包括參與突觸傳遞、維持血腦屏障的穩(wěn)定性、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和離子緩沖等[7‐9]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷時星形膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生一系列變化，表現(xiàn)為細胞胞體變肥大，周圍突起增多、延展、胞漿豐富，細胞生長率顯著提高，這一過程即為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生[10]。神經(jīng)炎癥和缺血會誘導出兩種不同類型的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，分別稱為A1 型和A2型[9,11]。A1 型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞分泌炎性因子，如白細胞介素(interleukin，IL)‐1α、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和補體C1q，對神經(jīng)突觸有破壞作用，可誘導神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞死亡；而A2反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞可分泌抗炎性的神經(jīng)營養(yǎng)因 子， 如 腦 源 性 神 經(jīng) 營 養(yǎng) 因 子(brain‐derived neurotrophic factor，BDNF)、神 經(jīng) 生 長 因 子(nerve growth factor，NGF)和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcellline‐derived neurotrophic factor，GDNF)，對神經(jīng)元的存活和生長有促進作用[16‐18]。但近期也有研究指出，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞很難通過簡單的二元表型來描述，其可能根據(jù)不同的外界環(huán)境擁有多種狀態(tài)[19]。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞的“保護”和“毒性”兩種不同的效應(yīng)，往往與其分泌的物質(zhì)有密切關(guān)系，如何調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生使之對疾病治療有益至關(guān)重要[20]。

星形膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)的重要標志是GFAP 高表達[9,19,21]，同時，細胞中其他蛋白質(zhì)(如S‐100β、Vimentin、Nestin、APP 等)的表達也有所改變[18,22]。S‐100β 是重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，S‐100β 陽性的星形膠質(zhì)細胞常聚集于神經(jīng)炎癥斑塊周圍，參與AD病理過程的發(fā)展。作為重要的中間絲蛋白，GFAP、Vimentin、Nestin 上調(diào)均是反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增生的重要表現(xiàn)[10,16,23]。有研究顯示，星形膠質(zhì)細胞能合成和分泌大量Aβ，是AD淀粉樣斑塊的重要組成部分[24]。此外，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞中合成Aβ的3種成分增加：淀粉樣蛋白‐β 前體蛋白(AβPP)、β 分泌酶(β‐secretase)和γ 分 泌 酶[25‐26]。APP 是 一 種 跨 膜 蛋白[27]，在AD 中其被β 分泌酶和γ 分泌酶水解產(chǎn)生Aβ，主要包括可溶性Aβ1‐40和不可溶性Aβ1‐42兩種類型[28]，其中Aβ1‐42可促進具有神經(jīng)毒性的Aβ1‐42寡聚體形成[29]。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理發(fā)展，有研究顯示，在AD中，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量的增加程度與記憶和認知功能的減弱程度有關(guān)，是神經(jīng)斑塊的重要組成部分[25]。ALzData 數(shù) 據(jù) 庫 查 閱 結(jié) 果 顯 示，GFAP、S‐100β、Vimentin、Nestin、APP 等星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性相關(guān)標志物在AD患者大腦內(nèi)嗅皮層、海馬、額葉皮層和顳葉皮層中的表達量較健康對照高。因此，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性相關(guān)標志物的表達可能是治療AD的潛在方法。尋找星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生標志物的上游分子非常關(guān)鍵。

PirB 及其人類直系同源蛋白白細胞免疫球蛋白樣 受 體B2(leukocyte immunoglobulin‐like receptor B2，LilrB2)均是Aβ1‐42寡聚體的受體，二者功能相似，具有高度的序列同源性，且在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中均有表達[30‐33]。PirB 蛋白屬于I 型跨膜糖蛋白，包含由6 個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(D1－D6)的胞外段、1個疏水的跨膜段、3個免疫受體酪氨酸依賴的抑制序 列(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motifs，ITIMs)和1個ITIMs樣序列組成的胞內(nèi)段。以往研究顯示PirB 可抑制神經(jīng)元軸突再生和樹突棘修剪[34]，參與神經(jīng)元突觸可塑性調(diào)節(jié)，且可抑制神經(jīng)干細胞再生和分化[35]。PirB 過表達可能在LPS 誘導的腦內(nèi)炎癥中導致突觸丟失，學習記憶功能受損[36]，提示PirB可能是AD的潛在靶點。目前PirB在星形膠質(zhì)細胞中的作用尚不清楚，筆者推測Aβ可能作用于星形膠質(zhì)細胞上的PirB 受體，進而調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生相關(guān)標志物的表達。本研究通過離體實驗觀察Aβ受體PirB對星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生和增殖的影響。結(jié)果顯示，小鼠星形膠質(zhì)細胞的Aβ 受體PirB 能夠調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生，給予星形膠質(zhì)細胞PirB 可溶性胞外段PEP 或PirB 抑制劑Fluspirilene 處理，能夠抑制Aβ 誘導的星形膠質(zhì)細胞增殖和反應(yīng)性增生；相反，在星形膠質(zhì)細胞過表達PirB基因后給予Aβ處理，星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性增生明顯增強。

星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生是AD重要的病理學特征[35]。在病理狀態(tài)下，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞過度增生，會在損傷部位形成膠質(zhì)瘢痕，抑制軸突再生，阻礙神經(jīng)元形態(tài)和功能的修復(fù)；釋放大量炎性因子，加重炎癥反應(yīng)，進一步損傷軸突；降低谷氨酸轉(zhuǎn)運體活性，谷氨酸鹽加重神經(jīng)元毒性，促進神經(jīng)元壞死[16,36‐37]。本研究采用Aβ1‐42寡聚體處理小鼠星形膠質(zhì)細胞，在體外構(gòu)建星形膠質(zhì)細胞AD 模型；Aβ 的分子量為4514.2 D，根據(jù)圖4中條帶分子量大小，筆者認為所制備的Aβ1‐42寡聚體主要為十四聚體或十五聚體。本研究結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)反應(yīng)性增生現(xiàn)象，表現(xiàn)為細胞生長率增高，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生相關(guān)標志物表達量上升。GFAP是星形膠質(zhì)細胞重要的中間絲蛋白[38‐39]，S‐100β 參與星形膠質(zhì)細胞增殖過程，二者是星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生常用的標志物。有研究顯示，S‐100β 表達陽性的細胞在炎癥斑塊周圍聚集，密度較高，與AD的病理過程關(guān)系密切[40]。在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞中APP 的表達量也處于較高水平[41]。本研究結(jié)果顯示，Aβ處理后星形膠質(zhì)細胞GFAP、S-100β、Vimentin、Nestin、APP表達均增高，且細胞增殖增強；提示星形膠質(zhì)細胞過表達PirB基因后，與反應(yīng)性增生相關(guān)的基因表達活躍。綜上可以推測，Aβ受體PirB能夠調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性增生相關(guān)標志物的表達，抑制PirB受體可能抑制星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性增生。

PirB 與其人類同源物LilrB2 是Aβ 的受體，表達于神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞中，調(diào)節(jié)損傷后突觸可塑性，包括抑制軸突再生和樹突棘修剪[28,30,42]。樹突棘是神經(jīng)元間形成突觸連接的部位，代表可塑性位點，敲除PirB可顯著增加視覺皮層樹突棘的穩(wěn)定性和密度，促進長時程增強(long‐term potentiation，LTP)，控制長時程抑制(long‐term depression，LTD)，提示PirB參與調(diào)節(jié)突觸可塑性[42‐43]。另有研究顯示，髓磷脂相關(guān)抑制劑 包括Nogo‐A、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)和少突膠質(zhì)細胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)，可通過PirB 受體抑制神經(jīng)元軸突的再生[28,44‐48]；PirB 還可通過PI3K/Akt/mTOR 通路對軸突的生長產(chǎn)生抑制作用[47]。PirB 拮抗劑Fluspirilene 能夠降低神經(jīng)元凋亡，可溶性PirB 胞外段PEP 能夠透過血腦屏障促進神經(jīng)再生，增強小鼠的記憶能力[33‐34]；但星形膠質(zhì)細胞上的PirB 受體的作用尚不清楚。本研究采用PEP 或Fluspirilene抑制星形膠質(zhì)細胞的PirB受體，觀察星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生和增殖的變化，結(jié)果顯示，當采用PEP抑制Aβ與內(nèi)源性PirB蛋白結(jié)合時，星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生相關(guān)標志物GFAP、S-100β、Vimentin、Nestin及APP的表達量均下降；而當過表達PirB基因時，星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生相關(guān)標志物的表達量顯著上升。這提示 PirB 能夠促進星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生。RTCA和EdU檢測顯示，PirB能夠調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的增殖，抑制PirB 時星形膠質(zhì)細胞增殖和生長率顯著降低。這提示PirB 能夠促進星形膠質(zhì)細胞增殖和反應(yīng)性增生，從而加重AD的病理學癥狀。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，PirB 與反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生和增殖密切相關(guān)，可作為進一步探究AD發(fā)生機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；PirB是調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生和增殖的上游分子，抑制PirB 能夠抑制Aβ引起的星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生和增殖，可作為AD治療的潛在靶點。由于本研究僅在細胞層面進行了觀察，在AD動物模型中，PirB是否能夠調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生尚不清楚，后續(xù)可在APP/PS1AD 動物模型中檢測敲除或過表達PirB對星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生及AD相關(guān)病理學癥狀的影響。